Summary
एयरवे सिलिया गतिशीलता और सिलिया उत्पन्न प्रवाह माउस श्वासनली का उपयोग कर visualizing और बढ़ाता के लिए एक आसान और विश्वसनीय तकनीक का वर्णन किया है. इस तकनीक कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला औषधीय एजेंटों, आनुवांशिक कारक, पर्यावरण जोखिम, और / या ऐसे बलगम लोड के रूप में यांत्रिक कारकों सहित, सिलिया गतिशीलता को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Abstract
Mucociliary निकासी समारोह में अंतर्दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण चलता - फिरता cilia समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इमेजिंग माउस एयरवे epithelia के लिए एक पूर्व vivo तकनीक स्थापित किया गया है. हौसले से काटा माउस ट्रेकिआ trachealis मांसपेशियों के माध्यम से अनुलंबीय कटौती और एक गिलास तली पकवान पर एक उथले घिरी कक्ष में रखा गया है. श्वासनली नमूना अनुलंबीय कर्ल trachealis मांसपेशियों का लाभ लेने के लिए अपने लंबे अक्ष के साथ तैनात है. इस पूरे सांस की नली लंबाई के साथ प्रोफ़ाइल में सिलिअरी गति की इमेजिंग की अनुमति देता है. 200 फ्रेम / सेकंड पर वीडियो सिलिया हरा आवृत्ति और सिलिअरी तरंग की मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी और एक उच्च गति डिजिटल कैमरे का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. इमेजिंग के दौरान फ्लोरोसेंट मोती के अलावा के साथ, सिलिया उत्पन्न द्रव का प्रवाह भी निर्धारित किया जा सकता है. प्रोटोकॉल समय चैम्बर तैयारी के लिए 5 मिनट के साथ लगभग 30 मिनट, नमूना के लिए 5-10 मिनट तक फैलाबढ़ते, और videomicroscopy के लिए 10-15 मिनट.
Introduction
एयरवे epithelia में चलता - फिरता cilia समारोह का विश्लेषण mucociliary निकासी और फेफड़े के स्वास्थ्य 1 को प्रभावित कर सकते हैं कि आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों elucidating के लिए प्रयोगात्मक महत्वपूर्ण है. इमेजिंग माउस एयरवे epithelia के लिए विकसित सरल प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती और पीटकर माउस मॉडल में airway सिलिया गतिशीलता पूछताछ के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है और माउस सांस की नली ऊतक विच्छेदन और उच्च संकल्प videomicroscopy साथ airway सिलिया गतिशीलता के पूर्व vivo इमेजिंग में केवल बुनियादी कौशल की आवश्यकता होती है. इस प्रोटोकॉल heterotaxy 2-5 से जुड़े जन्मजात हृदय रोग के साथ म्यूटेंट में चलता - फिरता cilia समारोह का तेजी से मूल्यांकन (सिलिया हरा आवृत्ति, सिलिया हरा आकार, सिलिया उत्पन्न प्रवाह) की अनुमति देने के लिए एक बड़े पैमाने पर माउस mutagenesis के स्क्रीन के दौरान स्थापित और परिष्कृत किया गया.
एयरवे सिलिया गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल वर्तमान तकनीकों तीव्र पूर्व vivo प्रकार या लंदन या तो में बांटा जा सकताइन विट्रो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में प्रासंगिकता शब्द. एक्यूट प्रयोगों पूर्व vivo मानव नाक / एयरवे ब्रश बायोप्सी के दृश्य 6,7 और सरल अनुप्रस्थ एयरवे वर्गों 8 का विश्लेषण शामिल हैं. में इन विट्रो दृष्टिकोण ऐसी हवा तरल इंटरफेस संस्कृतियों या एयरवे निलंबन संस्कृतियों 9-11 के रूप में विभेदित रोमक epithelia की चादरें उत्पन्न करने के लिए विभिन्न सेल कल्चर तकनीक का उपयोग. किसी भी उपयोगी रोमक उपकला कोशिकाओं प्रयोग (4-6 सप्ताह 9,10) के लिए उत्पादन कर रहे हैं हालांकि, इससे पहले इन एयरवे epithelia reciliation तकनीक समय और प्रशिक्षण में बहुत महत्वपूर्ण निवेश की आवश्यकता होती है. Airway उपकला ब्रश बायोप्सी की तीव्र पूर्व vivo विश्लेषण सामान्यतः मानव नैदानिक अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, इस विधि exacerbated यांत्रिक ऊतक चोट 12 की वजह से माउस अध्ययन में प्रयोग करने योग्य नहीं है.
