Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक humanized माउस मॉडल में एपिडर्मल मेलेनिन और संरक्षण के खिलाफ सनबर्न की pharmacologic प्रेरण

Published: September 7, 2013 doi: 10.3791/50670
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2,3,4
1The Markey Cancer Center, University of Kentucky College of Medicine, 2Graduate Center for Toxicology, University of Kentucky College of Medicine, 3Department of Molecular and Biomedical Pharmacology, University of Kentucky College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Kentucky College of Medicine

Summary

एपिडर्मल मेलेनिन निष्पक्ष चमड़ी यूवी संवेदनशील मानव का एक murine मॉडल में forskolin की सामयिक आवेदन से प्रेरित है. न्यूनतम erythematous खुराक (मेड) परख द्वारा मापा के रूप में दृढ़ता से यूवी की मध्यस्थता सूजन (धूप की कालिमा) के खिलाफ की रक्षा darkening त्वचा और एपिडर्मल में शिविर के स्तर की pharmacologic हेरफेर.

Abstract

त्वचा, यूवी संवेदनशीलता और त्वचा कैंसर के खतरे की निष्पक्षता सभी melanocortin 1 रिसेप्टर की शारीरिक समारोह, melanocytes की सतह पर पाया एक जी एस युग्मित संकेत प्रोटीन के साथ सहसंबंधी. MC1R बारी में, त्वचा में मेलेनिन के melanocytic उत्पादन को नियंत्रित करता है, जो adenylyl साइक्लेस और शिविर उत्पादन को उत्तेजित करता है. MC1R संकेतन यूवी चोट के खिलाफ त्वचा की रक्षा करता है जिसके द्वारा तंत्र का अध्ययन करने के लिए, इस अध्ययन स्टेम सेल कारक (एससीएफ) की एपिडर्मल अभिव्यक्ति पर आधारित "humanized त्वचा" के साथ एक माउस मॉडल पर निर्भर करता है. K14-एससीएफ ट्रांसजेनिक चूहों में melanocytes बनाए रखने के इसलिए एपिडर्मिस और बाह्य त्वचा में मेलेनिन जमा करने की क्षमता है. इस पशु मॉडल में, काले eumelanin वर्णक और एक यूवी संरक्षित phenotype की मजबूत बयान में जंगली प्रकार MC1R स्थिति आती है. इसके विपरीत, दोषपूर्ण MC1R संकेत क्षमता का प्रदर्शन एक गोरा / लाल रंजकता, त्वचा में बहुत कम eumelanin और साथ K14-एससीएफ जानवरोंएक यूवी संवेदनशील फेनोटाइप. कि eumelanin बयान तर्क MC1R संकेतन कि नकल स्थानीय एजेंटों से बढ़ाया जा सकता है, हम MC1R-दोषपूर्ण गोरी चमड़ी वाले चूहों की त्वचा को forskolin निकालने के प्रत्यक्ष आवेदन मजबूत eumelanin प्रेरण और यूवी संरक्षण 1 में परिणामस्वरूप. यहाँ हम तैयारी और K14-एससीएफ गोरी चमड़ी वाले चूहों को एक forskolin युक्त प्राकृतिक जड़ निकालने लागू करने और न्यूनतम erythematous खुराक (मेड) निर्धारित करने से यूवी संवेदनशीलता को मापने के लिए एक विधि की रिपोर्ट के लिए विधि का वर्णन. इस पशु मॉडल का उपयोग करना, यह त्वचा की एपिडर्मल शिविर प्रेरण और melanization यूवी जोखिम को शारीरिक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कैसे अध्ययन करने के लिए संभव है.

