Summary
Mänskliga tumörxenografter i immundefekta möss är värdefulla verktyg för att studera cancerbiologi. Specifika protokoll för att generera subkutan och intrahepatiska xenografter från humana hepatocellulär cancer celler eller tumörfragment beskrivs. Lever förnyelse inducerad av partiell hepatektomi i mottagarländerna möss presenteras som en strategi för att underlätta intrahepatisk engraftment.
Abstract
In vivo experimentella modeller av hepatocellulär cancer (HCC) som sammanfatta den mänskliga sjukdomen ger en värdefull plattform för forskning om sjukdomar patofysiologi och för den prekliniska utvärderingen av nya behandlingsmetoder. Vi presenterar en mängd olika metoder för att generera subkutan eller orthotopic mänskliga HCC implanterad i immundefekta möss som skulle kunna användas i en mängd olika forskningsansökningar. Med fokus på användning av primärtumörvävnad från patienter som genomgick kirurgisk resektion som utgångspunkt beskriver vi framställningen av cellsuspensioner eller tumörfragment för Xenografting. Vi beskriver specifika tekniker att xenotransplantat dessa vävnader i) subkutant, eller ii) i levern, antingen genom direkt implantation av tumörceller eller fragment in i levern, eller indirekt, genom injektion av cellerna in i musmjälte. Vi beskriver även användningen av partiell resektion av den nativa muslever vid xenografting som en strategi för attinducera aktiv leverregeneration i mottagarens mus som kan underlätta intrahepatisk inympning av primära humana tumörceller. De förväntade resultaten av dessa tekniker illustreras. De protokoll som beskrivs har validerats med hjälp av primära humana HCC prover och xenografter, som vanligtvis utför mindre robust än de väletablerade mänskliga HCC cellinjer som ofta används och ofta citerade i litteraturen. I jämförelse med cellinjer, vi diskuterar faktorer som kan bidra till den relativt låga risken för primär HCC engraftment i xenotransplantation modeller och kommenterar tekniska frågor som kan påverka kinetiken för xenograft tillväxt. Vi föreslår också metoder som bör tillämpas för att säkerställa att xenografter erhållits exakt likna moder HCC vävnader.
Introduction
Hepatocellulär cancer (HCC) är den femte vanligaste cancerformen i världen och den snabbast växande orsaken till cancerdöd i Nordamerika. Den mest förekommande riskfaktorn för HCC är levercirros, vanligast förekommande på grund av kronisk viral hepatit, alkoholmissbruk, autoimmun sjukdom eller ärftliga ämnesomsättningsrubbningar 1.
Trots den tunga sjukdomsbördan tas ut av HCC på populationer över hela världen, är patofysiologin för HCC relativt dåligt känd i jämförelse med andra vanliga cancerformer som kolorektal-, bröst-eller prostatacancer. Exempelvis specifika molekylära och cellulära händelser kör tumorigenesis står att definieras tydligt 2. Liksom de flesta andra fasta epithelial cancer, har genomiska metoder avslöjade heterogenitet i avvikelser i samband med HCC 3. Ett antal studier har visat oordnad aktivitet av olika signalvägar som är involverade i celltillväxt, surlevnad, differentiering och angiogenes 4. Dessutom förblir den roll som cancerstamceller i HCC patobiologi förtydligas 5.
Med en begränsad förståelse för HCC patofysiologi har arsenalen av effektiva behandlingar för HCC också varit relativt begränsade. Tidigt skede patienter med tumörer begränsade till levern är kandidater för botande behandling med hjälp av tumör ablation eller kirurgisk resektion, men återfall är vanligt. För patienter med mer avancerad sjukdom, kemoterapi och strålning är av begränsad effekt och används främst för sjukdomskontroll med palliativ avsikt 6.
