Summary
सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) एक सटीक वेग प्रोफाइल देने के लिए पार से सहसंबद्ध होते हैं जो रक्त प्रवाह में वरीयता प्राप्त सूक्ष्म कणों की बनती छवियों कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. नैदानिक आवेदन किया है, जिनमें से प्रत्येक कतरें दर, अधिकतम गति, वेग प्रोफाइल आकार, और प्रवाह की दर, इन मापों से प्राप्त किया जा सकता है.
Abstract
सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) रक्त प्रवाह में वरीयता प्राप्त सूक्ष्म कणों की बनती छवियों कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. छवियों के एक सटीक वेग प्रोफाइल देने के पार सहसंबद्ध हैं. एक प्रोटोकॉल microchannels में रक्त प्रवाह की μPIV मापन के लिए प्रस्तुत किया है. Microcirculation के पैमाने पर, रक्त प्लाज्मा, एक न्यूटन द्रव में निलंबित लचीला कणों के निलंबन के रूप में, एक सजातीय तरल पदार्थ नहीं माना जा सकता. कतरें दर, अधिकतम गति, वेग प्रोफाइल आकार, और प्रवाह की दर इन मापों से प्राप्त किया जा सकता है. ऐसे फोकल गहराई, कण एकाग्रता, और सिस्टम अनुपालन के रूप में कई महत्वपूर्ण पैरामीटर, विभिन्न hematocrits और प्रवाह की स्थिति के लिए उदाहरण और प्रतिनिधि परिणामों के साथ सही, उपयोगी डेटा सुनिश्चित करने के क्रम में प्रस्तुत कर रहे हैं.
Introduction
मानव शरीर के रक्त और ऊतकों के बीच मुख्य विनिमय स्थल हैं जो व्यास कम से कम 50 माइक्रोन, के साथ कई वाहिकाओं शामिल हैं. इन वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह का अध्ययन माप के पैमाने और रक्त का द्रव गुण दोनों की वजह से काफी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है. दबाव ढाल, दीवार पर कतरनी, और धमनियों और venules में वेग प्रोफाइल सहित इन मापों, शारीरिक प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े महत्वपूर्ण कारक हैं. इन माप चुनौतियों को हल करने के लिए अभूतपूर्व अवसर, microcirculation में अध्ययन करने और इस multiscale समस्या को हल करने के लिए सूक्ष्म स्तर पर नई प्रयोगात्मक तकनीक की बदौलत अब कर रहे हैं.
सूक्ष्म कण छवि velocimetry (μPIV) पार सहसंबंध के माध्यम से microchannels में रक्त के प्रवाह के वेग प्रोफाइल मूल्यांकन किया जाता है कि एक कण आधारित प्रवाह दृश्य तकनीक है. पहले सैंटियागो एट अल. द्वारा विकसित μPIV, hemorheology के साथ इस्तेमाल किया गया हैSugii एट अल के बाद से अध्ययन करता है. 2001 में 100 माइक्रोन दौर ग्लास ट्यूब में 1,2 रक्त प्रवाह को मापने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया. ΜPIV अस्तित्व के लिए अलग अलग दृष्टिकोण. उच्च गति कैमरों लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) की आवाजाही सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और स्पंदित छवियों ट्रेसर कणों के आंदोलन सहसंबंधी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन विकल्पों में से किसी भी आवेदन पर निर्भर करता है, एक ईमानदार या उलटा माइक्रोस्कोप के साथ मिलकर किया जा सकता है. दोनों ही मामलों में, परिणाम एक 2D वेग प्रोफाइल है. एक और दृष्टिकोण को 2 डी और 3 डी प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए है. इस विधि रक्त 3,4,5 के लिए लागू किया गया है.