समझौता ज्ञापनों के विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकई सांस की नली एयरवे epithelia निष्पादित करने के लिए ही सरल नहीं है, लेकिन यह विशेष विच्छेदन कौशल और न ही videomicroscopy द्वारा इमेजिंग के लिए उन मानक के अलावा किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. इस सरल प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं. माउस ट्रेकिआ ऊतक फसल प्रदर्शन करने के लिए त्वरित और आसान है के रूप में सबसे पहले, यह चूहों की एक बड़ी संख्या में airway सिलिया समारोह का तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. यह इन विट्रो उपचार में अलग से अल्पकालिक प्रभाव के तीव्र विश्लेषण शामिल कर सकते हैं. दूसरा, एक पूर्व vivo तकनीक जा रहा है, रोमक एयरवे उपकला यह समर्थन ऊतकों अंतर्निहित के साथ संलग्न रहता है और इस तरह जुड़े सेल संकेत दे रास्ते बरकरार रहती है. इसलिए इन विट्रो reciliated एयरवे epithelia में की तुलना में, इस तैयारी विवो ऊतक वातावरण में प्राकृतिक का एक बेहतर प्रतिनिधित्व है. तीसरा, इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है चलता - फिरता सिलिया च का वस्तुपरक मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं कि विभिन्न मात्रात्मक मापदंडों के एक नंबर का अधिग्रहणगर्मजोशी. अंत में, एयरवे सिलिया दृश्य के लिए अन्य मौजूदा तरीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल सिलिया हरा के उच्च संकल्प इमेजिंग और metachronal लहर पीढ़ी के लिए इष्टतम है कि सिलिया की प्रोफाइल देखने के लिए अनुमति देता है, सिलिया हरा दिशा को सही कोण पर सिलिया के दृश्य के लिए अनुमति देता है .
इस प्रोटोकॉल ऐसे औषधीय एजेंटों, आनुवांशिक कारक, पर्यावरण जोखिम, और / या के एयरवे cilia समारोह और पीढ़ी / रखरखाव पर इस तरह के बलगम लोड के रूप में यांत्रिक कारकों की भूमिका के रूप में प्रयोगात्मक आवश्यकताओं की एक विस्तृत श्रृंखला का पता करने के तरीकों की एक संख्या में संशोधित किया जा सकता है एयरवे सिलिया हरा और metachronal लहर प्रसार.
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Protocol
1. अभिकर्मकों सेटअप
1.1 विच्छेदन और इमेजिंग मध्यम
लेबोविट्ज़ एल 15 मध्यम (L15) ट्रेकिआ नमूनों की फसल और इमेजिंग दोनों के दौरान प्रयोग किया जाता है एफबीएस (10%) और पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों / पेनिसिलिन जी सोडियम और स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट की 100 ग्राम / मिलीलीटर की मिलीलीटर) के साथ पूरक है.
2. उथला दीवारों संस्कृति चैंबर विधानसभा
ट्रेकिआ ऊतक पकड़ इस्तेमाल चैम्बर चित्र 1 में दिखाया गया है. कक्ष के फर्श गिलास 35 मिमी संस्कृति डिश तली का है. कक्ष के ऊपर और साइड ग्लास पकवान पर 0.3 मिमी मोटी सिलिकॉन चादर का एक छोटा सा टुकड़ा डाल द्वारा उत्पन्न होता है. चादर के किनारे दौर नीचे पकवान फिट काट रहा है और केंद्र आगे (कदम 2.1-2.3 देखें) एक उथले केंद्रीय कक्ष फार्म करने के लिए छंटनी की है. इस विधानसभा के शीर्ष पर, एक 18 मिमी दौर गिलास को कवर पर्ची इमेजिंग के लिए उपयुक्त एक संलग्न कक्ष उत्पन्न करने के लिए रखा गया है.