Hög kvalitet in vivo experimentella modeller av mänsklig HCC ger därmed en värdefull plattform för välbehövlig grundforskning om patofysiologin för mänskliga HCC samt för utvärdering av nya behandlingsmetoder. Jämfört med användningen av cellinjer eller mycket definierade musmodeller, xenotransplantat av PRImary mänskliga tumörer i immundefekta möss har visat sig vara värdefulla verktyg för sådana studier eftersom de kan rekapitulera den mänskliga sjukdomen med hifi samtidigt fånga den heterogenitet som finns inom och mellan olika patienter 7,8. Därför har vi utvecklat en rad olika metoder för att upprätta mänskliga HCC implanterad i immundefekta möss. Medan majoriteten av publicerade studier med HCC xenografter beskriver användningen av väletablerade mänskliga HCC cellinjer för detta ändamål, har vi fokuserat på att optimera våra analyser att generera xenografter från primär HCC prover som erhållits omedelbart efter kirurgisk resektion av patienter.
Olika xenografting tekniker kan krävas för olika forskningsansökningar. Till exempel är subkutana xenografter genereras från tumörfragment genererade snabbt, lätt övervakas, och kan vara mer lämplig för lokal förvaltning av nya behandlingar med praktiskövervakning av tumörrespons. Intrahepatisk xenografter kan vara mer relevant för studier som rör den roll som levermikromiljö i HCC biologi. Xenografter genereras från tumör cellsuspensioner är nödvändiga för identifiering och karakterisering av tumör initiera cellgrupper eller för experiment som kräver in vitro-manipulationer av tumörceller före xenotransplantation. Vi har därför utvecklat och validerat följande protokoll för att upprätta subkutan eller intrahepatiska xenografter från cellsuspensioner eller tumörfragment som härrör från primära mänskliga HCC exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En schematisk översikt av det protokoll som anges i fig 1.
1. Behandling av Human HCC Prov
Skaffa primära mänskliga HCC prover med skrift patientens samtycke och med godkännandet av den institutionella forskningsetisk nämnd. Dessa protokoll har genomförts vid vår institution med godkännande från University Health Network Research Ethics styrelsen i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd.
Samla färska HCC prover så snart som möjligt efter det kirurgiska ingreppet när lämpliga prover har tagits för kliniska ändamål. Helst bör detta ske inom 30 min efter avlägsnande av vävnad från patienten. Som visas i figur 2, är ett prov på minst 1 cm 3 erhålls från periferin av tumören optimal, eftersom den centrala delen av tumören kan vara nekrotisk.Tumörer som inte har fått någon behandling innan resektion såsom strålning, kemoterapi, eller ablation är att föredra för att maximera chansen att tumörceller är livskraftiga. Handtag primära mänskliga vävnader enligt standard personliga skyddsprotokoll för biologiskt material. Utför alla laboratorie manipulationer av tumörvävnader och cellpreparat i en klass II biosäkerhet skåp med aseptisk teknik.
- Placera den färska HCC provet i 10-25 ml serumfritt Dulbeccos Modified Eagle Medium / Ham 's F12 vid 4 ° C och överför på is till laboratoriet för omedelbar bearbetning och beredning av vävnadsfragment och / eller celler för Xenografting i möss.
- Med hjälp av steril pincett, placera tumören provet i en 100 mm x 20 mm petriskål eller annan lämplig steril arbetsyta. Dela upp tumören provet i fragment av ca 2-3 mm 3 med hjälp av en No.10 kirurgisk skalpell blad. Vid denna punkt, anser snap-frysning eller formalin fastställande sissa tumörfragment för andra experiment eller analyser som krävs.
- För xenografting av tumörfragment, placera några av de HCC-fragment i en eller flera mikrocentrifugrör innehållande tillräckligt med Matrigel för att medge fragmenten förblir nedsänkt. Behåll dessa rör på is.
- För beredning av en tumörcellsuspension, använd kirurgisk skalpell blad för att finhacka den kvarvarande HCC vävnaden så mycket som möjligt och blanda med 5-10 ml DMEM-F12 i en 50 ml koniska rör beroende på volymen av det malda vävnaden.
- Lägg typ IV-kollagenas och dispas II vid slutkoncentrationer av 200 enheter / ml och 0,8 enheter / ml. Pipet blandningen upp och ned väl med användning av en 25 ml pipett.