मैक्रो PIV के साथ तुलना में माइक्रो पैमाने PIV कई जटिलताओं है. मैक्रो PIV में डेटा प्रकाश की चादरों के माध्यम से एक ही विमान तक सीमित किया जा सकता है, लेकिन सूक्ष्म स्तर मात्रा रोशनी में आवश्यक है. लाल रक्त कोशिकाओं को खुद ग की तुलना में बड़े होते हैं के रूप में वॉल्यूम रोशनी, सूक्ष्म रक्त प्रवाह की इमेजिंग के लिए एक बड़ी समस्या हैhannels, और ट्रेसर कणों के रूप में लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग काफी पार सहसंबंध परिणाम 6,7,8 की सटीकता की कमी कर सकते हैं जो सहसंबंध की गहराई (डॉक्टर) की ओर जाता है. एक 1 माइक्रोन ट्रेसर कण के साथ डॉक्टर 6.7 माइक्रोन है जबकि tracers साथ आरबीसी के साथ एक 40 माइक्रोन लंबा चैनल के लिए Wereley एट अल. (1998) डॉक्टर के बाद, 8.8 माइक्रोन है. चैनल ऊंचाई और बढ़ाई बदल रहा है जब यह अंतर और अधिक स्पष्ट हो जाता है. इसके अतिरिक्त, लाल रक्त कोशिकाओं अपारदर्शी हैं, और प्रवाह में लाल रक्त कोशिकाओं के घनत्व में वृद्धि इमेजिंग कठिनाइयों का कारण बनता है. संभव छोटे कणों का उपयोग करते समय पहले सैंटियागो एट अल. (1998) द्वारा इस्तेमाल Fluorescing ट्रेसर कण, बाहर का ध्यान केंद्रित कणों के प्रभाव को कम करने के लिए एक उपकरण के रूप में वकालत की गई है. 1 माइक्रोन व्यास fluorescing का प्रयोग एक लेजर के साथ मिलकर microparticles सूक्ष्म रक्त प्रवाह इमेजिंग 10 में ध्यान समस्या की गहराई कम हो सकती है कि एक दृष्टिकोण है. ΜPIV tec की राज्य के कई वर्तमान समीक्षा कर रहे हैंरक्त प्रवाह पढ़ाई 11,12 को μPIV के महत्व पर प्रकाश डाला गया है, जिनमें से प्रत्येक hnology,. रक्त के लिए μPIV का उपयोग करते समय कई महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए. सूक्ष्म स्तर पर, microcirculation के पैमाने, रक्त यह एक न्यूटन द्रव (प्लाज्मा) में निलंबित लचीला लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी), बड़े सफेद रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेटों और अन्य प्रोटीन के निलंबन के रूप में, एक सजातीय तरल पदार्थ नहीं माना जा सकता .
यहाँ मापा वेग प्रोफाइल सूक्ष्म रक्त प्रवाह की कुछ विशेषताओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. microhemorheology में महत्वपूर्ण कारकों में रक्त के प्रवाह की दर, वेग प्रोफाइल के आकार, और पोत की दीवार पर कतरनी तनाव हैं. Microcirculation में शरीर में पोषक तत्वों के आदान प्रदान के लिए साइट है, के रूप में यह जानकारी, नैदानिक प्रभाव पड़ता है, और इस मुद्रा कतरनी पर निर्भर है. Microcirculation में अनुसंधान की स्थिति पर कई वर्तमान समीक्षा पढ़ाई, साथ ही 13 कर रहे हैं14,15.
यहाँ प्रस्तुत polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels में रक्त प्रवाह की μPIV मापन के लिए एक प्रोटोकॉल है. PDMS चैनल प्रोटोकॉल की धारा 1 में सूत्रों का पालन घर में गढ़े गए थे. सुअर का खून के नमूने को एक मान्यता प्राप्त कसाईखाना से प्राप्त की और प्रोटोकॉल की धारा 2 पीछा कर साफ कर रहे थे. सभी डेटा के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 3 में वर्णित LaVision MITAS μPIV प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. YAG लेजर (न्यू वेव अनुसंधान, यूएसए) और सीसीडी कैमरा (छवि तीव्र, Lavision) एक प्रोग्राम ट्रिगर इकाई, 3 कुल्हाड़ियों में घूम रहा है एक मंच के साथ मिलकर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, और एक कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित: सेट अप एक एन डी के होते हैं एक उच्च गति कैमरा (Dalsa 1M150, नीदरलैंड) के अलावा लाल रक्त कोशिकाओं को खुद के दृश्य के लिए जोड़ा गया है. दोनों कैमरों एक 2 बंदरगाह ऑप्टिक बॉक्स (Zeiss द्वारा कस्टम, जर्मनी) से जुड़े हैं. रक्त प्रवाह के vivo माप में ठेठ में, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप लाल रक्त कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता हैmselves, इन विट्रो अनुप्रयोगों में ठेठ में एक औंधा माइक्रोस्कोप ट्रेसर कणों को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि. सेट अप के इस अद्वितीय दोहरी में, प्रकाशिकी बॉक्स दोनों tracers उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged किया जा करने की अनुमति देता है. रक्त एक उच्च परिशुद्धता सिरिंज पंप (Nexus3000, Chemyx इंक, यूएसए) के माध्यम से माइक्रोचिप्स में पेश किया गया था. प्रणाली का एक चित्र आकृति के शीर्ष भाग PDMS की गढ़े 40 माइक्रोन आयताकार चैनलों से 140 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है जहां चित्र 1 में दिखाया गया है, और नीचे के हिस्से को दोनों कैमरा, लेजर, सिरिंज पंप और सहित पूरे तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है माइक्रोस्कोप.
