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使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

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DOI：

10.3791/4327

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2012年10月31日

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1Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, 2Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, 3Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

本文内容

摘要

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4 ml外周血中生成人诱导多能干细胞（iPSC）。对易于获取的血细胞进行重编程，有望通过使iPSC技术惠及更广泛的研究群体，从而加速该技术的应用。

摘要

通过异位表达四种转录因子Oct4、Klf4、Sox2和cMyc，可将人类体细胞重编程为多能状态，从而生成所谓的诱导性多能干细胞（iPSCs）1-4。患者特异性的iPSCs避免了围绕胚胎干细胞（ESCs）存在的伦理问题，并可规避潜在的免疫排斥反应。因此，iPSCs在疾病模型研究、药物化合物筛选以及再生治疗等领域受到了广泛关注5。

我们已利用一种可切除的单个多顺反子慢病毒干细胞盒（STEMCCA），生成了不含转基因的人类诱导多能干细胞（iPSC），该载体编码山中因子6。这些iPSC系来源于皮肤成纤维细胞，这是重编程中最常用的细胞类型。通常，获取成纤维细胞需要进行皮肤钻孔活检，随后在体外培养中扩增数代。重要的是，已有多个研究团队报道了将人类外周血细胞重编程为iPSC的方法7-9。其中一项研究采用了STEMCCA载体的四环素诱导型版本9，该方法需要同时用一种持续表达编码反向四环素转录激活因子的慢病毒感染血细胞。与成纤维细胞相比，外周血细胞可通过微创方式采集，显著减轻患者的不适与痛苦。采用一种组成型、单次可切除载体对血细胞进行重编程的简单高效方案，可能通过使更多研究者能够使用该技术，从而加速iPSC技术的应用。此外，对外周血细胞的重编程使得可以从那些应避免皮肤活检（例如：异常瘢痕形成）或因已有疾病状况而无法进行钻孔活检的个体中获得iPSC。

本文展示了一种利用单个带有loxP位点、可切除的慢病毒载体持续表达4种因子，从外周血单个核细胞（PBMCs）生成人诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。新鲜采集或解冻后的PBMCs在含有抗坏血酸、SCF、IGF-1、IL-3和EPO的培养基中扩增培养9天10,11，随后用STEMCCA慢病毒感染。感染后将细胞接种至小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，约两周后可观察到类似胚胎干细胞（ESC）的克隆。最后，挑选出的克隆进一步扩增，并检测其多能性标志物SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达情况。该方案操作简便、稳定且重复性高，仅需4 ml易获取的血液样本即可可靠地生成人iPSCs。

方案

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离与扩增

第0天

  1. 采集4 ml外周血至含柠檬酸钠的BD Vacutainer CPT细胞分离管中，轻轻倒置混匀8到10次，室温下1,800 x g离心30分钟。此步骤最好在采血后2小时内完成。
  2. 用移液管将位于凝胶屏障与血浆之间的单个核细胞层（即血沉棕黄层）转移至无菌的15 ml圆锥形离心管中，收集单个核细胞（MCs）。加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）使总体积达到10 ml，轻轻颠倒混匀数次，于300 × g离心15分钟。
  3. 将细胞重悬于 10 ml 无菌 PBS 中并进行细胞计数。转移 1 至 2×106 将细胞转入无菌15 ml锥形离心管中，以300 × g离心10分钟。
  4. 用 2 ml 扩增培养基（EM）（QBSF-60 干细胞培养基，含 50 μg/ml 抗坏血酸、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL-3、2 U/ml EPO、40 ng/ml IGF-1、1 μM 地塞米松和 100 μg/ml primocin 或 1% 青霉素/链霉素）重悬细胞，转移至 12 孔板中的一个孔。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。2 培养箱
  5. 离心剩余细胞，300 x g 离心 10 分钟，冻存约 2×106 含10% DMSO的FBS中每小瓶细胞数。
  6. 使用冻存的PBMCs开始实验方案时，将1管细胞解冻至10 ml QBSF培养基中，于300 × g离心10分钟。用2 ml EM重悬细胞，转移至12孔板中的1个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。2 培养箱

第3天和第6天

  1. 将细胞转移至无菌的15 ml圆锥形离心管中，用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞。
  2. 在300 × g条件下离心细胞10分钟。
  3. 将细胞重悬于2 ml EM中，并转移至12孔板的一个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。

2. 使用STEMCCA慢病毒转导PBMCs

第9天

  1. 将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔壁一次，以收集贴壁细胞。
  2. 以 300 × g 离心 10 分钟。
  3. 将细胞重悬于 1 ml 含 5 μg/ml 多聚素（polybrene）和 STEMCCA 慢病毒（MOI = 1 至 10）的新鲜 EM 中，并转移至 12 孔板的一个孔内。（慢病毒颗粒制备的方案可参见 http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/)
  4. 在25 °C下以2,250 rpm转速离心90分钟。
  5. 离心后，加入额外的1 ml新鲜EM 含 5 μg/ml 多聚素的完全培养基，总体积为 2 ml，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 培养箱

第10天

  1. 将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔壁一次，以收集贴壁细胞。
  2. 在300 × g条件下离心细胞10分钟。
  3. 用2 ml EM重悬细胞，转移至12孔板中的1个孔内。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。

3. 将转导细胞接种至MEFs上

第11天

  1. 用0.1%明胶包被6孔板的孔，每孔以2×105个细胞的密度接种失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），培养基为MEF培养基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml普乐霉素或1%青霉素-链霉素）。每种感染准备3个孔。