- Försegla röret och inkubera blandningen från steg 1,6 vid 37 ° C i en 5% koldioxidinkubator under 30-60 min beroende på mjukheten hos tumörvävnad. Pipet blandningen upp och ner några gånger var 10: e minut för att bedöma utvecklingen av enzymatisk nedbrytning.
- Efter digestion är klar passerar tumören lösningen genom ett 100 | im cellfilter. Mosa försiktigt resterande vävnad på cellfilter med användning av en 25 ml pipett spets för att möjliggöra den maximala antalet tumörceller att passera igenom. Samla den ansträngda cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera tumörcellsuspension vid 1200 varv per minut under 5 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera försiktigt supernatanten. Beroende på storleken av pelleten, tillsätt 2-5 ml iskall 1x av röda blodkroppar (RBC) lysbuffert och försiktigt pipettera upp och ner för att resuspendera pelleten. Håll på is i 5 min.
- Lägg DMEM-F12 till en total volym av 15 ml och centrifugera vid 1000 rpm under 5 min vid 4 ° C för att tvätta ur den RBC-lyseringsbuffert.
- Dekantera försiktigt supernatanten och suspendera RBC fria tumörcellpellet i DMEM-F12.
- Räkna livskraftiga celler med användning av trypanblått-uteslutning antingen manuellt eller med en automatiserad cellräknare.
- Centrifugera tumörcell alikvoter innehållande den önskade number av celler för injektion, såsom beskrivits ovan, återsuspendera den erhållna cellpelleten i 30 | il iskall Matrigel och förvara på is.
Valfritt: Efter steg 1,11, vi rutinmässigt bryter humana CD45 +-celler (leukocyter) från bulktumörcellsuspension och / eller rening av delmängder av tumörceller med hjälp av flödescytometri eller immunomagnetiska pärlor. Detaljerade protokoll för dessa tekniker är väl beskrivs av tillverkarna av de aktuella antikropparna, pärlor och flödescytometrar.
Anmärkning: Det protokoll som beskrivits ovan kan också användas för att behandla humana tumörxenotransplantat som skördats från möss för att utföra seriell transplantation, insätta xenograft vävnad för primära humana HCC vävnad i steg 1,1. I denna situation, efter steg 1,11, vi rutinmässigt bryter infiltrerande murina celler från cellsuspension med användning av en antikropp mot mus histocompatibility antigen H2k.
2.Xenografting
Genomför alla djurförsök i enlighet med protokoll som godkänts av den institutionella djurvård kommitté. De förfaranden som beskrivs här har fullgjorts enligt ett särskilt djur Använd protokoll godkändes av University Health Network Djurvård kommittén i enlighet och överensstämmelse med alla tillämpliga och institutionella organ, förordningar och riktlinjer.
Utrustning för leverans av inhalationsanestetika flyktiga anestesimedel för små djur bör utnyttjas i enlighet med standardrutiner för djuranläggningen och forskningsinstitut. Utför alla kirurgiska ingrepp med aseptisk teknik och sterila instrument i en klass II biosäkerhet skåp. Utnyttja icke-överviktiga diabetiker svår kombinerad immunbrist (NOD / SCID) eller NOD / SCID / interleukin 2 receptor gamma kedja null (NSG) stammar av möss av båda könen vid 6-8 veckors ålder (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Dessamöss måste hållas och hållas i en anläggning som kan ge patogenfria förhållanden som är lämpliga för immundefekta djur.
Förbered möss för operation i en kammare, som levererar 5% (volym / volym) inhaleras isofluran i ett L / min av syre. Upprätthålla anestesi tills det är förlust av ögon-och tå reflex i djuret (s). För subkutan xenografting, rakning en eller flera små områden på dorsum av djuret (n) och rengör huden med 70% etanol. För intrahepatisk xenografting rakas den ventrala bröstkorgen och buken hos djuret (er) från armhålan ner till den inguinala regionen och rengöra huden med 70% etanol.
2.1 Subkutan implantation av tumörfragment
- Placera sövda mus benägen, bibehålla inhalativ isoflurananestesi (2% (volym / volym) i 1 L / min O 2) med ett munstycke. Applicera Tear-gel för att skydda djurets ögon från traumatisk skada.