वर्तमान μPIV सेट अप उपलब्ध है, आमतौर पर मालिकाना सॉफ्टवेयर के साथ, TSI, Dantec गतिशीलता, और LaVision शामिल हैं. स्टैंडर्ड पार से संबंध एल्गोरिदम MATLAB सहित कई सॉफ्टवेयर विकल्प है, के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. सॉफ्टवेयर संवाद बॉक्स गणितीय उपयोग की सेवा करेंगे के अनुरूप क्या समझ, कुंजी नहीं हैआर ज्यादा बेहतर है. इस प्रोटोकॉल डेविस, LaVision मालिकाना सॉफ्टवेयर या MATLAB का उपयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल विशेष सॉफ्टवेयर नहीं है, लेकिन मेनू विकल्पों अलग सॉफ्टवेयर संकुल में विभिन्न स्थानों में हो सकता है.
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Protocol
1. माइक्रोचिप निर्माण
पहला कदम अपने microchannel बनाने या खरीदने के लिए है. माइक्रोचिप सामग्री के लिए कई विकल्प हैं.
चुना सबसे आम सामग्री में से एक (PDMS) (dimethylsiloxane) पाली है. मुलायम लिथोग्राफी 16,17,18 के माध्यम से PDMS के निर्माण के लिए निर्देश पर कई प्रकाशनों हैं.
PDMS चैनल गढ़े है एक बार, कई सतह उपचार अपनी प्राकृतिक hydrophobicity रिवर्स करने के लिए उपलब्ध हैं. ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार एक आम विकल्प है.
झोउ, एलिस, और Voelcker (2009) सतह के उपचार की एक समीक्षा दे और वे PDMS कैसे प्रभावित. इन परिणामों लेकिन पानी के लिए कर रहे हैं, और रक्त गुण अलग है. कि सतह के उपचार रक्त के लिए इसका क्या मतलब है पर एक अध्ययन पिट्स एट अल. (2012a) द्वारा किया गया है.
परिणाम यहाँ प्रस्तुत के लिए, माइक्रोचिप सतहों और गिलास स्लाइड वे थे45 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा से अवगत कराया और फिर मजबूती से एक स्थायी बंधन में जिसके परिणामस्वरूप एक साथ दबाया गया दोनों को बंधुआ.
2. रक्त की तैयारी
- एक मान्यता प्राप्त सुविधा से रक्त के नमूने ले लीजिए. उदाहरण के लिए सुअर का खून एक anticoagulant रूप ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के साथ प्रयोग किया जा सकता है. पानी के 4 मिलीलीटर के साथ 1 छ EDTA जोड़ें, और फिर धीरे 10x मिश्रण, पूरे रक्त का 1 एल का हल जोड़ें.
रक्त के नमूने उठा, जब उन्हें आरटी के लिए धीरे धीरे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. रक्त के नमूने ताजा हो, और आदर्श रूप में वे रक्त की rheological गुणों के संरक्षण के लिए एकत्र कर रहे हैं दिन का इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
नमूने आरटी पर एक बार प्रशीतित किया जा सकता है, थक्कारोधी बिना हालांकि पूरे रक्त प्रशीतन के बाद बेकार हो जाएगा. थक्कारोधी पर निर्भर करता है, ऊपर से 42 दिनों तक के लिए लाल रक्त कोशिकाओं प्रशीतित रखा जा सकता है, और पूरे रक्त के 35 दिनों के लिए प्रशीतित रखा जा सकता है, लेकिन प्रदूषण को एक गैर मीटर में संभव होगाedical सुविधा 21.
इसके अतिरिक्त, गोजातीय या सुअर का नमूनों के साथ संग्रह विधि से सावधान रहना होगा, और अस्थि मज्जा से संक्रमण से बचने.
- 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए 3000 rpm पर 3x रक्त नमूने अपकेंद्रित्र. पहले Centrifugation के बाद, प्लाज्मा और buffy कोट हटाने त्यागें. यह पहला प्लाज्मा को दूर करने के लिए आम तौर पर आसान है, और फिर अकेले buffy कोट निकालने के लिए है, तो त्यागने या भविष्य के उपयोग के लिए रहते हैं.
रक्त में वापस buffy कोट मिश्रण नहीं करने के लिए इतनी के रूप में, धीरे पिपेट का परिचय दें. Buffy कोट को हटाने के बाद, फॉस्फेट के बारे में 20 मिलीलीटर जोड़ने खारा (पीबीएस) buffered और, धीरे recentrifuge मिश्रण. अंतिम चरण दोहराएँ. तीसरे Centrifugation के बाद, पीबीएस और शेष buffy कोट हटाने त्यागें.
