Summary
Serbest yüzme nematod gibi mikroskobik organizmalar
Abstract
Toprak ve su mikroskobik organizmalar yaşamak ve karmaşık üç boyutlu ortamda davranırlar. Mikroskobik organizmanın davranışının çalışmaların çoğu, aksine, biz gerçek zamanlı analiz sağlar yeni bir analitik yaklaşım sunmak dar, yaklaşık iki boyutlu odak alanına hareket ve davranış sınırı mikroskop-temelli yaklaşımlar. 1 kullanılarak yapılmıştır serbestçe C. yüzme mikroskop tabanlı donanım bağımlı olmadan bir küvet içinde elegans. Bu yaklaşım, küvet aracılığıyla lazer ışık yönlendirilmesi ile oluşturulan kırınım desenleri geçici periyodiklik izleme oluşur. Biz serbestçe yüzme nematodlar için salınım frekansları ölçer.
Uzak-alan kırınım desenleri Analiz nematodların dalga hakkında ipuçları ortaya koymaktadır. Difraksiyon bir nesnenin etrafında bükme ışık işlemidir. Bu durumda ışık organizmalar tarafından kırıldıkları olduğunu. Işık dalgaları müdahale ve reklam oluşturabiliriffraction desen. Ekran-nesne mesafe Kırınımlı nesnenin daha büyük ise, bir uzak-alan veya Fraunhofer, kırınım deseni oluşur. Bu durumda, sapma örüntüsü, bir Fourier transform kullanılarak (örnek alınarak) hesaplanabilir. 2
C. elegans üç boyutta gezinmek serbest yaşayan Toprakta yaşayan nematodlar vardır. Onlar tarama denilen bir sinüzoidal lokomotor desen ve yüzme denen farklı bir desen sıvı toprak veya agar gibi bir katı matris üzerinde her iki hareket. 3 rolleri mechanosensory, kimyasal duyusal ve lokomotor plastik değişiklikler yöneten thermosensory hücreleri tarafından sağlanan duyusal bilgi oynadığı desen desen ve anahtarlar sadece aydınlatılamamış başlıyor. Biz bir mikroskop gerektirmez ve bize farklı işbirliği altında nematodu lokomosyon karmaşıklığı keşfetmek için başlamanızı sağlayacak üç boyutlu nematod lokomosyon ölçmeye yarayan bir optik yaklaşımı açıklamak 4şulları.
Protocol
1. C. Video Analizi için elegans Hazırlık
- Bir ince, düzleşmiş platin tel çekme kullanarak taze NGM agar dolu Petri plakalarına 10-20 gravid erişkin nematodlar taşıyın. NGM agar ile dolu petri E. küçük dairesel noktayı içerecek coli yemek nematodlar için (bir büyüme sınırlı zorlanma, OP50, iyi sonuç verir). Nematodlar 3-5 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin ver ve sonra böylece 50-150 nematod küçük, gelişimsel-senkronize kültürünün oluşturulması, yetişkin çıkarın. Nematodlar 4-5 gün süre ile 20 ° C'de Petri plakalar inkübe ederek erken yetişkinlik büyümek için izin ver. Bu kültür yöntemleri, oluşturulan prosedürlere (Stiernagle 2006) dayanmaktadır. 5
- Video analiz gününde, dolayısıyla senkronize kültürü 50-150 solucanlar toplama, deiyonize, distile su 1 ml genç yetişkin nematod bir tabak yıkayın. M9 veya PBS gibi bir tampon çözelti de kullanılabilir. W spin için bir mikrosantrifüj kullanıntüpün alt ya da bunların, yaklaşık 15 dakika için yerçekimi ile yerleşmek için izin vermek için ORMS. Tüpten suyun çoğunluğu çıkarın ve nematodların dan herhangi yapışan bakterilerin yıkamak için deiyonize su, damıtılmış su, 1 ml ile değiştirin.
- Bir mikropipet kullanarak kuvars küvetine su veya tampon nematodlar aktarın. Bir seferde bir nematod lazer ile aydınlatılmış olması muhtemeldir ki böylece bir kez ya da daha az, toplam 5-10 nematodlar hakkında küçük bir sayı ile çalışmak önemlidir. Kültür plakalar üzerinde nematod sayısı çok büyükse, istenilen yoğunluğa ulaşana kadar su veya tampon solucanlar seyreltin. Bu yıkayın ve küvet bireysel solucanlar aktarmak için taze bir agar plaka üzerine su veya tampon bir damla bireysel nematod almak da mümkündür. Bizim çalışmamızda, davranış yüzme fiziksel kısıtlamaların etkilerini incelemek için 1 mm, 2 mm ve 5 mm küvet boyutları kullanılabilir.