- Sterilisera rygg rakade området (s) med Betadinekirurgisk scrub följt av 70% etanol och slutligen med povidon-jodlösning.
- Gör en 5 mm snitt i huden med hjälp av sterila vass sax.
- Sätt i ett stängt trubbig sax försiktigt in i subkutana utrymmet och sprids försiktigt för att utveckla en ficka stor nog att rymma ett tumörfragment.
- Sätt i tumörfragment beredd i steg 1.3 i den subkutana fickan med hjälp av sterila fin pincett.
- Stäng snitt huden med suturer eller klämmor.
- Ge postoperativ vård till musen som beskrivs nedan.
2,2 Subkutan injektion av tumörceller
- Förbered djur som beskrivs i steg 2.1.1 och 2.1.2.
- Ladda upphävandet av tumörceller i Matrigel utarbetats i steg 1.13 in en insulinspruta med en 29 G 1/2 i nålen.
- Stick in nålen i den subkutana utrymmet och beviljar innehållet i sprutan. Vidare nålen flera millimeter längs den subkutana planet bort frOM huden punktionsstället förhindrar läckage av tumörcellsuspension av punktionsstället vid uttag av nålen.
- Ge postoperativ vård till musen som beskrivs nedan.
2,3 Intrahepatisk Implantation av tumörfragment
- Med hjälp av en 27 G 1/2 i nål på en 1 ml spruta, administrera 350 | il steril normal saltlösning subkutant i dorsum av anestetiserade djurets hals för att kompensera för intraoperativa vätskeförluster. För analgesi, administrera 350 | il av steril normal koksaltlösning innehållande buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant på djurets flank, med användning av en 27 G 1/2-tums nål på en 1 ml spruta.
- Placera musen på rygg på en i förväg uppvärmd dyna med näsa och mun är placerad inuti munstycket för att leverera underhålls inhalativ isoflurananestesi (2% (volym / volym) i 1 L / min O 2).
- Förläng benen och fäst dem med tejp till rörelseytan för att optimera exponeringen avden ventrala buken och bröstkorgen.
- Utför proceduren under en förstoringslampa för att optimera visualisering.
- Sterilisera den rakade huden på den ventrala delen av buken och bröstkorgen med Betadine kirurgiska scrub följt av 70% etanol och slutligen med povidon-jodlösning.
- Använda sterila vass sax, gör en tvärgående bilateralt subcostal hud snitt och dela upp muskelskikten att komma in i bukhålan för att möjliggöra adekvat exponering av hela levern.
- Placera ett stygn i huden ovanför xiphoid processen och säkra den till munstycket med tejp för att möjliggöra en bättre exponering av levern och omgivande strukturer.
- Använd två bomullspinne applikatorer angränsande och posteriort till levern för att stabilisera den.
- Gör ett snitt 3 mm i längd och djup på ytan av levern med användning av en steril nr 10 skalpellblad.
- Omedelbart tillämpa Surgicel och lätt tryck på snittet platsen för att uppnå hemostas, ta bort efter 60-90 sekoch fortsätt endast om fullständig hemostas har uppnåtts.
- Placera en tumörfragment steg 1.3 till levern snitt med sterila fin pincett eller med en 18 G nål.
- Applicera en liten bit av Surgicel över levern snitt för att förhindra förskjutning av tumörfragment och säkerställa fortsatt hemostas.
- Stäng snitt med suturer eller klämmor.
- Ge postoperativ vård enligt nedan
2.4 Intrahepatisk Implantation av tumörceller genom direkt injektion i levern
- Förbered musen som beskrivs i steg 2.3.1 till 2.3.7 ovan.
- Fyll på tumörcellsuspension (framställd i steg 1,13) i en insulinspruta med hjälp av en 29 G 1/2 i nålen.
- Med levern stabiliseras med hjälp av en bomullspinne applikator, för in insulininjektionsnålen i levern och avancera spetsen några millimeter utanför punktionsstället längs en subkapsulär plan.
- Ansvarsfrihet försiktigt innehållet i sprutan och thöna bort nålen från levern.