यह आप खून की कुल संपत्ति रखने करना चाहते हैं तो बजाय पीबीएस के देशी प्लाज्मा का उपयोग करने के लिए भी संभव है. किसी भी buffy कोट या सफेद मिश्रण नहीं करना सुनिश्चित करेंप्लाज्मा में रक्त कोशिकाओं.
- साफ लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) ले लो और वांछित सांद्रता (hematocrits) में पीबीएस या प्लाज्मा में निलंबित. एक microcentrifuge (CritSpin FisherSci, यूएसए) के साथ hematocrits की जाँच करें.
10 से 20% हेमाटोक्रिट में रक्त 40 या 50% (शारीरिक हेमाटोक्रिट) से कल्पना करने के लिए आसान होना चाहिए. Microcirculation में, रक्त आम तौर पर मैक्रो संचलन के आधे हेमाटोक्रिट है, ताकि एच 20 = 15 पर्याप्त है.
- रक्त नमूने के लिए वांछित एकाग्रता में ट्रेसर कण fluorescing जोड़ें. एक सामान्य नियम के आगे समय की गणना की जा सकती है, जो एक संबंध खिड़की में 10 कणों के लिए है.
उदाहरण के लिए, कणों के 30 μl वीडियो में चित्रित सेट अप के लिए रक्त समाधान के 1 मिलीलीटर के लिए जोड़ रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, लाल रक्त कोशिकाओं को खुद fluorescently टैग किया जा सकता है.
- इसके अतिरिक्त, पानी और फ्लू के साथ एक अंशांकन समाधान करनाकणों orescing. यह एक न्यूटन का समाधान के साथ सिस्टम को ठीक करना जरूरी होगा.
उदाहरण के लिए, 100 माइक्रोन के पैमाने पर एक चैनल के साथ एक 10X उद्देश्य का उपयोग करते समय, एक उपयुक्त एकाग्रता आसुत पानी की 15 मिलीलीटर के साथ मिश्रित कणों की 300 μl है. एक अन्य विकल्प के रक्त के मैक्रो चिपचिपाहट के करीब है जो 3cP, की चिपचिपाहट के लिए आसुत जल से पतला ग्लिसरॉल उपयोग करने के लिए है.
3. μPIV माप
- लेजर सुरक्षा: तापमान और नमी की जाँच करें. उचित लेजर सुरक्षा चश्मा पहनें. लेजर पर्दे बंद करें या प्रयोगशाला दरवाजा उजागर किया जा रहा से सुरक्षित नहीं लोगों को रोकने के लिए पर पर लेजर हस्ताक्षर पर बारी.
- डेविस सॉफ्टवेयर के साथ प्रक्रिया वीडियो में दिखाया गया है. एक विशिष्ट प्रणाली के उपयोगकर्ता पुस्तिका को देखें अधिक जानकारी के लिए.
- डेटा लेने से पहले, कैमरा पैमाने पर एक सुक्ष्ममापी का उपयोग कर calibrated किया जाना चाहिए.
- प्रणाली के अनुपालन को कम करने के लिए, ट्यूबिंग की कम से कम राशि के लिए एक का उपयोग करेंघ इस तरह के एक 15 या 50 μl हैमिल्टन Gastight सिरिंज के रूप में छोटी संभव कठोर सिरिंज,. सिस्टम में रक्त या वायु सेवन के रिसाव को कम करने के लिए, सिरिंज और चिप के लिए ट्यूबिंग मुहर. इस गोंद, PDMS या वेसिलीन (रक्त को दूषित करने के लिए सावधान किया जा रहा है) के साथ किया जा सकता है.
सूक्ष्म सिरिंज की मात्रा आम तौर पर भरने की मात्रा की तुलना में काफी छोटा होता है क्योंकि ट्रेसर कणों से सजी पानी के साथ सूक्ष्म सिरिंज को भरने के लिए प्रतिवाह विधि का उपयोग करें.
हमारे प्रतिवाह विधि एक माध्यमिक प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग चैनल के उत्पादन के माध्यम से एक साथ सूक्ष्म सिरिंज और चैनल को भरने के लिए होते हैं. सभी microbubbles सूक्ष्म सिरिंज, ट्यूबिंग या से बाहर हैं, जब तक कि के लिए, पहले सूक्ष्म सिरिंज सवार को हटा दें, तो चैनल के आउटलेट से जुड़ी शास्त्रीय प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग तरल धक्का, सूक्ष्म सिरिंज बाहर तरल प्रवाह करते हैं चिप, अंत में सवार वापस डाल दिया, और प्लास्टिक सिरिंज हाल चलाना. उपस्थिति ओmicrobubbles के आर अभाव एक खुर्दबीन के साथ सत्यापित किया जा सकता है.