Introduction

मेलेनोमा की घटनाओं, त्वचा कैंसर का सबसे घातक रूप है, विशेष रूप से गोरी चमड़ी वाले व्यक्तियों के बीच, संयुक्त राज्य अमेरिका में पिछले कई दशकों में नाटकीय वृद्धि हुई है. मजबूत आणविक और महामारी विज्ञान के सबूत एक प्रमुख प्रेरणा का पर्यावरणीय कारक 2-5 के रूप में पराबैंगनी विकिरण implicates. सूरज जोखिम और कमाना बिस्तर प्रयोग के रूप में वृद्धि की यूवी जोखिम मेलेनोमा घटनाओं 6-7 में वृद्धि के ज्यादा के लिए जिम्मेदार होने की संभावना है. मेलेनोमा जोखिम विशेष रूप से sunburns 8, जीवन 9-10 में जल्दी विशेष रूप से उन लोगों के साथ जुड़ा हुआ लगता है. धूप की कालिमा के जोखिम खुराक और यूवी जोखिम की तीव्रता, लेकिन यह भी पराबैंगनी विकिरण से त्वचा संबंधी प्रतिक्रिया को प्रभावित करती है कि विरासत में मिली कारकों से न केवल जुड़ा हुआ है. त्वचा pigmentation यूवी संवेदनशीलता का सबसे महत्वपूर्ण निर्धारकों में से एक, धूप की कालिमा और कैंसर के खतरे का खतरा है. मेलेनोमा अंधेरे चमड़ी individua की तुलना में प्रकाश चमड़ी व्यक्तियों में लगभग बीस गुना अधिक बार होता है11-13 रास.

मेलेनिन, एपिडर्मिस में melanocytes द्वारा उत्पादित एक रंग, त्वचा के रंग का मुख्य निर्धारक है. (1) eumelanin, पराबैंगनी विकिरण की ऊर्जा को अवशोषित करने में प्रभावी एक गहरे भूरे / काले रंग, और (2) pheomelanin, त्वचा में यूवी फोटॉनों के प्रवेश को रोकने में कम प्रभावी एक लाल / गोरा वर्णक: मेलेनिन दो प्रमुख किस्मों में आता है. त्वचा का रंग, यूवी संवेदनशीलता और मेलेनोमा जोखिम काफी हद तक एपिडर्मल eumelanin सामग्री 14-15 से निर्धारित होते हैं. एपिडर्मिस में अधिक eumelanin, कम यूवी फोटॉनों त्वचा में घुसना कर सकते हैं. क्योंकि eumelanin के निम्न जन्मजात स्तरों के, गोरी चमड़ी वाले व्यक्तियों और अधिक प्रवण पराबैंगनी विकिरण 16-18 की तीव्र और जीर्ण प्रभाव के लिए कर रहे हैं.

त्वचा pigmentation, मेलेनोमा जोखिम और करने के लिए "तन" यूवी प्रदर्शन के बाद सभी melanocortin 1 ग्राही (MC1R) का सिगनल की क्षमता के साथ सहसंबंधी, एक जी एस युग्मित सात transmembrane क्षमताmelanocytes 19-22 पर urface रिसेप्टर. MC1R अपने आत्मीय उच्च समानता ligand, α-मेलानोसाईट उत्तेजक हार्मोन (α-MSH) बांधता है, दूसरा दूत शिविर 23 adenylyl साइक्लेस और उत्पादन की सक्रियता है. यूवी प्रदर्शन के बाद त्वचा की सामान्य शारीरिक प्रतिक्रिया केरेटिनकोशिकाओं 24-29 से α-MSH की एपिडर्मल उत्पादन भी शामिल है. हम और दूसरों keratinocyte व्युत्पन्न α-MSH adenylyl साइक्लेस 30 की सक्रियता के माध्यम से शिविर दूसरा दूत के बहाव के उत्पादन की शुरुआत, एपिडर्मल melanocytes पर MC1R को बांध परिकल्पना है कि. शिविर के स्तर के अस्तित्व के रास्ते, डीएनए की मरम्मत और वर्णक संश्लेषण सहित मेलानोसाईट भेदभाव के कई पहलुओं को नियंत्रित. MC1R संकेतन और शिविर स्पष्ट रूप से वर्णक एंजाइम का स्तर और eumelanin उत्पादन को प्रेरित. MC1R संकेतन बरकरार है और melanocytic शिविर का स्तर मजबूत कर रहे हैं, eumelanin उत्पादन और त्वचा darkens है. हालांकि, MC1R संकेतन दोषपूर्ण है औरcytoplasmic शिविर का स्तर कम रहते हैं, pheomelanin बजाय 1 का उत्पादन किया है. Eumelanin संश्लेषण शिविर के स्तर 1,14,31-35 बढ़ा कि एजेंटों द्वारा औषधीय प्रेरित किया जा सकता है.

