Summary
Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito. Este
Abstract
Os avanços nas técnicas de microfabricação permitiram a produção de baixo custo e reprodutível sistemas microfluídicos para a realização de experiências biológicas e bioquímicas no 1,2 micro e nanoescala. Além disso, microfluídica também têm sido usados especificamente para analisar quantitativamente processos hematológicas e microvascular, devido à sua capacidade para controlar facilmente o ambiente dinâmico fluídica e condições biológicas 3-6. Como tal, os investigadores têm utilizado sistemas mais recentemente microfluídicos para estudar deformabilidade de células do sangue, a agregação de células sanguíneas, o fluxo sanguíneo microvascular, e sangue interacções célula-célula endotelial 6-13. No entanto, estes sistemas microfluídicos quer não incluem células endoteliais cultivadas ou eram maiores do que a correspondente sizescale para microvasculares processos patológicos. Uma plataforma microfluídica com cultura de células endoteliais que recapitula com precisão o celular, físico e hemodynambiente âmico da microcirculação é necessário para promover nossa compreensão da fisiopatologia subjacente biofísico de doenças hematológicas que envolvem a microvasculatura.
Aqui, apresentamos um método para criar uma "endothelialized" modelo in vitro da microvasculatura, usando um processo simples de microfabricação única máscara em conjunto com as técnicas de cultura de células endoteliais, estudar as interações patológicas microvasculares biofísicos que ocorrem na doença hematológica. Este "microvasculatura-on-a-chip", prevê o pesquisador, com um teor robusto que controla rigidamente biológica, bem como condições biofísicas e é operado através de uma bomba de seringa padrão e de campo claro / microscopia de fluorescência. Parâmetros como condições hemodinâmicas da microcirculação, tipo de célula endotelial, o tipo de células sanguíneas (s) e concentração (s), drogas / concentração inibitória etc, tudo pode ser facilmente controlada. Como tal, a nossa microsistema forneceum método para investigar quantitativamente processos de doença no qual o fluxo microvascular é prejudicada devido a alterações na adesão celular, agregação e deformação, uma capacidade disponível com os ensaios existentes.
Protocol
1. Fabricação de microdispositivos o endotelial
- Criar um fotomáscara enviando um desenho assistido por computador (CAD) do dispositivo micro a um fornecedor máscara fora. A máscara utilizada foi composta de uma camada de cromo em refrigerante de vidro de cal. Neste caso, a largura do canal microfluídico foi de 30 uM.
- Limpar uma bolacha de silício nu com piranha (10:1 proporção de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogénio) durante 15 minutos e mergulhar em ácido fluorídrico por 30 segundos. Lavar com água desionizada (DI) durante aproximadamente 10 segundos.
- Utilizando um revestidor de rotação, de spin Microchem SU-8 2025 fotorresiste sobre a bolacha de uma altura de 30 mm. Para SU-8 2025, uma velocidade de centrifugação de 3000 rpm é recomendada. Outros viscosidades de SU-8 estão disponíveis, que irá atingir esta altura. As instruções completas para SU-8 uso estão disponíveis em www.microchem.com
- Coloque a bolacha com SU-8 sobre uma placa de aquecimento a 95 ° C durante5 minutos para expulsar o excesso de solvente.
Nota: Um forno irá secar a bolacha de modo diferente do que uma placa de aquecimento e não é recomendada. - Colocar uma máscara com a forma característica desejada sobre a bolacha, e expor à luz UV (160 mJ / cm 2 medido a 365 nm) em um alinhador de máscara (Karl Suss, MA-6). Esta cruz liga o fotorresiste.
- Coloque a bolacha de volta numa placa de aquecimento a 95 ° C durante um período adicional de 5 minutos para acelerar ainda mais a polimerização de SU-8.
- Mergulha-se o bolacha em SU-8 Developer, composto principalmente por PGMEA (propileno glicol metil éter acetato) durante 4 minutos para remover o não-reticulado SU-8.
- Lavar a bolacha recentemente desenvolvido com 100% de álcool isopropílico (IPA) durante 10 s. A bolacha pode então ser seca usando azoto pressurizado ou permitindo a evaporação do solvente da bolacha em uma capa limpa fumos durante vários minutos.
- Fita as bordas da bolacha seca com modelado SU-8 em um prato de petri de prédesabafar movimento.
- Aplicar 1 mL de Sigmacote para a bolacha utilizando uma pipeta, a tampa com o topo da placa de petri, e bolacha redemoinho para assegurar um revestimento completo da bolacha, remover cobrir, e permitir que bolacha para secar durante vários minutos até todo o solvente se ter evaporado.
2. PDMS Preparação (polidimetilsiloxano)
- Mistura PDMS polímero e agente de cura numa proporção 10:1 (w / w) e remover as bolhas de ar, utilizando um exsicador de vácuo. O período de tempo necessário para desgaseificar a PDMS varia com a força do sistema de vácuo disponível, mas tipicamente varia desde alguns minutos a uma hora. Para uma placa de Petri seis polegadas com nenhuma PDMS anteriormente vertida, num volume total de 60 mL de polímero é recomendada.