- क्षैतिज ट्यूबिंग प्राप्त करने के लिए सिरिंज पंप स्तर. वांछित प्रवाह दर को सिरिंज पंप कार्यक्रम.
कठोर प्रणाली या वास्तविक प्रवाह दर को संशोधित कि प्रणाली के अनुपालन के लिए "अड़चन प्रभाव", जैसे संभव अस्थायी प्रभाव के बारे में पता हो. एक प्रणाली की विशेषता बार प्रणाली की सामग्री और आयामों के एक समारोह के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है. (अध्याय 2, पीपी 77-81, Tabeling, 2005)
- खुर्दबीन मंच पर माइक्रोचिप प्लेस और पंप शुरू. मध्यम वेग प्रोफाइल पर प्रणाली जांचना और डीटी (स्पंदित छवियों के बीच का समय) को ठीक करना कणों के साथ पानी का प्रयोग करें.
कण एक अच्छे संबंध के लिए 11 फ्रेम के बीच 5 और 10 के बीच पिक्सल बढ़ना चाहिए. औजार हैं, तो चैनल के बीच में मापने के लिए सावधान रहना होगा. बीच में फोकस विमान सर्वोच्च हैवेग 8.
एक दौर चैनल का उपयोग करते हैं, प्रभाव ग्रहण के सावधान रहना.
एक नमूना छवि शीर्ष छवि पहले नाड़ी है और नीचे की छवि दूसरी नाड़ी है, जबकि एक स्पंदित कैमरे का उपयोग कर, चित्रा 2 में दिखाया गया है. यह प्रतिभाशाली अंक (कणों fluorescing) फोकस में सबसे अधिक हैं कि चित्र में देखा जा सकता है.
- वैकल्पिक: अलग अलग ऊंचाई पर डेटा लेने से एक 3 डी वेग प्रोफाइल एक ही छवि में विभिन्न वैक्टर जोड़कर खंगाला जा सकता है. वीडियो प्रक्रिया के स्वचालन के लिए विकसित किया गया था कि एक नियमित प्रस्तुत करता है.
- खून से डेटा ले जा रहा है, पानी के रूप में एक ही विधि में रक्त की वांछित मात्रा के साथ सिरिंज भरें. वांछित प्रवाह दर को सिरिंज पंप कार्यक्रम, और इच्छित डेटा ले. प्राप्त कच्चे छवियों का एक उदाहरण चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. साथ ही आरबीसी अवसादन से सावधान रहें. सिरिंज Refilling हर रन या हरअन्य रन आरबीसी के निपटाने कम हो जाएगा.
- छवियों को प्राप्त करने के बाद, पार सहसंबंध छवियों के बीच वेग वेक्टर क्षेत्रों प्राप्त करने के लिए छवि जोड़े पर किया जाता है. यह एक अच्छा संबंध है अच्छा छवियों के लिए महत्वपूर्ण है. Correlating इससे पहले, पूर्व प्रसंस्करण पृष्ठभूमि शोर को दूर करने के लिए किया जा सकता है.
क्रॉस सहसंबंध आकार और सह - संबंध को प्रभावित करने के लिए आकार में अलग किया जा सकता है, जो आसन्न छवियों, में खिड़कियों के बीच किया जाता है. पार सहसंबंध के बाद, छवि पोस्ट प्रोसेसिंग गलत वैक्टर या outliers के दूर करने के लिए किया जा सकता है.
विभिन्न उपलब्ध विकल्पों और उनके accuracies की एक विस्तृत वर्णन पिट्स एट अल में पाया जा सकता है. (2012b), रक्त के लिए सबसे अच्छा प्रसंस्करण खिड़कियों लंबाई में विस्तार के साथ "छवि अतिव्यापी" की विधि हो पाया और प्रवाह के साथ गठबंधन किया था, जहां . इन आपरेशनों में MATLAB की तरह, या अपने सिस्टम के साथ सॉफ्टवेयर पैकेज के भीतर एक कार्यक्रम में मैन्युअल रूप से किया जा सकता है. सॉफ्टवेयर महत्वपूर्ण नहीं है, अभियान के पीछे गणित अधिक महत्वपूर्ण है और एक ऑपरेशन के अंतिम वेग प्रोफाइल की शुद्धता को प्रभावित कर सकते हैं.