- Placera Surgicel över stickstället och tryck lätt med en bomullspinne för att förhindra läckage av tumörcellsuspension och för att uppnå fullständig hemostas.
- Stäng snitt med suturer eller klämmor och ger postoperativ vård, såsom beskrivs nedan.
2.5 Intrahepatisk Xenografting tumörceller via injektion i mjälten
- Förbered musen som beskrivs i steg 2.3.1 till 2.3.5 ovan.
- Använda sterila vass sax, gör en 1 cm kvar subcostal snitt för att komma in i bukhålan.
- Använd en bomullspinne för att spegla magen cranially och djurets högra sida för att exponera mjälten.
- Genom att hantera de omgivande fettvävnad med sterila fin atraumatisk pincett, leverera mjälten i snittet och placera en bomullspinne bakom mjälten för att stabilisera den.
- Använda 5-0 silke sutur, platsen lös pre-bundna knut runt mjälten över den nedre polen.
- Fyll på tumörcellsuspension (framställd i steg 1,13) i en insulinspruta med hjälp av en 29 G 1/2 i nålen.
- Sätt i insulininjektionsnålen i den nedre polen hos mjälten och föra den förbi nivån för den lösa förut bundna knut.
- Sakta ladda ur innehållet i sprutan, ta ut nålen från mjälten, och dra åt knuten för att förhindra läckage av det injicerade tumörcellsuspension.
- Ersätt mjälten in i bukhålan.
- Stäng snitt med suturer eller klämmor och ger postoperativ vård, såsom beskrivs nedan.
2.6 partiell hepatektomi för att underlätta Intrahepatisk Engraftment av human tumörvävnad
- Förbered musen som beskrivs i steg 2.3.1 till 2.3.7.
- Med sterila vass sax, dividera falciformligamentet fäst till median loben av levern.
- Med hjälp av en bomullspinne, mobiliseravänster lob i levern och position en lös pre-bundna knut 5-0 silke sutur runt vänster lob. För fram lös knut så nära som möjligt mot bilio-kärl pedicle av vänster lob och dra åt knuten.
- Punktskatter vänster lob distalt om ligatur med hjälp steril sax, lämnar en liten stump för att förhindra glidning på knuten och efterföljande blödning.
- Med användning av en liknande teknik, ligera och resekera majoriteten av median lob i levern, undvikande av gallblåsan.
- Använd Surgicel och lätt tryck med en bomullspinne längs Snittytorna i leverparenkym att uppnå fullständig hemostas.
- För intrahepatisk xenografting av en tumörfragment eller tumörceller, fortsätt med steg 2.3.8 till 2.3.11 och 2.4.2 till 2.4.5 såsom ovan beskrivits.
- För intrahepatisk xenografting av tumörceller via mjält injektion, utnyttja bomullspinne applikatorer för att försiktigt återspegla magen cranially och till djurets högra sida, exposing mjälten. Fortsätt med steg 2.5.4 till 2.5.9 såsom ovan beskrivits.
- Stäng snitt med suturer eller klämmor och ger postoperativ vård, såsom beskrivs nedan.
2,7 Postoperativ vård
- Ta bort musen från inhalationsanestesi munstycket.
- Placera musen i en bur under en värmelampa för ca 20 min tills återhämtat sig från anestesi och mobilisera fullt.
- Upprepa buprenorfin dos varje 8-12 timmar under de första 2-3 postoperativa dagarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar det typiska utseendet av en subkutan human HCC xenograft och motsvarande histopatologiska uppkomsten av tumören. Utveckling och tillväxt av subkutana xenografter kan lätt kontrolleras genom daglig granskning av mottagande möss. Tidsintervallet mellan xenografting och utveckling av en tumör kan variera mycket beroende på typen av vävnader (tumörfragment kontra cellsuspension), källa till vävnad (primär patientprov, passe xenograft eller cellinje), och mängden av vävnad implanteras ( antal celler eller storleken av tumörfragment). Till exempel, kan betydande xenografter utvecklas från injektions av 5 x 10 6 celler i en väletablerad HCC cellinje inom 1-2 veckor, medan 6 månader kan krävas för att utveckla en liknande xenograft från 1 x 10 5 celler erhållna från en primär tålmodig HCC prov. Vi har inte observerat subkutan xenograft bildning senare än 6 månader efter implantation av tumörprov, och därmed offra recipientmöss vid denna tidpunkt om xenografter inte har utvecklats.