- पूरी तरह से 0.3 मिमी मोटी सिलिकॉन कनवास के एक वर्ग के साथ एक 18 मिमी दौर गिलास को कवर पर्ची कवर.
- मानक तेज विच्छेदन कैंची कवर पर्ची (सिलिकॉन कनवास के एक परिपत्र परत में जिसके परिणामस्वरूप) के किनारे के आसपास से अधिक सिलिकॉन कनवास बंद ट्रिम के साथ.
- एक तेज छुरी बाहर कट और कवर कवर पर्ची (इस प्रकार इमेजिंग कक्ष के ऊपर और पक्षों बनाने) के बीच में से सिलिकॉन कनवास (लगभग 10 मिमी वर्ग) के एक केंद्रीय वर्ग को हटाने के साथ.
3. श्वासनली हार्वेस्ट और तैयारी
- स्थानीय संस्थागत जानवरों की देखभाल के अनुसार चूहों euthanize और समिति और / या सरकारी दिशा निर्देशों का उपयोग करें और डूब के ऊतकों को पर्याप्त L15 मीडिया (लेखक के माध्यम से, बस हमल दिन 16.5 पर जन्म से पहले ही चूहों का इस्तेमाल किया है के साथ एक मानक प्लास्टिक 35 मिमी संस्कृति डिश में श्वासनली को दूर , नवजात नवजात और वयस्क जानवरों 2).
- के बाहर से जुड़ी गैर श्वासनली जुड़े ऊतक निकालेंकुंद विच्छेदन का उपयोग कर ट्रेकिआ.
- बस सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (चित्रा 2A, लाइन 1) का उपयोग मुद्रिका उपास्थि नीचे एक अनुप्रस्थ काट साथ गला निकालें.
- सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (चित्रा 2A, लाइन 2) का उपयोग सिर्फ सड़ा हुआ ऊपर एक अनुप्रस्थ काट साथ छोड़ दिया और सही प्राथमिक ब्रोन्कियल शाखाओं निकालें.
- धीरे ठीक संदंश के साथ ट्रेकिआ पकड़ और किसी भी बलगम और खून स्पष्ट करने के लिए एक P1000 Pipetman और P1000 के टिप के साथ स्नान l15 के माध्यम से ~ 1 मिलीलीटर के साथ लुमेन 2-3 बार फ्लश.
- सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (चित्रा 2B, लाइन 1) के साथ एक अनुप्रस्थ काट का उपयोग कर श्वासनली की 3-4 अंगूठी खंड काट दिया.
- सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (चित्रा 2B, लाइन 2) का उपयोग करते हुए इस छोटे से ट्रेकिआ खंड के trachealis मांसपेशियों के बीच के माध्यम अनुलंबीय काटें.
- सूक्ष्म विच्छेदन कैंची (चित्रा -2 का उपयोग कर सांस की नली उपास्थि के छल्ले के बीच के माध्यम अनुलंबीय कट चित्रा 2 डी में दिखाया गया है) छोड़ने>, लाइन),.
4. सिलिया इमेजिंग
- स्थानांतरण ट्रेकिआ ऊतक क्षेत्रों, एल 15 मध्यम से 100-200 μl के साथ एक 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति पकवान के बीच पर नीचे लुमेन ओर,.
- सिलिया उत्पन्न प्रवाह ट्रेकिआ ऊतक नमूना (~ 1 एक्स 10 11 कणों / मिलीलीटर या Fluoresbrite 2.5% जलीय microsphere निलंबन के 20 μl / एमएल) स्नान एल 15 मध्यम करने फ्लोरोसेंट 0.20 माइक्रोन की एक छोटी राशि microspheres के जोड़ यों.
- सिलिकॉन चादर में कटौती खिड़की द्वारा गठित उथले घिरी कक्ष के मध्य में स्थित श्वासनली नमूने के साथ, इमेजिंग चैम्बर नीचे श्वासनली नमूना सिलिकॉन चादर पक्ष के शीर्ष पर (ऊपर 1-3 प्रक्रिया देखें) पहले से तैयार रखें (चित्रा 1 ).