第12天

  1. 将细胞转移至无菌的15 ml锥形管中，并用1 ml QBSF-60干细胞培养基洗涤孔板一次，以收集贴壁细胞。
  2. 将细胞重悬于3 ml含有10 ng/ml bFGF、抗坏血酸以及与EM培养基中相同浓度生长因子的MEF培养基中（50 μg/ml抗坏血酸、50 ng/ml SCF、10 ng/ml IL-3、2 U/ml EPO、40 ng/ml IGF-1、1 μM地塞米松）。
  3. 将1 ml细胞接种至含MEF饲养层的6孔板每孔中。每孔加入1.5 ml含有bFGF、抗坏血酸和生长因子的MEF培养基，使每孔培养基总体积为2.5 ml。
  4. 在25 °C下以500 rpm离心30分钟。随后将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。

第14天

  1. 每隔一天使用含有 10 ng/ml bFGF 和 50 μg/ml 抗坏血酸（无生长因子）的 2.5 ml MEF 培养基喂养细胞。每次换液时吸除并弃去悬浮细胞。
  2. 根据需要添加额外的 MEF 细胞（通常每周一次）。

~ 第20天

  1. 当出现小克隆后，每天使用 2 ml 人胚胎干细胞（hESC）培养基（含 20% Knockout 血清替代物、1% 非必需氨基酸、100 μM β-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 μg/ml 原霉素或 1% 青霉素-链霉素以及 10 ng/ml bFGF 的 DMEM/F12 培养基）进行换液。

4. iPSC 克隆的挑选与扩增

~ 第 30 - 40 天

  1. 将每个克隆分别挑取至已预先接种灭活MEF的12孔板中，每孔加入含10 μM Stemolecule Y27632（ROCK抑制剂）的hESC培养基1 ml。
  2. 此后每天仅用1 ml hESC培养基更换培养液（不含ROCK抑制剂）。

5. 多能性标志物的免疫荧光染色

  1. 使用 Millipore 公司的“ES Cell Marker Sample Kit”试剂盒，并按照制造商提供的方案进行染色。

6. 整合型STEMCCA载体的切除

  1. 通过转染表达 Cre-IRES-Puro 的载体并进行短暂的嘌呤霉素筛选，即可实现重编程盒的切除，具体方法如文献6所述。

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结果

我们展示了一种利用单个慢病毒载体从外周血单个核细胞（PBMCs）高效生成人诱导多能干细胞（iPSCs）的简单且有效的实验方案。图1A展示了该方案的示意图。血液被采集至含柠檬酸钠的BD Vacutainer CPT细胞分离管中，经离心后，单个核细胞可从聚酯凝胶与血浆之间的界面（即血沉棕黄层，buffy coat）收集（图1B）。分离得到的PBMCs随后在体外培养中扩增9天。图2比较了第0天与第9天的PBMCs，显示细胞已明显进入分裂状态。在使用STEMCCA慢病毒感染约10–15天后，可见少量明亮的小克隆出现，此时克隆形态尚不明确。加入人胚胎干细胞（hESC）培养基后，具有hESC样形态的克隆可被清晰识别（图2D）。部分此类克隆通过机械法挑选、扩增，并检测多能性标志物如SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达情况（图3）。通过采用短时间嘌呤霉素筛选策略6，我们能够稳定获得无外源基因整合的iPSC克隆，如图4

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讨论

本文描述了使用STEMCCA慢病毒载体，从少量新鲜采集的外周血中分离出的单个核细胞生成人诱导多能干细胞（iPSC）的方法。该方案也可用于重编程冻存的外周血单个核细胞（PBMC）（直接来源于血沉棕黄层），这一点在使用来自远距离供体的细胞时具有重要的实际意义。在启动重编程之前，分离得到的PBMC必须经历一个关键的扩增步骤，以获得健康且具有增殖能力的细胞群体，从而更易于进行核重编程。在造血培养条件下扩增时，可通过观察到类似“葡萄串样”的细胞簇来轻松判断扩增效果。当转导细胞数少于5×105时，可将细胞接种至含有小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的6孔板中的一个或两个孔内。我们在实验中发现，观察到类似人胚胎干细胞（hESC）样克隆所需的时间存在一定变异，某些情况下可长达转导后25天。使用ROCK抑制剂对于提高 emerging iPSC克隆在挑取过程中的存活率和克隆效率至关重要。值得注意的是，与从重编程的成纤维细胞中挑取克隆的情况不同，从重编程的PBMC中挑取的克隆几乎100%能够建立稳定的iPSC克隆系，并可进一步扩增和冻存。最后，我们认为，样本采集的简便性结合本文所述高效且稳定的重编程方法，构成了一个真正可靠的平台，适用于需要...

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致谢

这些研究部分由 NIH UO1HL107443-01 奖项资助，授予 GJM 和 GM。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含柠檬酸钠的 BD Vacutainer CPT 细胞制备管BD Biosciences362760
QBSF-60 干细胞培养基Quality Biological160-204-101
IMDMInvitrogen12440
DMEM/F12Invitrogen11330
FBSAtlanta BiologicalsS10250
Knockout 血清替代物Invitrogen10828
PrimocinInvivogenant-pm-2
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Invitrogen15140
L-谷氨酰胺Invitrogen25030
非必需氨基酸Invitrogen11140
β-巯基–乙醇MP Biomedicals190242
抗坏血酸SigmaA4544
IGF-1R&D Systems291-G1
IL-3R&D Systems203-IL
SCFR&D Systems255-SC
EPOR&D Systems286-EP
地塞米松SigmaD4902
PolybreneSigmaH-9268
bFGFR&D Systems233-FB
Stemolecule Y27632Stemgent04-0012
胚胎干细胞标志物样本试剂盒MilliporeSCR002

参考文献

  1. Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  2. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  3. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  5. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
  6. Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  7. Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  8. Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  9. Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  10. Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
  11. vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).

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