परिणामस्वरूप वैक्टर एक औसत, प्रतिनिधि वेग प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए तात्कालिक वेग प्रोफाइल प्राप्त है, और फिर समय में फिर से औसतन करने के लिए चैनल के पार अंतरिक्ष में औसतन किया जा सकता. Kloosterman एट अल. (2011) क्षेत्र की गहराई बड़ी है जहां μPIV माप में त्रुटि का एक विवरण दे. यहाँ प्रस्तुत डाटा प्रोसेसिंग की त्रुटि पर चर्चाएँ उच्च गति के मापन के लिए स्पंदित माप और Chayer एट अल. (2012) के लिए पिट्स एट अल. (2012b) में पाया जा सकता है.
वेग प्रोफाइल के उदाहरण आंकड़े 3 और 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. चित्रा 3 एच में आरबीसी की एक 10 μl / घंटा प्रवाह के centerline के लिए एक ही वेग प्रोफाइल एक 140 मीटर चौड़ा चैनल में = 10 प्रस्तुत करता है.
तम्बू "> यह एकल प्रोफाइल एक वेग प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए चैनल के पार सहसंबद्ध वैक्टर औसत से हासिल की है, और फिर एक प्रतिनिधि माप पाने के लिए समय में औसत है. इस मामले में, 100 जोड़े को देखने के क्षेत्र भर में समय में औसतन थे.30 μl / घंटा की एक प्रोग्राम प्रवाह की दर के साथ एक 100 माइक्रोन वर्ग चैनल में एक पानी अंशांकन प्रवाह के लिए ले लिया 3 डी खंगाला प्रोफाइल का एक उदाहरण चित्रा 4 में पाया जाता है. चित्रा 4 में, प्रोफाइल 1 माइक्रोन अंतराल पर मापा जाता है.
- वैकल्पिक: सेट अप दर्शाया उच्च गति छवियों में स्विचिंग कैमरे (और डाटा अधिग्रहण प्रणाली) द्वारा एक ही परिस्थितियों में लिया जा सकता है. इस चैनल में सेल मुक्त परत दृश्यमान करने के लिए, और एकत्रीकरण बढ़ाता के लिए उपयोगी हो सकता है. डेटा विश्लेषण (Chayer एट अल., 2012) से थोड़ा अलग है.
साथ और आरबीसी एकत्रीकरण के बिना सफेद प्रकाश छवियों के उदाहरण prese हैंएच = 20 में चित्रा 5 में nted. शीर्ष छवियों कुल करने के लिए आरबीसी की क्षमता को हटा पीबीएस, में एच = 20 1 μl / घंटा पर पता चलता है. नीचे की छवि 0.5 μl / घंटा पर देशी प्लाज्मा में एच = 20 है. नीचे की छवि में, एकत्रीकरण दिख रहा है.
- माप पूरा कर लिया गया जब एक सुरक्षित तरीके से सिस्टम को बंद कर दें. लेजर शक्ति के स्रोत पूरी तरह से बंद है जब तक उचित लेजर सुरक्षा प्रक्रियाओं का प्रयोग करें.
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Representative Results
सभी आंकड़े में, प्रवाह कच्चे छवियों, और गणना वेग प्रोफाइल में ऊपर की तरफ से सही करने के लिए छोड़ दिया है. हेमाटोक्रिट एच = 10 10 μl / घंटा पर बह पर खून से प्राप्त कच्चे डेटा का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. कच्चे डेटा वेग प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए किसी भी डाटा प्रोसेसिंग के बिना पार सहसंबद्ध किया जा सकता है. पूर्व प्रसंस्करण और डेटा प्रसंस्करण विधियों का प्रभाव पिट्स, एट अल., (2012b) से चर्चा की है. Hematorcrit एच में 2 चित्रा के समान डेटा से एक परिणामी वेग प्रोफाइल का एक उदाहरण = 10 और 10 μl / घंटा की एक प्रवाह दर चित्रा 3, 4 चित्र दिखाया गया है पानी अंशांकन से एक 3 डी प्रोफ़ाइल में दिखाया गया है. चित्रा 3 और 4 मानक शामिल डाटा प्रोसेसिंग. ये वेग प्रोफाइल ऐसे चैनल के केंद्र में अधिकतम वेग, चैनल में प्रवाह की दर, और विभिन्न प्रवाह की स्थिति के लिए दीवार पर कतरनी दर, चैनल सह के रूप में माप बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैnfigurations, और physiologies. चित्रा 5 के साथ और आरबीसी के एकत्रीकरण के बिना एक उच्च गति छवि का एक उदाहरण देता है. ऐसे चित्रा 5 में उन के रूप में उच्च गति छवियों को भी पार सहसंबंध का उपयोग कर वेग प्रोफाइल की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1. (क) के प्रवाह को सही करने के लिए छोड़ दिया चलती है और (ख) पूरी प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है के साथ PDMS की गढ़े 40 माइक्रोन आयताकार चैनलों से 140 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है जहां μPIV सेट अप का आरेख.