- धीरे जगह में सुरक्षित करने के लिए coverslip पर नीचे धक्का और किनारों usin से किसी भी अतिरिक्त एल -15 मीडिया को दूरगा P1000 टिप और P1000 Pipetman.
- 100X उद्देश्य और डीआईसी प्रकाशिकी के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति पकवान और श्वासनली नमूना माउंट.
- एक उच्च गति कैमरा और फिल्म अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 200 पर सिलिया गतिशीलता की फिल्मों इकट्ठा + की रोमक सांस की नली epithelia साथ फ्रेम प्रति सेकंड (चित्रा 2 डी बॉक्स, ई दिये: दर्ज की फिल्म से उदाहरण अभी भी छवि) trachealis पेशी के किनारे कर्ल करवाने (पूरक मूवी 1).
- FITC epifluorescent इमेजिंग और एक कम रोशनी सीसीडी कैमरा (ऊपर उपकरणों की सूची देखें) का उपयोग करना, सिलिया उत्पन्न प्रवाह (पूरक मूवी 2) के बाद मात्रा का ठहराव की अनुमति के लिए रोमक सांस की नली epithelia की सतह भर में फ्लोरोसेंट microsphere आंदोलन की फिल्मों इकट्ठा.
5. सिलिया गतिशीलता के quantitation
- ImageJ सॉफ्टवेयर पैकेज में डीआईसी छवि फिल्में लोड और मैं द्वारा वर्णित तकनीक का पालनऐन ड्रमंड 13 पिटाई सिलिया को पार एक रेखापुंज लाइन आकर्षित करने के लिए लाइन उपकरण का उपयोग करें. इस लाइन का एक "reslice" रेखा के पार सिलिया आंदोलन एक लहर पैटर्न उत्पन्न करता है, जहां एक kymograph प्रकार छवि उत्पन्न करता है. प्रत्येक लहर के शिखर के बीच पिक्सेल की संख्या उन्हें मापा (एक पिक्सेल = एक फिल्म फ्रेम) प्रति मिनट धड़कता है (यानी हर्ट्ज) की संख्या तो गणना की जा सकती है जिसमें से है.
- ImageJ सॉफ्टवेयर पैकेज में सिलिया उत्पन्न प्रवाह लोड फ्लोरोसेंट मनका फिल्मों को मापने, और मैन्युअल श्वासनली epithelia की सतह भर में फ्लोरोसेंट मोती ट्रैक और सॉफ्टवेयर पर नज़र रखी प्रत्येक मनका के लिए मनका वेग और दिशात्मकता उत्पन्न करने MTrackJ प्लगइन 14 उपयोग करने के लिए.
पिटाई सिलिया से दूरी के रूप में प्रवाह यों को दृढ़ता से मापा प्रवाह परिमाण को प्रभावित कर सकते फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग करते समय ध्यान रखा जाना चाहिए. पूरक 2 मूवी में मनका आंदोलन इस बात का एक अच्छा उदाहरण है. इस उदाहरण मनका मेंआंदोलन पिटाई सिलिया की सतह पर तेजी से और काफी दूर आगे स्नान मीडिया में मोती के लिए दूर चला जाता है. इस के लिए नियंत्रित करने के लिए, मनका ट्रेसिंग ही सही तुलना किए जाने की अनुमति देने के लिए सभी नमूनों में रोमक epithelia ऊपर एक निश्चित दूरी पर एकत्र होना चाहिए. अंत में, द्रव प्रवाह पर प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए, मोती संभव के रूप में लंबे समय के रूप में लिए नज़र रखी जानी चाहिए, हम तरल प्रवाह की गणना के लिए 10 + रोमक कोशिकाओं को कवर किया है कि मनका पटरियों का उपयोग करना पसंद करते हैं.