2. Video analysi için Optik Kurulumus
- Yetenekli bir 543 nm (yeşil) Helyum-Neon (HeNe) lazer, iki ön yüzeyi alüminyum aynalar, bir küvet tutucusu, bir projeksiyon ekranı ve yüksek hızlı kamera (Casio High Speed Exilim) kullanarak Şekil 1'de gösterildiği kurulumu gerçekleştirin ~ 240 fps filme. Iki ayna vasıtasıyla küvet lazer ışını yönlendirmek için kullanılır. Küvetlerin farklı boyutlarda çalışma doğasına bağlı olarak kullanılabilir. Bir örnek olarak, biz yüzme frekanslarda mekansal kısıtlar etkilerini göstermek için 5 mm kalınlığında olan küvetler kullanılmıştır. Lazer ışını örnekleme için şartları yerine getirmelidir;. Yani organizmanın lazer ışını fazla bir üçüncü engel olmalıdır. C. için Bir nematod ile etkileşime geçtiğinde elegans, lazer ışınının çapı yaklaşık 2 mm olmalıdır. Kırınım deseni bulmak zor olacağından lazer ışını çapı 5 mm'den büyük olmamalıdır. Ekrana difraksiyon organizmadan mesafe çok daha büyük olmalıdırorganizmanın kendisi.
- Yeri küvetin üst üzerinde parafilm ve su kanallarının içine nematod karıştırmak için onu çevirin. Solucanlar küvet üst kısmında başlangıçta böylece bir küvet tutucu küvet yerleştirin. Aynalar kullanarak, küvetin merkezi aracılığıyla lazer ışını yönlendirmek. Nematodlar su daha yoğun olduğu için aynı zamanda su sütunu içinde yüzerken, yavaş yavaş, küvet altına düşecek.
- Iletilen ışın projeksiyon ekranı (Şekil 2) uygun olarak projeksiyon ekranı, renk üzerine siyah iletilen lazer ışını karşılık noktaya saçılma azaltmak için. Alternatif olarak iletilen ışın ekranı geçmesine izin vermek için projeksiyon ekranına bir açılış koydu. Giderilmesi veya iletilen ışını saçılması azaltarak iletilen ışın nedeniyle ıslatmasını kameranın CCD dizisi tutacak.
- Sapma örüntüsünün boyut ölçümü yakalamak için, bir çizgi çizmekkırınan ışık görüntü engel olmadan iletilen lazer ışını nokta yanındaki projeksiyon ekranında yaklaşık 5 cm.
- Oda ışığı yüzden 5 cm lik çizgi difraksiyon görüntülerle aynı görüntüleri üzerinde olduğunu ise kamera ile kayda başlayın. Oda ışığı kapatın. Kamera ile ekranda Record kırınım görüntüleri solucanlar lazer ışını geçerken.
3. Video Verileri Hazırlama
- : Video analiz programı (Logger Pro Install http://www.vernier.com/products/software/lp/ bilgisayarda). Video analiz programı içine video alma
- Iletilen lazer nokta denk kökenli ayarlayın. Projeksiyon ekranında 5 cm satırını kullanarak ölçeği ayarlayın.
- Görüntü analiz yazılımı kullanılarak her bir nematod ile oluşan kırılma görüntüsü açısal yer değişimi (Şekil 3) Takip
- Angula bulmak içinBir elektronik tablo (Excel) arctan (x / y), kopyalama ve yapıştırma verileri alarak ve sürekli bir grafiği (Figure. 4) üretmek için tüm negatif açılar için 180 derece veya π ekleyin tarafından r deplasman.
4. Yüzme Frekanslar Anında Gözlem için Gerçek Zamanlı Veri Toplama
- Video analizi için olduğu gibi, aynı ayar kullanarak, doğru projeksiyon ekranı önünde sapma örüntüsünde, merkez dışı bir küçük bir alana (~ 1 mm 2) ile bir foto diyot (ThorLabs itibaren DET10A) yerleştirin.
- USB portundan bilgisayara bağlanan dijital osiloskop (Pico Technology tarafından yapılan PicoScope) için fotodiyot bağlayın. Bilgisayar ekranında thrashing şablonlarını inceleyin.
- ASCII veya metin biçiminde alınan veri setleri kaydedin.
5. Veri Analizi
- Verilerin analizinde ki-kare minimizasyonu kullanarak uydurma dalga yeteneğine sahip bir veri analizi programı içine video veya fotodiyot kullanılarak elde alma. Burada kullanılan program (Kökeni http://www.originlab.com/ ). Dayak frekans (Şekil 4 ve 5) belirlemek için bir sinüsoidal eğri yerleştirin.