- Despeje a mistura sobre a bolacha, a cerca de 5 mm de espessura. Deita-se também um prato de fundo plano para criar uma folha fina de PDMS, cerca de 1 mm de espessura. Curar a 60 ° C num forno durante a noite.
- Usando uma faca ou bisturi, cortar ao redor do cured dispositivo PDMS e removê-lo a partir da bolacha. Além disso, cortado de uma folha fina de PDMS ligeiramente maior do que o dispositivo.
- Criar entrada e de saída furos no dispositivo PDMS utilizando um furador de 1,0 mm. Isto pode ser conseguido usando um vice-um pino, o dispositivo de Harris Uni-Core, ou similar.
- Limpar as superfícies do dispositivo ea folha usando fita adesiva.
- Usando um limpador de plasma, expor as superfícies do dispositivo PDMS e folha de PDMS ao plasma de oxigénio durante 30 s. O plasma de oxigénio cria espécies reactivas na superfície exposta do PDMS que se ligam quando postos em contacto físico.
- Ligue menor tubagem com um comprimento pequeno (vários centímetros) de tubo de grande, o que por sua vez está ligado a uma seringa com uma agulha romba de ponto, preenchido com 50 fibronectina ug / ml de plasma humano em PBS. A tubagem e da agulha são dimensionados de tal modo que um encaixe de fricção é criado entre o tubo. Insira menor a tubagem para a entrada do PDMS microdispositivo e umplicar pressão para a seringa para encher completamente os canais com uma solução de fibronectina e para criar uma queda de 100 uL pequena na porta de saída, para assegurar que os canais de ficar molhado. Incubar o dispositivo a 37 ° C durante 40-60 min.
- Conecte uma seringa cheia de PBS fresca para a agulha de ponto cego. Aplicar pressão para a seringa para enxaguar o dispositivo com PBS.
3. Semeando a dispositivos microfluídicos com células endoteliais
- Preparar 1.000.000 células / ml de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em meios de crescimento endotelial com dextrano 8%. Uma gama de 500.000 a 2.000.000 células / ml foi utilizado com sucesso. A adição de dextrano ao meio de carga célula aumenta a viscosidade do fluido, o que diminui a velocidade de células endoteliais como eles entram no sistema fibronectina revestido microfluídicos. Isto, por sua vez, aumenta a probabilidade de que as células irá aderir e cultura com sucesso dentro do microdispositivo.
- CONECTE a nova seringa e tubagem como no Passo 2,7. mas com um tempo mais tubagem (aproximadamente 1 metro de comprimento).
- Para optimizar o desempenho do presente sistema, é crítica neste ponto para evitar qualquer fuga ou bolhas em todo o sistema de perfusão; qualquer fuga de solução ou a presença de bolhas nos meios de comunicação irá alterar o fluxo e evitar a semeadura bem sucedida de células endoteliais. Portanto, apertadas do tubo é essencial para eliminar vazamentos entre as conexões. Bolhas na seringa e / ou da tubagem devem ser eliminadas antes células são introduzidas no microdispositivo e todo o sistema de perfusão devem ser preparadas com a solução de células antes de prender o tubo à microfluídico para evitar a introdução de bolhas de ar.
- Utilizando uma bomba de seringa, infundir suspensão de células em PDMS dispositivo a uma taxa de fluxo volumétrica de 1,23 ul / min durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Óptimos resultados foram obtidos quando a bomba de seringa estava no mesma altura que o dispositivo de PDMS. Para a entrada, o mais tubos, que pode ser enrolada dentro da incubadora, assegura que as células e meios de comunicação estão adequadamente aquecido antes de entrar em contacto com o dispositivo. No nosso sistema, a taxa de fluxo volumétrica de 1,23 ul / min aproxima uma velocidade midstream de ~ 1 mm / s nos menores microcanais, correspondendo a uma tensão de cisalhamento de parede de ~ 1 dine / cm 2 a esses canais utilizando sangue total.
- Usando a bomba de seringa mesmo e tubagem de comprimento, perfundir meios de crescimento fresco para 2-8 dias à razão de 1,23 ul / min. Um dispositivo de sucesso terá uma monocamada de células endoteliais que crescem no interior do dispositivo dentro de 24-48 horas. As experiências anteriores demonstram que monocamadas confluentes apropriadamente expressar VE caderina-a célula-célula junções em todo o dispositivo 14.
- Injectar sangue ou suspensão de células no sistema para a experimentação.