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Representative Results
फिल्म प्लेबैक 100% है, सिलिया हरा (पूरक 2 मूवी की दिशा में ध्यान देने योग्य प्रवाह के साथ, नियंत्रण एयरवे सिलिया स्पष्ट रूप से दिखाई और एक समन्वित तरीके (फिल्म प्लेबैक 15% वास्तविक समय के लिए धीमा है पूरक मूवी 1) में हरा करने के लिए देखा जाना चाहिए ) समय असली. सिलिया फिल्मों के quantitation चित्रा 3 में देखा है कि इसी तरह के परिणाम उपज चाहिए. फ्लोरोसेंट मोतियों की ट्रैकिंग सिलिया उत्पन्न प्रवाह वेग की माप (चित्रा 3 डी) के लिए अनुमति देता है, जबकि उच्च गति डीआईसी फिल्मों का संग्रह, संभव सिलिया हरा आवृत्ति (चित्रा -3 सी) की मात्रा का ठहराव बनाता है और सिलिया हरा आकार के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए अच्छा छवियों देता है और दिशात्मकता (चित्रा 3E).
हम रैखिक प्रवाह की एक सूची देने के लिए दिशात्मकता का उपयोग करें. दिशात्मकता एक फ्लोरोसेंट मनका (यानी कम से कम से कूच कुल विस्थापन विभाजित करके गणना की हैदूरी के अनुसार अनुरेखण के शुरू और अंत अंक) पूरे ट्रेस पर एक फ्लोरोसेंट मनका चाल के बीच की दूरी. एक सीधे रास्ते से बड़े पैमाने पर चकरा देने वाली एक फ्लोरोसेंट मनका 1 की तुलना में बहुत कम एक दिशात्मकता होगा, जबकि इस प्रकार, एक सीधी रेखा में चलती है एक फ्लोरोसेंट मनका एक से एक दिशात्मकता होगा.
हम सिलिया हरा समारोह में किसी भी ध्यान देने योग्य परिवर्तन के साथ एक घंटे के लिए नमूने imaged है.
चित्रा 1. संस्कृति पकवान सेटअप और श्वासनली नमूना स्थिति के बढ़े सममितीय दृश्य. नायब: coverslip और सिलिकॉन चादर संस्कृति डिश में श्वासनली नमूना डालने से पहले इकट्ठा किया जाना चाहिए.
चित्रा 2. (प्रक्रिया को देखने के लेबल के विवरण के लिए 3.2-3.8 कदम) अंतिम छवि परिणाम (ई) के लिए एक अक्षुण्ण ट्रेकिआ (ए) से शुरू होने वाले इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक माउस ट्रेकिआ विच्छेदन का उदाहरण है. ई. में स्केल सलाखों के 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. ई में स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3. पूर्वानुमानित परिणाम प्रोटोकॉल द्वारा तैयार के रूप में एक जंगली प्रकार माउस ट्रेकिआ नमूना का उपयोग कर प्राप्त यहाँ वर्णित है. एक उच्च गति डीआईसी फिल्म (प्रतिनिधि डीआईसी फिल्म के लिए पूरक फिल्म 1 देखें) से (ए) एकल फ्रेम. (बी) के आंदोलन पटरियों की surfa भर में चार फ्लोरोसेंट मोतीएक सांस की नली epithelia नमूना के CE (प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट फिल्म के लिए पूरक फिल्म 2 देखें). (सी) सिलिया हरा आवृत्ति उच्च गति डीआईसी सिलिया गतिशीलता फिल्में (6 माउस tracheas से n = 41 यादृच्छिक बिंदु माप) से मात्रा. (डी) प्रवाह गति और (ई) प्रवाह दिशात्मकता सांस की नली epithelia नमूने (6 माउस tracheas से n = 31 फ्लोरोसेंट मनका ट्रेसिंग) की सतह भर में फ्लोरोसेंट मनका आंदोलन ट्रैकिंग से मात्रा. डेटा मतलब ± SEM के रूप में विस्थापित है. स्केल सलाखों 10 माइक्रोन.
