在浅肤色紫外线敏感型人类的小鼠模型中，外用佛司可林可诱导表皮黑色素生成。通过药物调节皮肤中的cAMP水平以及表皮色素加深，能够显著防护紫外线引起的炎症反应（晒伤），该保护作用通过最小红斑剂量（MED）检测法进行测定。
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摘要
摘要
皮肤颜色深浅、紫外线敏感性以及皮肤癌风险均与黑皮质素1受体（Mc1r）的生理功能相关，该受体是一种位于黑素细胞表面的Gs偶联信号蛋白。Mc1r可激活腺苷酸环化酶并促进cAMP生成，进而上调黑素细胞中黑色素的合成。为了研究Mc1r信号通路保护皮肤免受紫外线损伤的机制，本研究采用了一种基于表皮干细胞因子（Scf）表达的“人源化皮肤”小鼠模型。K14-Scf转基因小鼠可在表皮中保留黑素细胞，因而具备在表皮沉积黑色素的能力。在此动物模型中，野生型Mc1r状态可导致大量真黑色素（eumelanin）沉积，并呈现抗紫外线表型；相反，Mc1r信号功能缺陷的K14-Scf小鼠则表现为红/金发色、皮肤中真黑色素极少，并具有紫外线敏感表型。我们推测，模拟Mc1r信号通路的外用制剂可能增强真黑色素的沉积，研究发现，将毛喉素（forskolin）提取物直接应用于Mc1r功能缺陷的浅肤色小鼠皮肤后，可显著诱导真黑色素生成并提供紫外线防护1。本文描述了制备和使用含毛喉素的天然根部提取物处理K14-Scf浅肤色小鼠的方法，并报告了通过测定最小红斑剂量（MED）来评估紫外线敏感性的实验方法。利用该动物模型，可进一步研究表皮cAMP诱导及皮肤黑素化对紫外线暴露所引发的生理反应的影响。
引言
黑色素瘤是皮肤癌中最致命的一种，其发病率在过去几十年中在美国显著上升，尤其在皮肤白皙的人群中更为明显。强有力的分子和流行病学证据表明，紫外线辐射是导致该病的主要环境因素2-5。日光暴露和日光浴床使用所导致的紫外线暴露增加，很可能是黑色素瘤发病率上升的主要原因6-7。黑色素瘤风险似乎与晒伤密切相关8，尤其是生命早期发生的晒伤9-10。晒伤风险不仅与紫外线暴露的剂量和强度有关，还受到遗传因素的影响，这些因素调控皮肤对紫外线辐射的反应。皮肤色素沉着是决定紫外线敏感性、晒伤风险以及癌症风险的最重要因素之一。与皮肤较深的人群相比，皮肤较浅者患黑色素瘤的频率大约高出二十倍11-13。
黑色素是由表皮中的黑素细胞产生的一种色素，是决定皮肤肤色的主要因素。黑色素主要有两种类型：（1）真黑色素，一种深棕色或黑色的色素，能有效吸收紫外线的能量；（2）褐黑色素，一种红黄色或浅黄色的色素，在阻止紫外线光子穿透皮肤方面效果较差。皮肤颜色、对紫外线的敏感性以及黑色素瘤的风险在很大程度上由表皮中真黑色素的含量决定14-15。表皮中的真黑色素越多，能够穿透进入皮肤的紫外线光子就越少。由于先天性真黑色素水平较低，皮肤白皙的个体更容易受到紫外线辐射的急性和慢性损害16-18。
皮肤色素沉着、黑色素瘤....
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方案
1. 从 Plectranthus barbatus (Coleus forskohlii) 植物粗根提取物制备用于局部给药的福斯科林
- 小鼠实验方案遵循动物护理和使用的伦理行为准则，并已获得肯塔基大学机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 # 00768M2004）。根提取物以标准皮肤病学基质（70% 乙醇，30% 丙二醇）配制成 40% 质量/体积浓度的溶液。
- 称取 200 g 粗 forskolin 根提取物并转移至烧杯中。为配制 500 ml 的 40% (w/v) 溶液，加入大部分但并非全部的溶剂（70% 乙醇，30% 丙二醇），使 200 g 粗 forskolin 根提取物重悬，总体积调至约 450 ml。
- 室温下搅拌 1 小时。溶液将具有一定黏度，可能需要手动搅动以“提升”提取物进入溶液，之后磁力搅拌子方可有效发挥作用。
- 搅拌 1 小时后，将混合液倒入量筒中，并使用先前用于搅拌浆液的烧杯的冲洗溶剂补足体积至 500 ml（以最大化回收烧杯中残留的 forskolin）。
- 将浆液转移至 50 ml 聚丙烯离心管中。使用台式离心机离心（1,500 × g，室温，15 分钟）。此时不溶性物质将较为紧密地沉淀，便于轻松倾出上清液。
- 通过 0.22 μm 醋酸纤维素膜滤器过滤溶液，以去除提取物中任何残留的不溶性物质。我们采用专为细胞培养设计的瓶顶式过滤系统，并配合使用滤器配套的预滤器，防....