Figur 4 visar de typiska framträdanden av intrahepatiska mänskliga HCC xenografter uppnås från direkt implantation av tumörvävnad i levern samt de som uppnås från injektion av tumörceller i mjälten. Intrahepatisk xenografter kan inte lätt upptäcks av allmän fysisk undersökning av mottagarens musen om tumören är mycket stor eller har resulterat i utvecklingen av ascites eller utspänd buk. Även små djur avbildningsmetoder såsom CT-skanning finns på vissa forskningsinstitut och kan användas för att noggrant förhöra levern hos mottagaren möss 11, anser vi inte att detta är ett allmänt gäller, praktisk eller kostnadseffektiv metod för de flesta forskare. Vi har observerat att den hastighet med vilken intrahepatiska xenografter utvecklar liknar den hastighet med vilken subcutaneooss xenografts utvecklas, och är på samma sätt påverkas av variabler såsom typ, källa, och mängden vävnad implanteras. Baserat på resultatet av subkutana xenografter härrör från samma modervävnaden som den som används för intrahepatiska xenografter, väljer vi en tidpunkt för offer av den mottagande musen och undersökning av levern om inte tydliga bevis på en stor intrahepatisk tumör är närvarande innan detta. Vi har observerat att tillsats av en partiell hepatektomi för intrahepatisk xenografting förfarande som användes förbättrar sannolikheten för att uppnå ympning av human tumörvävnad i muslever, men inte verkar för att accelerera hastigheten för xenograft tillväxt.
Tabell 1 sammanfattar tumörtransplantations priser uppnådda efter implantation av primära mänskliga HCC vävnader i immundefekta möss med hjälp av de olika tekniker som beskrivs i detta protokoll. För varje implantation metod nämnaren i upptagningshastigheten tumör reflekterar en unik hum en HCC prov. Dessa data visar att, för primära mänskliga HCC vävnader, subkutana transplantations priser är sämre än andelen intrahepatisk engraftment uppnåtts av intrasplenic tumörcellsinjektion eller intrahepatisk tumörfragment implantation, och att partiell hepatektomi tycks öka intrahepatisk engraftment. Trots att vi framgångsrikt har utnyttjat direkt cell injektion i muslever att generera intrahepatiska xenografter från väl etablerade humana HCC cellinjer (data visas inte), vi har inte genererat några intrahepatiska xenografter med denna metod genom att använda primära humana HCC prover trots användning av partiell hepatektomi .
Figur 1. Schematisk översikt av protokoll som visar arbetsflödet för bearbetning och beredning av HCC prov samt efterföljande xenografting alternativ (infälld).
544fig2.jpg "/>
Figur 2. Leverresektionskirurgi prov från en patient med levercellscancer. Hade Denna patient inte fått någon adjuvant terapi till tumören. Den vita rutan visar en livskraftig del av tumören nära periferin som erhölls för xenografting. Skala bar uppe till höger motsvarar 1 cm.
Figur 3. Humant hepatocellulärt karcinom xenograft genereras från subkutan injektion av tumörceller. A) Tumören kan lätt inses på höger flank hos djuret. B) Tumören sett att vara skild från de omgivande vävnaderna efter offra djuret. C) I histologi av tumören visar typiska funktioner i hepatocellulär cancer, inklusive hepatocyte-liknande celler med nukleär atypia och hög kärn-till-cytoplasma förhållande, avsaknad av portalfibros, och distorted trabeculae med ökad tjocklek av hepatocellulära plattor. Skala bar motsvarar 1 cm i panelerna A och B, och 100 nm i panel C. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Intrahepatisk humana levercellscancer xenografter. A) Xenograft genereras från implantation av en human tumörfragment i muslever. Intraparenkymal tumör visas med svart pil. Skala av härskare vid botten av fotografi i B) Xenograft genereras från injektion av humana tumörceller i musmjälte efter partiell hepatektomi cm.. Intraparenkymal tumör visas med svart pil. Skala bar motsvarar 1 cm. C) Histologi snitt genom marginal intrahepatisk xenograft demonstratning typiska drag av mänsklig hepatocellulär cancer (längst ned till höger) och angränsande normal muslever (överst till vänster). Skala bar motsvarar 100 nm. Klicka här för att visa en större bild .