- Ortalama yüzme çeşitli örneklerinden frekansları ve uyuşmazlığını belirler. Bu çalışma için, verilerin istatistiksel Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile takip tek faktörlü ANOVA kullanılarak analiz edildi. <0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
6. Örneği Mathematica kullanarak model Kırınım Desenleri
Not: Kırınım desenleri birçok farklı hesaplama araçlarını kullanarak modellenebilir. Bu yordam, Matlab, Excel gibi farklı hesaplama araçları, Menşe vs için farklı olacaktır
- Görüntü Oluşturma: geleneksel mikroskop kullanarak bir mikroskop lamı üzerine nematod fotoğraf çekebilirsiniz.
- Görüntü Binarize: İthalat solucan görüntüyü 'Worm' iMathematica içine görüntüsünü sürükleyerek nto Mathematica. Siyah beyaz bir görüntü (binarize) içine görüntü dönüştürün. Bu Mathematica 'Binarize' komutu ile elde edilebilir: BlackandWhiteImage = Binarize [Sonsuz]. Görüntü sonra bir siyah beyaz resim olarak görülebilir.
EdgeDetect [Solucan, 6.0,0.035], iki takip eden sayı edilen kenarların hoyratlık kontrol: Alternatif olarak, bir BlackandWhiteImage oluşturmak için 'EdgeDetect "komutunu kullanarak. - Sıfır ve birlerin bir matris içine resim dönüştürme: Bu Mathematica 'ImageData' komutu ile elde edilebilir: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
- Fourier matrisi: Belirtilen FourierParameters kullanarak matris dönüşümü Fourier Mathematica 'Fourier' komutunu kullanın: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
- Matrisinin Meydanı modülü kırınım matris elde edilir ve görüntü kontrastı artırmak için: mutlak Meydanımatris değeri ve orijinal görüntü karşılık gelen kırınım modelidir çıkan görüntü görüntüleyebilir. Ayrıca, görüntünün kontrastını ölçeklendirmenize 'Log' işlevini kullanın: ImageContrast = Resim [Günlükler [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
- Kolay görüntüleme için görüntüyü yeniden boyutlandırma: Mahsul merkezi kırınım deseni ve istenilen şekilde yeniden boyutlandırmak: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500].
- Serbestçe yüzme solucanlar alınan kırınım desenleri ile modellenen kırınım desenleri karşılaştırın. (Şekil 6)
Representative Results
Bir örnek olarak, C incelenmiştir geniş bir kuvars küvetine 1 cm, 5 mm kalınlığında ve 4 cm boyunda küvet içinde elegans. Video analizi kullanarak tek bir solucan Örnekleme, 5 mm kalınlığında küvet içinde video analizi elde edilen ortalama yüzme sıklığı yaklaşık 2.5 Hz (Şekil 4). Benzer şekilde, gerçek zamanlı veri toplama yöntemi kullanılarak tek bir solucan örnekleme, biz yaklaşık 2,7 Hz (Şekil 5) bir yüzme frekansı elde dijital osiloskop (PicoScope) kullanarak. Bu prosedür birçok solucanlar için tekrar edilebilir. Serbestçe yüzme solucan detaylı bir çalışma, 5 mm küvet içinde 2.37 Hz ortalama yüzme sıklığı saptandı. 6 Beklendiği gibi, yüzme frekansı bir tarama solucan (~ .8 Hz) daha yüksektir. 3, bu kırınım yöntemi kullanarak Bir C. ortalama yüzme frekansları bir mikroskop slaydı ile sınırlı elegans, 2 Hz önceden yayınlanmış değeri ile eşleştirmek için tespit edilmiştir. 1.7
ve_content "> Aşağıdaki prosedürler. 3) ve daha sonra 6). geleneksel bir mikroskop ile elde edilen solucan görüntü yardımıyla kırınım desenleri yüzme modellenmesi için olanak sağlar. modellenen kırınım desenleri C. elegans yüzerek döngüsü (simüle etmek için kullanılırlar Şekil 6). başarılı bir model yüzme frekansları uygun fiziksel olarak uygulanabilir ardışık yüzme desen meydana gelir. bir yüzme döngüsünün başlangıcında olduğu gibi solucan yüzebilir döngüsünün sonunda aynı şeklinde olmalıdır.
Şekil 1. Yeşil HeNe lazer canlı C. kullanarak dinamik bir kırınım deseni oluşturmak için kullanılan elegans. Bu kırınım deseni 240 fps'de çekildi.
Şekil 2. Dra kanat siyah bir nokta iletilen ışının emilimini artırır. Dağınık ışık nedeniyle kameranın Doygunluk azaltılmış ve kırınım deseni görünür hale gelir.
Şekil 3. Izlenmekte olan bir solucan kırınım deseni ile video analiz yazılımı ekran görüntüsü (Logger Pro). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen video veri. Eğri fit ~ 2.5 Hz'lik bir yüzme frekansını gösterir.