चित्रा 2. 10 के एक प्रोग्राम प्रवाह दर पर पीबीएस में एच = 10 के साथ μPIV प्रणाली से कच्चे स्पंदित छवि डेटा जिसके परिणामस्वरूप(दाएं से बाएं बह) घंटा / μl. शीर्ष छवि पहले नाड़ी है.
चित्रा 3. एच के साथ μPIV प्रणाली से वेग प्रोफाइल परिणामस्वरूप 10 μl / घंटा की एक प्रोग्राम प्रवाह दर पर पीबीएस में = 10. प्रोफ़ाइल उर्ध्व प्रवाह को दिखाने के लिए घुमाया जाता है.
4 चित्रा. 1 माइक्रोन अलग कर लिया एकाधिक प्रोफाइल के साथ एक 100 माइक्रोन वर्ग चैनल में पानी अंशांकन की एक खंगाला 3 डी वेग प्रोफाइल का उदाहरण है. प्रोफ़ाइल उर्ध्व प्रवाह को दिखाने के लिए घुमाया जाता है. क्लिक करेंयहाँ बड़ा आंकड़ा देखने के लिए.
चित्रा 5. उच्च गति छवियों जहां प्रमुख का उदाहरण है) एच = 1 μl / घंटा पर पीबीएस में 20 (कोई एकत्रीकरण) और नीचे) है एच 0.5 μl / घंटा (एकत्रीकरण) में देशी प्लाज्मा में = 20. दोनों छवियों प्रवाह में सही करने के लिए छोड़ दिया है .
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Discussion
Microcirculation के पैमाने पर रक्त प्रवाह मापन के लिए μPIV का प्रयोग प्रासंगिक, जैव चिकित्सा यांत्रिक और रासायनिक इंजीनियरिंग प्रक्रियाओं की एक बड़ी संख्या में जानकारी दे सकते हैं. के लिए खाते में महत्वपूर्ण कारकों में से कुछ आरबीसी खुद को, fluorescing सूक्ष्म कणों की आरबीसी, एकत्रीकरण या आंदोलन के एकत्रीकरण और विरूपता, और चैनलों में आरबीसी के निपटाने के घनत्व हैं. इन सभी के ऊपर से बाहर रखी सामान्य दिशा निर्देशों का पालन कर रहे हैं के लिए जिम्मेदार हो सकता है. इस प्रणाली का उपयोग अच्छा मापन के लिए मन में रखने के लिए एक बुनियादी चेकलिस्ट है. सबसे पहले, अनुपालन प्रणाली या प्रस्तावित प्रणाली में कितना है निर्धारित करते हैं. अनुपालन संभव ट्यूबिंग की कम से कम राशि और छोटी संभव सिरिंज का उपयोग कम करने के लिए. कठोर सिस्टम कम अनुपालन किया है, लेकिन bottlenecking हो सकती है. माप के छोटे पैमाने के बावजूद, गुरुत्वाकर्षण आरबीसी प्रभावित करेगा. एक ही ऊंचाई पर सिरिंज, ट्यूबिंग और चैनल में रखते हुए मैंआदर्श. दूसरे, निलंबन की सांद्रता निर्धारित करते हैं. वहाँ पर्याप्त समाधान में ट्रेसर कण fluorescing और आरबीसी की एकाग्रता की बहुत अधिक नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें. एक नमूना की दरियाफ्त कणों का घनत्व बढ़ाने से लाल रक्त कोशिकाओं के निहित अस्पष्टता को दूर नहीं होगा. ट्रेसर कणों की मात्रा के संबंध को प्रभावित करेगा, लेकिन बहुत अधिक लाल रक्त कोशिकाओं होने छवि को अपारदर्शी तरल पदार्थ और ट्रेसर कण मुश्किल कर देगा. नमूना के समग्र hematocrit के चैनल के बीच विमान को स्पष्ट रूप से imaged किया जा सकता है कि काफी कम रखा जाना चाहिए. इस hematocrit और चैनल के आकार के बीच एक व्यापार बंद है. एक वृद्धि की गहराई में, लेंस और माप के विमान बीच में आरबीसी की मात्रा भी कम hematorcrit में, बढ़ता है. आरबीसी की अपारदर्शी आंतरिक आरबीसी के एक हिस्से के लिए साफ तरल पदार्थ (सुनार और Skalak, 1975) के साथ बदल रहा है जबकि छवि उच्च hematorcrit नमूने या बड़े चैनलों के क्रम में, "भूत कोशिकाओं" विधि का उपयोग किया जा सकता है. तीसरा, यह सुनिश्चित करें कि microscoपे चैनल के बीच विमान पर ध्यान दे रहा है. चैनल की सही ऊंचाई को जानने बीच विमान को