| Implantationsstället | Implantation Metod | Tumör Take Rate |
| subkutan | cellsuspension | 6/55 (10,9%) |
| tumörfragment | 23/136 (16,9%) | |
| mjälte | cellsuspension | 3/15 (20%) * |
| cellsuspension + partiell hepatektomi | 6/14 (42,9%) * | |
| lever | tumörfragment | 6/13 (46,2%) |
| tumörfragment + partiell hepatektomi 2/3 (66,7%) | ||
| cellsuspension | inte utfört | |
| cellsuspension + partiell hepatektomi | 0/8 (0%) | |
| * Andelen prover som gav intrahepatiska tumörnoduli | ||
Tabell 1. Mänskliga HCC transplantations priser i immundefekta möss som motsvarar olika implantationsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett antal olika tekniker för att etablera subkutana och intrahepatiska human HCC-xenotransplantat i möss med immunbrist som kan appliceras på en mängd olika experimentella frågor och analyser. Medan subkutana xenotransplantat har ofta använts för att studera olika aspekter av HCC biologi, är intrahepatiska xenotransplantat sällan beskrivits i litteraturen. Dessutom har de flesta studier som beskriver användningen av xenografter genererade dessa från väl etablerade cellinjer. Med tanke på begränsningarna av cancercellinjer i modellering mänskliga tumörbiologi 12 har vi varit motiverade att validera de tekniker som beskrivs ovan med primär mänsklig HCC vävnader. Även om det inte stöds av statistiska analyser på grund av de små provstorlekar av försöksgrupperna, våra observationer subjektivt avslöja en övertygande trend mot förbättrad transplantations priser med tillägg av partiell hepatektomi för intrahepatisk implantation av tumörceller eller fragment. </ P>
De få studier som noggrant har försökt att utnyttja primär vävnader har uppnått framgångsrika subkutan ympning med endast en mycket liten del av de patientprover som erhållits 13-15. Vi har också observerat att den andel av primära humana HCC-sampel som framgångsrikt ympas i det subkutana utrymmet i immundefekta möss med användning av de tekniker som beskrivs ovan är begränsad till cirka 15%. I den mänskliga levern, HCC lesioner är hypervaskulära, får sin blodtillförsel främst via leverartären 16,17. Vi spekulerar att den låga engraftment andelen primär HCC vävnader som vi och andra har observerats kan vara ett resultat av sårbarhet färska HCC vävnader till den relativa hypoxi av mikromiljön i vilken de xenografted, utan etablerad arteriell försörjning. Känsligheten hos HCC-vävnader för snabb ischemisk nekros i intervallet mellan kirurgisk resektion och xenografting kan också account för den låga engraftment som uppnåtts i möss.
För generering av intrahepatiska mänskliga HCC xenografter från tumör cellsuspensioner, har vi funnit att injektion av celler i mjälten är en tekniskt fördelaktig metod som resulterar i överlägsen andelen lever inympning från primära humana HCC prover. Mjälten är en mycket vaskulariserad struktur som bättre kan stödja HCC-celler jämfört med andra platser i musen kroppen, och från vilken tumörceller verkar lätt resa in i levern via mjälten och portal ådror. I jämförelse med det leverparenkym, in i vilken det är tekniskt svårt att direkt injicera celler utan läckage eller blödning, har mjälten strukturell kapacitet för att rymma den volym av cellsuspensionen som injiceras, och lätt kan ligeras när tumörcellinjektion är klar. Injektion av cellsuspensioner direkt in i portvenen eller leverartären i 6-8 veckor gamla möss inte är tekniskt Feasgilla.