MC1R प्रोटीन मनुष्य 36-46 में मेलेनोमा जोखिम का एक प्रमुख नियामक है, हम MC1R यूवी प्रेरित carcinogenesis के खिलाफ melanocytes की रक्षा करता है जो व्यवस्था के द्वारा में रुचि रखते हैं. हमारे अध्ययन के लिए एक आधार के रूप में, हम एक शुद्ध C57BL 6 / आनुवंशिक पृष्ठभूमि 1 पर एक ट्रांसजेनिक MC1R-वैरिएंट murine मॉडल उत्पन्न. इस मॉडल में, अनिवार्यता से बेसल एपिडर्मिस में व्यक्त किया जाता है और epidermal interfollicular melanocytes बालों के रोम में dermis के लिए स्थानीय बनाना melanocytes जिसमें गैर ट्रांसजेनिक चूहों के विपरीत, जीवन 47 के दौरान त्वचा में बनी रहती हैं सेल कारक (एससीएफ) स्टेम. K14-एससीएफ transgene शामिल के साथ, एपिडर्मिस वर्णक की विशेष मेलेनिन pigments विशेषता के साथ pigmented हो जाता हैपशु 1 का तनाव. जंगली प्रकार MC1R संकेत के साथ C57BL 6 / आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर K14-एससीएफ चूहों जेट काले त्वचा eumelanin वर्णक के बहुत उच्च स्तर की विशेषता है. आश्चर्य नहीं कि इन जानवरों अत्यधिक यूवी प्रतिरोधी हैं. इसके विपरीत, एक उत्परिवर्ती निष्क्रिय MC1R बंदरगाह कि आनुवंशिक रूप से मिलान किया K14-एससीएफ C57BL 6 / जानवरों एपिडर्मिस में लगभग कोई eumelanin है. इसके बजाय, इन "एक्सटेंशन" जानवरों (MC1R ई / ई) pheomelanin वर्णक (चित्रा 1 ए) के बयान की वजह से एक निष्पक्ष त्वचा के रंग है और बहुत अधिक यूवी संवेदनशील 48-49 हैं.

त्वचा में प्रवेश की अनुमति है कि रासायनिक गुणों के साथ pharmacologic यौगिकों तेज़ी के साथ सीधे त्वचा में एपिडर्मल melanocytes में शिविर के स्तर से छेड़छाड़ एक्सटेंशन (MC1R ई / ई) K14-एससीएफ पशु मॉडल में eumelanin प्रेरित दिखाया गया है. इस मॉडल में मेलेनिन upregulation r गया हैadenylyl साइक्लेस सक्रियण 1 के साथ ही फॉस्फोडाइस्टरेज़ 4 निषेध 35 से eported. इस अनुच्छेद में, हम विस्तार (MC1R ई / ई) K14-एससीएफ जानवरों जो मॉडल निष्पक्ष चमड़ी यूवी संवेदनशील मानव में तैयारी और forskolin की सामयिक आवेदन प्रदर्शित करता है. हम दवा की दो बार दैनिक आवेदन, त्वरित melanization को बढ़ावा देता है कि त्वचा काला मेलेनिन वर्णक के एपिडर्मल बयान की वजह से है और उस प्रेरित एपिडर्मल मेलेनिन "न्यूनतम erythematous खुराक" (मेड) 48 की माप के माध्यम से यूवी प्रेरित धूप की कालिमा के खिलाफ की रक्षा करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) संयंत्र की एक कच्चे जड़ निकालने से सामयिक प्रशासन के लिए forskolin की तैयारी