"/>
Şekil 5. 5 mm küvet bir nematod yüzmek döngüsü karşılık gelen gerçek zamanlı veri. Eğri fit ~ 2.7 Hz'lik bir yüzme frekansını gösterir.
Şekil 6. Üst satırı gerçek kırınım desenleri temsil ve alt satırında modellenen kırınım desenleri ile eşleştirilir. Modellenen kırınım desenleri bir mikroskop lamı (orta sıra) üzerinde solucanlar kullanılarak üretilmiştir.
Discussion
Biz gerçek zamanlı hareket ölçme ve mikroskopların kullanımı gerektirmez nematod gibi mikroskobik organizmaların basit lokomotor davranışlar için yeni bir yaklaşım geliştirdik. 8 Bu metodolojik yaklaşım da tek hücreliler gibi çok sayıda mikroskobik organizmaların incelemek için yararlanılabilir. Bu yöntem, yalnızca kullanılan ışık dalga boyu ile sınırlıdır. Organizma ışığın dalga boyundan daha küçük olmaması gerekir. Ihtiyaç duyulan donanım ve maliyet tasarrufu ve taşınabilirlik ek olarak, bu yaklaşım, bir önemli avantajı, bir mikroskop altında görüntü düzlemlerinin dar kısıtlama olmaksızın, gerçek zamanlı olarak ve üç boyutlu olarak davranış ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik mikroskop bazlı yaklaşımlar kullanılarak çalışılabilir bir davranış üzerinde yerçekimi kuvvetleri veya çok sayıda diğer koşulların etkilerini incelemek ile de mümkündür. 9 Böylece, mikroorganizmanın doğal lokomotor davranış bozuklukla daha iyi anlaşılmasını sağlamak içinmikroskop lamı damlacıkları veya özel mikroakışkan odaları (Park ve ark, 2008) sınırlarından kurtulmuş viors. 10.
Kırınım deseninin faz bilgi eksikliği uzak-alan kırınım deseni Fourier dönüşümünün mutlak değer karesi ile orantılı olduğundan Kırınımlı nesneye karşılık görüntünün doğrudan alımı için izin vermez. Onlar serbestçe yüzme nematod (Şekil 6) kırınım desenleri ile uyumlu olabilir, böylece Biz bu nedenle solucan görüntüleri kırınım desenleri hesaplıyoruz.
Bu yöntem gerçekten özgürce C. yüzme için sonuçlar vermiştir elegans ve hiçbir mikroskobik tür uygulanabilir ki su ya da birçok farklı iyonik çözeltiler gibi bir optik olarak transparan bir ortam içinde manevralar. Konvansiyonel mikroskoplar mikrometre sipariş üzerine bir odak derinliğinde çalışmalara izin verir. 11. Bu Sınırlı nedeniyleışık odaklama alan derinliği:
Bu kırınım yöntemi kesinlikle geleneksel mikroskopi için bir yedek değil iken N kısa bir odak uzaklığı bir büyük c ile ilişkili olduğunu böylece karışıklık (c) daire karşılıklı bir ilişki vardır f-sayısı. 12,13, bunun mümkün olduğu hızlı bir şekilde türlerin bile düşük maliyetli gerçek zamanlı olarak manipüle edilebilir kantitatif sonuçlar sunmak için. Kırınım desenleri herhangi bir lazer pointer ile elde edilebilir. Kırınım desenleri normal bir dijital kamera kullanarak azaltılmış bir zamansal çözünürlükte filme olabilir. Kullanıcının kolayca kullanılabilir bir mikroskop veya fotodiyot sahip olmasa da, böyle bir dayak frekansları ölçme ve kırınım desenleri değerlendirerek bu denemenin önemli parçaları son derece düşük maliyetle tamamlanabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello ve Karl Spuhler ederim. Bu çalışma Vassar Koleji Lisans Araştırma Yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard Salmon Araştırma Fonu ve NASA ödülü # NX09AU90A, Bilim ve Teknoloji Araştırma Mükemmellik Ulusal Bilim Vakfı Merkezi (NSF-CREST) ödülü # 0630388 ve NSF tarafından desteklenmiştir Ödül # 1058385.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 543 nm HeNe Laser | Melles Griot | LGX1 | Any laser in the visible range with less than 5 mW can be used. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| High Speed Exilim Camera | Casio | ||
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ |
References
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- James, J. F. A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , Cambridge Univ. Press. (1995).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).
- Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue. Nature. 440, 684-687 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, W. ormB. ook, , (2006).
- Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction. O. J. Biphys. , (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).
- Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
- Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment. PLOS One. 3, e2550 (2008).
- Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).
- Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
- Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).