खोजने के लिए महत्वपूर्ण है. मन में कणों और चैनल के आकार के आकार को रखें, और अपने सिस्टम (Wereley एट अल., 1998) में सहसंबंध (डॉक्टर) की गहराई की गणना. डॉक्टर बहुत बीच विमान को खोजने में प्राप्त करने के लिए आवश्यक शुद्धता को प्रभावित कर सकते हैं. एक माइक्रोन के अन्तर को प्रतिकूल शुद्धता को प्रभावित कर सकते हैं. कणों की मात्रा एक बार, चैनल के आकार, और डॉक्टर पाए जाते हैं, स्पंदित छवियों (डीटी) के बीच के समय में अंतर को निर्धारित करने की आवश्यकता है. खिड़कियों के बीच कणों के आंदोलन के 5 से 10 पिक्सल सुनिश्चित करें. कणों के आंदोलन खंड 3.9 में उल्लिखित सहसंबंध खिड़कियों में फिट होगा. अंत में, पूर्व प्रसंस्करण, प्रसंस्करण या वेक्टर डेटा के बाद के प्रसंस्करण की विधि के बारे में फैसला. कई तरीकों साहित्य में उपलब्ध हैं, लेकिन रक्त के लिए लागू जब कुछ दूसरों की तुलना में अधिक सफल रहे हैं. "छवि अतिव्यापी" की विधि आईटी क्षेत्रों हैरक्त प्रवाह (पिट्स एट अल., 2012b) के लिए ised.
मन में रखने के लिए एक और पहलू को अच्छी तरह microhemodynamics में दर्ज़ है जो "सेल मुक्त" परत है. इस चैनल या पोत की दीवार में लाल रक्त कोशिकाओं की कमी है. Fluorescing ट्रेसर कणों के बाद में, उपयोगकर्ता वास्तव में प्लाज्मा के आंदोलन का पीछा कर रहा है. चैनल या पोत के केंद्र में है, वेग एक अधिकतम पर है और दोनों एक ही गति से आगे बढ़ जाएगा. कुछ या कोई लाल रक्त कोशिकाओं में उपस्थित हो जाएगा, जबकि दीवार पर, प्लाज्मा अभी भी आंदोलन होगा. 10X आवर्धन के साथ यहां प्रस्तुत पैमाने पर, सेल मुक्त परत measureable नहीं है लेकिन उच्च आवर्धन पर इसके लिए जिम्मेदार होना चाहिए. उच्च गति वीडियो सेल मुक्त परत की मोटाई की माप के लिए अनुमति होगी.
निष्कर्ष
μPIV शीघ्र ही इसके विकास के बाद के बाद से hemorheology और जैव चिकित्सा अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. पैमाने पर रक्त प्रवाह को लागू करते हैंmicrocirculation में की, खून की जटिल व्यवहार के लिए जिम्मेदार होना चाहिए. Microchannels में रक्त प्रवाह की μPIV मापन के लिए एक प्रोटोकॉल रक्त की जटिल प्रकृति के साथ निपटने के लिए सुझावों के साथ साथ यहां पेश किया गया. कई इमेजिंग विकल्प स्पंदित छवियों, उच्च गति छवियों और एक 3 डी विकल्प के साथ ही डाटा प्रोसेसिंग जानकारी सहित, रेखांकित किया गया. रक्त microflow अनुसंधान के लिए μPIV का उपयोग करने में, दवाओं, रोगों और वेग प्रोफाइल के आकार पर चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का विश्लेषण किया जा सकता है. पोषक तत्वों और दवाओं के तेज के बाद से आधुनिक चिकित्सा और इंजीनियरिंग के लिए उपयोगी इन मापों कतरनी निर्भर है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों प्रारंभिक रन, में उसकी मदद के लिए धन, कैथरीन Pagiatikis लिए NSERC (प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग परिषद) को धन्यवाद देना चाहूंगा सुरा अबू Mallouh और प्रोटोकॉल, LaVision के रिचर्ड Prevost, तकनीकी सहायता के लिए उद्योग जगत, परीक्षण के लिए फ्रेडरिक फहीम और Dalsa उच्च गति कैमरा के ऋण के लिए मॉन्ट्रियल विश्वविद्यालय के लड़के Cloutier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
References
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