  1. Murine प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल जानवरों की देखभाल और उपयोग में नैतिक आचरण के लिए दिशा निर्देशों का पालन और केंटकी के विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 00768M2004) द्वारा अनुमोदित किया गया. रूट निकालें 70% इथेनॉल का एक मानक dermatologic बेस के साथ, 30% propylene glycol में 40% वजन / मात्रा में किया जाता है.
  2. कच्चे तेल forskolin जड़ निकालने की 200 ग्राम वजन और एक बीकर को हस्तांतरण. एक 40% की 500 मिलीलीटर (w / v) समाधान, वाहन की मात्रा के सभी (70% इथेनॉल, 30% propylene glycol) सबसे लेकिन नहीं जोड़कर कच्चे forskolin जड़ निकालने की 200 ग्राम resuspend बनाने के लिए और समाधान लाने के लिए मोटे तौर पर 450 मिलीलीटर.
  3. कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए हलचल. समाधान कुछ हद तक चिपचिपा हो जाएगा और पहले समाधान में "लिफ्ट" निकालने के लिए मैनुअल आंदोलन की आवश्यकता हो सकतीहलचल पट्टी पर ले जाने में सक्षम है.
  4. सरगर्मी के एक घंटे के बाद, एक स्नातक सिलेंडर में मिश्रण डालना और (बीकर से forskolin की वसूली को अधिकतम करने के लिए) घोल हलचल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि बीकर "बाहर कुल्ला" करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि वाहन का उपयोग कर 500 मिलीलीटर मात्रा लाओ .
  5. 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूबों को घोल स्थानांतरण. एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग अपकेंद्रित्र (1,500 XG, कमरे के तापमान, 15 मिनट). इस बिंदु पर, अघुलनशील सामग्री पर तैरनेवाला आसानी से डाला जा करने की अनुमति, काफी जमा हो जाएगा.
  6. निकालने से किसी भी अवशिष्ट अघुलनशील सामग्री को हटाने के लिए 0.22 सुक्ष्ममापी सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली के माध्यम से समाधान फ़िल्टर. हम जड़ निकालने की अघुलनशील घटक से झिल्ली का समयपूर्व clogging रोकने के लिए यूनिट के साथ आया है कि पूर्व फिल्टर के उपयोग के साथ सेल संस्कृति के लिए बनाया गया एक बोतल टॉप प्रणाली, का उपयोग करें. निकालने के लिए बड़ी मात्रा में कर रही है, पूर्व फिल्टर शर्त बदल रहा है, एक समय में लगभग 100 मिलीलीटर फिल्टरप्रत्येक जोड़ी मात्रा समझना.
  7. कमरे के तापमान पर संग्रहित करते हैं, निकालने के लिए एक साल के लिए जीवविज्ञान गतिविधि ऊपर रखता है.