पूरक मूवी 1. सिलिया हरा आकार और सिलिया उत्पन्न प्रवाह दिखा डीआईसी फिल्म एक wildtype माउस ट्रेकिआ नमूना का उपयोग कर मनाया. पार्श्व 30 एफपीएस है जबकि फिल्म, 200 एफपीएस पर एकत्र की गई थी. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
पूरक मूवी 2. सिलिया जीई की फिल्मफ्लोरोसेंट microspheres और epifluorescent माइक्रोस्कोपी 0.20 माइक्रोन का उपयोग कर एक wildtype माउस ट्रेकिआ नमूना भर nerated प्रवाह. मूवी संग्रह और खेलने वापस 15 एफपीएस है. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
सिलिया हरा आवृत्ति का मापन (CBF) उच्च शक्ति माइक्रोस्कोप उद्देश्यों और तेजी से छवि अधिग्रहण हार्डवेयर 13,15 का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और CBF माप स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान mucociliary निकासी की जांच के ज्यादातर अध्ययनों के आधार के रूप में क्यों बताते हैं. CBF माप अकेले CBF की mucociliary निकासी, माप को समझने के लिए आवश्यक है, जबकि हालांकि, सिलिअरी उत्पन्न प्रवाह और, को मापने के लिए और अधिक कठिन अक्सर अनदेखी कर रहे हैं, जो दोनों के सिलिया हरा तरंग, दोनों की अंतर्निहित महत्व पर ध्यान नहीं देता, और CBF साथ सहसंबंधी नहीं हो सकता है. CBF वृद्धि हुई सिलिअरी उत्पन्न प्रवाह के साथ अनुरूप नहीं हो सकता है की वृद्धि हुई है की एक उदाहरण DNAH11 परिवर्तन के साथ कुछ रोगियों में देखा जाता है. DNAH11 एक axonemal dynein भारी श्रृंखला प्रोटीन, दोनों hyperkinetic (तेज) सिलिअरी हरा और mucociliary निकासी 16 के साथ समस्या पैदा की भविष्यवाणी की है कि असामान्य सिलिया हरा तरंग पैदा करने के लिए सूचित किया गया है जो में परिवर्तन है. significaहमारे प्रोटोकॉल के NT के लाभ यह सिलिया हरा आकार और सिलिया के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए इष्टतम है कि सिलिया की प्रोफाइल देखने के लिए अनुमति देता है, सिलिया हरा दिशा को सही कोण पर सिलिया की आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है की सतह भर में द्रव का प्रवाह उत्पन्न करता है इस प्रकार सिलिया हरा तरंग और / या सिलिया के साथ CBF की प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति पिटाई सिलिया, एक भी नमूना भीतर प्रवाह उत्पन्न.
इस तकनीक का एक और लाभ में है कि सिलिया है हौसले श्वासनली इस प्रकार CBF और सिलिया उत्पन्न प्रवाह के बीच आसान सहसंबंध की अनुमति, श्वसन उपकला की पूरी सतह भर में एक समन्वित तरीके से हरा करने की क्षमता बनाए रखने के लिए काटा. इस तरह के समन्वित सिलिअरी गति अक्सर खराब सरोम और यादृच्छिक दिशाओं 9,10 में सिलिया हरा दिखाने के जो reciliating माउस सांस की नली उपकला संस्कृतियों में नहीं मनाया जाता है. सांस की नली epithelia तकनीक का उपयोग कर मनाया समन्वित सिलिअरी हरा यहाँ वर्णित मैं करने के लिए साधन प्रदान कर सकते हैंसिलिअरी हरा समन्वय और mucociliary निकासी में अपने संभावित भूमिका को विनियमित तंत्र nterrogate.
शोध के लिए इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा श्वासनली सतह (चित्रा 2) से वसा और संयोजी ऊतक के समाशोधन सहित, ट्रेकिआ तैयारी हो, और अनुलंबीय trachealis मांसपेशी (चित्रा 2b, लाइन 2) के बीच के माध्यम से काटने जाएगा. हम ऊतक समाशोधन और बाद trachealisotomy दोनों के लिए जरूरी है अच्छा सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग कर सकते हैं. इसके अलावा, हम यहाँ trachealis मांसपेशी व्यापक है के रूप में यह आसान श्वासनली बाएँ और दाएँ प्राथमिक ब्रांकाई में bifurcates जहां कैरीना को सिर्फ पूर्वकाल श्वासनली के निचले हिस्से का उपयोग नहीं कर पाते. हालांकि, पर्याप्त अनुभव के साथ, श्वासनली के किसी भी लम्बाई, या वास्तव में प्राथमिक ब्रांकाई सिलिया गतिशीलता और सिलिया प्रवाह उत्पन्न की उच्च गुणवत्ता फिल्मों उत्पन्न करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है.