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结果
C57BL/6小鼠在真黑素、褐黑素或无色素背景下产生，并携带K14-Scf转基因，具体方法如前所述（图1A）。肤色较浅的群体延伸（Mc1re/e, 酪氨酸+/+) 小鼠每日两次局部给予溶剂（70% 乙醇，30% 丙二醇）或 40% 粗提物 Coleus forskohlii 根提取物（80 μM 每剂量）连续5天（图2B）。通过肉眼观察和反射式比色法测定局部治疗对表皮色素沉着的影响（图1B）。根部提取物的应用与表皮显著变暗相关 K14-Scf 转基因背景下出现，但在基因匹配的非转基因动物中未出现。我们对这些结果的解释是：表皮间黑素细胞必须存在，才能使药理诱导产生的黑色素沉积于表皮。尽管该根提取物因含有 forskolin 以外的植物化学成分而呈现深色，但皮肤变黑不能单纯归因于药物的染色效应，因为非转基因动物在使用该根提取物后并未表现出皮肤变黑现象图1B）。当以每日两次的方式局部使用 forskolin 时，.......
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讨论
利用一种模拟白皙人皮肤的动物模型，我们发现局部应用富含 forskolin 的粗根提取物可通过刺激皮肤黑色素的生成，显著加深表皮色素沉着。表皮黑化依赖于基底层表皮中干细胞因子（stem cell factor）的表达，这一机制存在于人类皮肤中，但在未经基因改造的小鼠皮肤中并不存在。未经基因改造的小鼠背部皮肤缺乏足够数量的表皮间黑色素细胞，因而无法赋予皮肤色素。只有在持续表达黑色素细胞生长因子（如干细胞因子（kit 配体）或肝细胞生长因子（HGF））的条件下，黑色素细胞才能在整个动物生命周期中保留在表皮基底层50-51。我们所用的模拟白皙人皮肤的动物模型，是将 K14-Scf 转基因导入 C57BL/6 小鼠的 extension 色素变异品系中构建而成。尽管任何年龄的动物均可使用，我们的实验通常采用年轻成年小鼠（4–12 周龄）。由于黑皮质素 1 受体（Mc1r）发生截短突变，导致 cAMP 信号通路丧失，extension 小鼠在毛发和皮肤中（在 K14-Scf 或 HGF-Met 转基因状态下）优先表达褐黑色素（pheom.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢 Malinda Spry 提供的技术支持。我们同时感谢当前及以往的资助机构：美国国家癌症研究所（R01 CA131075，R01 CA131075-02S1）、Wendy Will Case 癌症研究基金、Markey 癌症基金会、儿童奇迹网络以及 Jennifer 和 David Dickens 黑色素瘤研究基金会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 20% 酚妥拉明提取物 | Buckton Scott USA Inc. | n/a | 新泽西州普林斯顿 |
| 异氟烷，USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | 美国俄亥俄州都柏林 |
| 赛拉嗪 | Anased 注射液 | LA04612 | 美国爱荷华州申多阿 |
| 盐酸氯胺酮，USP | Putney | NDC 26637-411-01 | 美国密苏里州圣约瑟夫 |
| 乙醇 | Decon Labs. | 2705 | |
| 丙二醇 | Adesco | 05751L | 美国俄亥俄州索伦 |
| 脱毛膏，Nair | Church & Dwight | JF-11 4381322 | 新泽西州普林斯顿 |
| 仪器 | |||
| 杀菌用 Hg 灯 UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| 辐射计光度计 | International Light | 1LT400A | 美国马萨诸塞州皮博迪 |
| 色差计 | Konica Minolta | CR-400 | 美国新泽西州拉姆齐 |
| 色差计 CR-400 数据处理器 | Konica Minolta | DR-400 | 美国新泽西州拉姆齐 |
参考文献
- D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
- Gallagher, R. P., et al.
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重印与许可