2. सामयिक उपचार के लिए C57BL / 6 K14-एससीएफ चूहे की तैयारी

  1. बिजली कर्तन द्वारा पशुओं से पृष्ठीय फर निकालें. संक्षेप में एक 0.25 एमएम शल्य प्रारंभिक सिर (फिशर साइंटिफिक) के साथ outfitted बिजली कैंची के साथ पृष्ठीय फर के बाल काटना की सुविधा के लिए inhalational isoflurane के साथ जानवरों anesthetize. अधिमानतः केवल संवेदनाहारी अधिक मात्रा के जोखिम को कम करने के लिए एनेस्थीसिया का एक प्रकार है (जैसे ketamine / xylazine) का उपयोग करें. संतृप्त साँस लेना चैम्बर एक धूआं हुड के बाहर थे जब व्यावसायिक जोखिम वहन करती है और पशुओं को संवेदनाहारी की अज्ञात मात्रा बचाता है. आदर्श रूप में एक सटीक vaporizer इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. , अवशिष्ट बाल खूंटी निकालने के एक रासायनिक लोमनाशक साथ पशुओं का इलाज. Ketamine 40 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 4 मिलीग्राम / किलो के एक आईपी इंजेक्शन के साथ जानवरों के लिए संज्ञाहरण प्रशासन जानवरों के लिए पर्याप्त रूप से (पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा न्याय के रूप में) anesthetized हैं एक बार, एक दस्ताने उंगली का उपयोग sheared पृष्ठीय त्वचा को लोमनाशक क्रीम की एक उंगलियों के आकार राशि लागू होते हैं. 30-60 सेकंड के लिए या इसे चारों ओर ले जाया जा रहा है के रूप में बाल स्पष्ट रूप से क्रीम में देखा जा सकता है जब तक त्वचा में क्रीम रगड़ें. लंबे समय तक निवेश एपिडर्मल अखंडता के नुकसान से त्वचा, एपिडर्मल टूटने और मौत की रासायनिक जलने की ओर जाता है के रूप में केवल बालों को हटाने के लिए आवश्यक समय की न्यूनतम राशि के लिए पर क्रीम छोड़ दें.
  3. सभी क्रीम निकाल दिया गया है जब तक बार बार पानी से लथपथ धुंध पैड के साथ पृष्ठीय त्वचा साफ कर लें. मुलायम कागज तौलिए का उपयोग कर, और उन्हें एक गर्म एकांत स्थान (जैसे स्वच्छ पिंजरों एक वार्मिंग पैड पर रखा गया) में ठीक करने की अनुमति सूखी जानवरों. एक के बाद एक जानवरों बाल हटाना और प्रक्रिया के दौरान बारीकी से निगरानी.

3. Forskolin या वाहन पर नियंत्रण के सामयिक प्रशासन

  1. पशु एक बार में एक ही व्यवहार किया जाना चाहिए. संक्षेप में श्वास के साथ anesthetizeजिसके तहत एक फार्म से सज्जित नायलॉन हवा पारगम्य फिल्टर के शीर्ष पर माउस रखकर डी isoflurane एक धूआं हुड में एक isoflurane संतृप्त lidded स्पष्ट ग्लास जार में एक isoflurane संतृप्त कागज तौलिया रखा गया है. स्वैच्छिक मांसपेशियों आंदोलनों को दबाने के लिए लेकिन सहज श्वसन (आमतौर पर 10-20 सेकंड) को संरक्षित करने के रूप में एक पर्याप्त समय के लिए isoflurane के लिए माउस को बेनकाब. बहुत लंबा isoflurane में पशु छोड़कर सांस दमन और मौत में परिणाम देगा. यह "प्रकाश जा" और दवा और जोखिम मौत के लिए पशु बेनकाब खत्म करने और अधिक isoflurane बजाय संक्षेप माउस फिर से बेनकाब करने के लिए होने की ओर गलती बेहतर है.
  2. Isoflurane कक्ष से पशु निकालें और एक साफ शोषक बेंच पैड पर जगह है.
  3. एक डिस्पोजेबल polypropylene टिप के साथ outfitted 1,000 μl micropipette, 40% कच्चे forskolin निकालने की 400 μl आकर्षित का प्रयोग (वाहन नियंत्रण जानवरों 70% इथेनॉल, अकेले 30% propylene glycol प्राप्त होगा).
  4. पर निकालने के लिए स्थानांतरणसभी त्वचा कवर किया गया है जब तक वापस पिपेट टिप की ओर का उपयोग कर, तो त्वचा पर इसे टपकता और जानवर के द्वारा, पृष्ठीय त्वचा पर निकालने धब्बा. आवेदन के बाद त्वचा दाग की कोई जरूरत नहीं है.
  5. अपने पिंजरे के लिए माउस लौटें, और यह संज्ञाहरण से ठीक है जब तक ध्यान से निरीक्षण करते हैं.
  6. गैर वर्णक शिविर प्रभाव यूवी संवेदनशीलता प्रयोगों उलझाना नहीं चाहिए कि आदेश में, यूवी जोखिम (वर्णक प्रभाव पिछले सामयिक उपचार से परे कई दिनों तक रहता है) के लिए 2 दिन पहले सभी सामयिक उपचार बंद.