तकनीकी संभवइस प्रोटोकॉल से जुड़ी समस्याओं इमेजिंग और / या नमूना ध्यान में लाया जा करने में सक्षम नहीं होने के दौरान आगे बढ़ श्वासनली नमूना शामिल हैं. एल -15 बहुत अधिक नमूने के साथ जोड़ा जाता है और / या इमेजिंग कक्ष कवर पर्ची सुरक्षित रूप से नीचे दबाया नहीं किया गया था कि अगर इन समस्याओं के दोनों पैदा कर सकते हैं, यह नमूना नमूना आंदोलन में जिसके परिणामस्वरूप कवर पर्ची कक्ष या चल नमूना भीतर फ्लोट करने का कारण बनता है ऊपर फोकस विमान फोकस असंभव बना रही है. इससे बचने के लिए यह प्रत्येक श्वासनली नमूना माउंट करने के लिए इस्तेमाल तरल की मात्रा कोशिश करते हैं और कम करने के लिए महत्वपूर्ण है.
इस तकनीक का एक संभव सीमा सिलिया उत्पन्न द्रव प्रवाह की माप है कि पूरी तरह से विवो mucociliary परिवहन में मेल नहीं हो सकता है. ~ 10 माइक्रोन / सेकंड की सिलिया उत्पन्न प्रवाह की हमारी खोज विवो माउस ट्रेकिआ 17 में उपयोग कर रिपोर्ट 100 माइक्रोन / सेक mucociliary परिवहन की तुलना में काफी कम है. इस अंतर को शायद ऑप के रूप में मीडिया में जलमग्न होने सिलिया की वजह से हैबस हवा तरल इंटरफेस भर में बलगम की एक पतली परत के लिए आगे बढ़ osed. फिर भी, इस विधि के विभिन्न नमूनों के बीच सिलिअरी गतिशीलता के रिश्तेदार की तुलना के लिए बड़ी उपयोगिता है.
यह यहां प्रस्तुत प्रयोगात्मक तकनीक और डेटा कमरे के तापमान पर आयोजित किया गया है, जबकि तापमान खुद सिलिया गतिविधि को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. मानव नाक और सांस की नली के नमूनों में CBF रैखिक 20-45 डिग्री सेल्सियस के बीच 18 देखा CBF में एक छोटे से वृद्धि के साथ, 5-20 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान के साथ सहसंबद्ध किया जा देखा जाता है. हम माउस एयरवे नमूने (अप्रकाशित टिप्पणियों) में तापमान और CBF के बीच एक समान संबंध देखते हैं. उपन्यास उत्परिवर्ती चूहों में सिलिया गतिशीलता में संभव दोषों का त्वरित आकलन के लिए कमरे के तापमान पर हम रिकॉर्ड सिलिया गतिविधि इस प्रकार, जबकि, हम भी शारीरिक शर्तों के तहत सिलिया गतिविधि का निर्धारण करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कुछ नमूने सेते हैं. यह एक मानक माइक्रोस्कोप ऊष्मायन चर्चा को पूरा करने के लिएएम्बर 37 नमूनों में बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
इस प्रोटोकॉल के लिए सरल संशोधनों यह इस तरह के औषधीय एजेंटों की भूमिका, तापमान, आनुवांशिक कारक, पर्यावरण जोखिम, और / या ऐसे बलगम लोड के रूप में यांत्रिक कारकों जैसे कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला से एयरवे सिलिया गतिविधि के विनियमन का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाना होगा एयरवे cilia समारोह और पीढ़ी / एयरवे सिलिया हरा के रखरखाव पर.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
परियोजना राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान से NIH अनुदान U01HL098180 द्वारा समर्थित किया गया था. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है और रक्त संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
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