4. Os resultados representativos
_content "> Usando este protocolo, técnicas padrão de microfabricação litográficas são usados para criar o molde necessária para produzir os canais microfluídicos que imitam a fisiologicamente sizescale da microvasculatura (Figura 1A). Usando uma técnica de perfusão optimizado, as células endoteliais, em seguida, a cultura de sementes e confluently o superfície interna inteira do sistema microfluídico dentro de 24-48 horas de semeadura de células (Figura 1B). Como o sistema microfluídico é transparente, o microdispositivo inteiro pode ser colocado sobre um campo claro / etapa microscópio de fluorescência para imagiologia e recolha de dados.O nosso sistema pode então ser aplicado para estudar doenças hematológicas que envolvem alteradas as propriedades biofísicas, tais como a doença de células falciformes, em que o aumento da rigidez falciformes células vermelhas e adesão de leucócitos e endotelial aberrante contribuir para a obstrução microvascular. Um medicamento aprovado clinicamente, hidroxiuréia, melhora sintomas, mas a sua direct efeito sobre o fluxo microvascular é desconhecida. Nosso ensaio leva em conta tanto a rigidez e adesão celular, e demonstra que hidroxiureia significativamente melhora o fluxo na doença de células falciformes (Figura 2).
A doença falciforme é apenas um exemplo de uma aplicação para a microvasculatura-on-a-chip, como este sistema é ideal para estudar qualquer processo hematológica em que as células do sangue interagem uns com os outros e as células endoteliais da microvasculatura. Outras aplicações clinicamente relevantes incluem distúrbios inflamatórios, sepse / lesão pulmonar, microangiopatias trombóticas, malária e metástase de câncer, enquanto aplicações mais básicas incluem a biologia de leucócitos e da biologia de células estaminais hematopoiéticas, entre muitos outros.
Figura 1. A) o PDMS inicial dispositivo micro antes endotelização. Aqui, o microdispositivo é injetado a sagacidadeh corante alimentar para ilustrar desenho sizescale e global do sistema. B) microscopia de campo claro mostra o sistema de microfluídico é completamente endothelialized dentro de 48 horas de semeadura célula utilizando o protocolo aqui descrito.
Figura 2. A) A microvasculatura-em-um-chip com microcanais aproxima do tamanho de vénulas pós-capilares (30 mm), o local da maioria das células falciformes eventos obstrutivos microvasculares. Sangue total de pacientes com anemia falciforme que receberam hidroxiuréia e de pacientes que não receberam hidroxiuréia flui através de dois diferentes microvasculatura-on-a-chip dispositivos. B) O sangue total de pacientes com anemia falciforme que recebem fluxos de hidroxiureia com relativa facilidade dentro dos microcanais endothelialized. C) Sob as mesmas condições hemodinâmicas, o sangue total a partir de pacientes com anemia falciforme que não recebem hidroxiureia, no entanto, apresenta fluxo muito mais lento com microchobstrução Annel. O canal de fundo é completamente obstruído com ausência de fluxo e as velocidades do fluxo no microcanais outros endothelialized são significativamente mais baixos do que na condição de hidroxiureia. A barra de escala em todas as três imagens é 30 mm.
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Discussion
O nosso sistema microdispositivo endothelialized é mais adequada quando usado em conjunção com as experiências in vivo, ea sua abordagem reducionista pode ajudar a elucidar os mecanismos biofísicos de processos hematológicas que são observadas em humanos e em modelos animais. Além disso, nosso sistema não é sem limitações. Por exemplo, os nossos canais microfluídicos são quadrados em corte transversal. Embora tecnicamente microcanais circulares podem ser fabricados 10,11, optou-se por recorrer a um processo de fabricação mais simples e padrão para permitir que outros pesquisadores prontamente aplicar este sistema em seu próprio trabalho. Além disso, a presença das células cultivadas endoteliais naturalmente "rodadas para fora" o lúmen eficaz, permitindo que o sistema a ser mais fisiológico. Além disso, a presente modelagem fluido dinâmico revelam que as condições de escoamento no nosso sistema são comparáveis às que, no in vivo microvasculatura. Finalmente, o trabalho recente caracterizando o fluxo de sangue na praça ummicrocanais d rectangulares demonstrou que estes geometrias são adequados para experiências de sangue de reologia 15.
Finalmente, o nosso ensaio não se destina a medir, de forma isolada, distintos celulares propriedades biofísicas que levam à oclusão microvascular. Técnicas como a microscopia de força atômica, aspiração por micropipeta, e captura óptica têm sido bem caracterizados para esses tipos de experimentos. Em vez disso, o valor do nosso microssistema é a sua capacidade para Recapitulando, simultaneamente e dentro de um único sistema in vitro, um conjunto de processos fisiológicos e propriedades biofísicas, incluindo a expressão de moléculas de adesão, aberrantes de sangue interacções célula-célula endotelial, agregação de células de sangue (por exemplo, trombose ), deformabilidade da célula, o tamanho da célula / forma, a geometria microvascular e hemodinâmica, todos os quais contribuem para as interacções patológicas microvasculares celulares em diferentes estados de doença.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos T. Hunt, M. Rosenbluth, eo Laboratório de Lam para os seus conselhos e discussões úteis. Agradecemos o apoio de G. Spinner e do Instituto de Eletrônica e Nanotecnologia do Georgia Institute of Technology. O apoio financeiro para este trabalho foi fornecida por uma subvenção NIH K08-HL093360, prêmio UCSF REAC, um Nanomedicina NIH Desenvolvimento Award Centro PN2EY018244 e financiamento do Centro de Biologia Celular endotelial de Saúde Infantil de Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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