Vi har använt partiell hepatektomi i mottagarländerna möss för att underlätta intrahepatisk inympning av humana HCC vävnader. Även musmodeller av partiell hepatektomi har ofta använts för att studera biologi leverregeneration 18, är vi inte känner till några rapporter som beskriver den i kombination med intrahepatisk tumör xenotransplantation. Eftersom leverregenerering sker snabbt inom de första dagarna efter partiell hepatektomi, spekulerade vi att kraftigt förbättrad expression av mitogena och angiogena stimuli inom leverparenkym bättre skulle stödja engraftment och proliferation av sårbara human tumörvävnad eller celler implanteras i det återstående partiet av muslever, som jämfört med ett muslever i dess "vilo"-tillståndet 19. Hos människa är den största riskfaktorn för HCC utveckling avancerade lever fibros eller cirros, som kännetecknas av utveckling av oorganiserad regenerativ nejdules, och som har ett koncept av vissa som ett tillstånd av kronisk leverskada och förnyelse 20. De tekniker som vi har visat att engraft humana HCC vävnader i musen levern genom att aktivera leverregeneration kan visa sig vara en värdefull modell för att tillåta undersökning av den roll som levermikromiljön och lever regenerativa mekanismer i patofysiologin för HCC.
Även om de tekniker som beskrivs häri är i stånd att alstra högkvalitativa primära humana HCC-xenotransplantat i möss med immunbrist måste utredare överväger användningen av dessa protokoll överväga vissa begränsningar hos modellen. Först våra protokoll införliva minimal fördröjning mellan kirurgisk resektion av patientens vävnad och dess efterföljande behandling i laboratoriet, men ändå uppnå höga transplantationspriser har varit en utmaning, vilket tyder på att livskraftiga genomförandet av dessa tekniker kräver närhet av patientens vävnad insamlingsplats förlaboratorium, eller infrastruktur som kan minimera förseningar i överföringen av färska prover. För det andra måste komplicerade intraabdominella kirurgiska ingrepp på 6-8 veckor gamla immundefekta möss utföras av lämpligt utbildad personal för att uppnå överlevnad djuren i flera månader innan xenografts bildar, dessa förfaranden och efterföljande djuromsorg är både tids-och resurskrävande. Tredje, utveckling och progression av intrahepatiska xenotransplantat kan inte lätt övervakas utan att offra djur vid förutbestämda tidpunkter, vilket begränsar användbarheten av xenotransplantat i detta läge för vissa typer av analyser som angivits ovan. Dessutom kan intrahepatiska xenografter härrör från injektion av celler i mjälten presentera så många knölar utspridda i leverparenkym som är svåra att exakt kvantifiera i termer av total tumörbörda. Slutligen är det viktigt att notera att intrahepatiska tumörnoduli som framställs genom injicering av cellerna i mjälten kan väljativt reflektera specifika subpopulationer av celler som är kapabla att migrationen från mjälten till levern och efterföljande tumör initiering.
Vid generering xenografter från primära mänskliga HCC vävnader, är det också viktigt att bekräfta att de resulte xenografter likna HCC. Vi har tidigare visat att lymfom oavsiktligt kan utvecklas från passagerar leukocyter inom xenotransplanted mänskliga HCC vävnader 21. Vi därför rutinmässigt bryter humana CD45 + leukocyter från primära tumören cellsuspensioner och använda RT-PCR, flödescytometri, histopatologisk bedömning, och immunohistokemi för analys xenografter för egenskaper som är typiska för HCC. När ympa om etablerade xenografter för fortsatta studier, bör tumörinfiltrerande musceller också vara uttömda genom att använda en antikropp mot mus histokompatibilitetsantigenet H2k. Om forskningsansökan innebär användning av tumörfragment eller mätning av xenograft tillväxt, analys av xenografts vid studiens endpoint skall omfatta en bedömning av i vilken utsträckning tumörerna infiltrerats av humana leukocyter och musceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en kanadensiska Institutes of Health Research Phase 1 Kliniker Scientist Award (AG) och ett driftsbidrag från Cancer Research Society (AG). Författarna är tacksamma till Dr John Dick för hans stöd för detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