4. चिंतनशील वर्णमिति द्वारा रंग माप त्वचा

  1. संक्षेप में साँस isoflurane (ऊपर देखें) के साथ माउस anesthetize.
  2. वर्णमापक के साथ प्रदान मानकीकृत सफेद सतह पर पोर्टेबल सिर रखकर एक Minolta वर्णमापक जांचना.
  3. यह सुनिश्चित करना जानवर के पृष्ठीय त्वचा के साथ वर्णमापक फ्लश के पोर्टेबल मापने सिर जगह है कि 1 2 सेमी दौर aperturई पूरी तरह से त्वचा पर दबाया जाता है. पृष्ठीय त्वचा के विभिन्न क्षेत्रों में कम से कम तीन अलग नाप लो.
  4. पशु प्रति और उपचार समूह प्रति एसडी मतलब ± एल * स्कोर की गणना. चिंतनशील वर्णमिति प्रयोग में किसी भी बिंदु पर किया जा सकता है.

5. "कम से कम erythematous खुराक" (मेड) की गणना के द्वारा यूवी संवेदनशीलता का निर्धारण

  1. वाहन या ऊपर वर्णित के रूप में forskolin या तो पहले से इलाज किया गया है कि जानवरों का प्रयोग करें. Ketamine और xylazine (ऊपर देखें) के एक मानक मिश्रण के intraperitoneal इंजेक्शन के साथ जानवरों anesthetize.
  2. मेड के परीक्षण के लिए यूवी पूर्णावरोधक टेप का एक टुकड़ा तैयार करें. , टेप में छेद उत्पन्न एक 1 सेमी 2 परिपत्र cutout के साथ एक भारी शुल्क छेद पंच (आंकड़े 2A और बी) का उपयोग करें. टेप में एक परिभाषित आकार और सुडौल व्यवस्था के छेद होने विकिरण के बाद त्वचा में परिवर्तन की मान्यता की सुविधा. टेप में प्रत्येक छेद पर, एक छोटी लेकिन आसानी से वियोज्य टुकड़ा लागू विभिन्न यूवी खुराक की प्रशासन की अनुमति के लिए यूवी प्रदर्शन के दौरान परिभाषित समय पर हटाया जा सकता है कि टेप की.
  3. जानवरों के लिए पर्याप्त रूप से बेहोश हो जाने के बाद, पृष्ठीय सतह पर टेप जगह है. नेत्र स्नेहक हमेशा संज्ञाहरण के तहत खर्च की जाएगी.
  4. दो वेस्टिंगहाउस F15T8UV बी से मिलकर यूवी स्रोत पर बारी 313 एनएम के एक चोटी के उत्पादन और 280-370 एनएम की एक सीमा के साथ दीपक. (आम तौर पर गर्म करने के लिए दीपक के लिए कुछ ही मिनट लगते हैं) एक यूवीबी संवेदक के साथ एक यूवी प्रकाशमापी द्वारा मापा के रूप में दीपक एक निरंतर यूवी उत्पादन को संतुलित करने की अनुमति दें.
  5. यूवी प्रकाशमापी द्वारा मापा के रूप में यूवी संचरण दर के आधार पर, प्रत्येक वांछित खुराक के लिए जोखिम यूवी समय की गणना. उदाहरण के लिए, हमारे दीपक की यूवीबी उत्पादन उपायों 2.4 मेगावाट / 2 सेमी. इसलिए, 5 जूल / 2 मीटर करने के लिए प्रशासन, त्वचा के नीचे की गणना के रूप में, UVB विकिरण के (3 मिनट और 28 सेकंड है) 208 सेकंड के संपर्क में होने की आवश्यकता होगी:
    upload/50670/50670eq1.jpg "/>
  6. यहां तक ​​कि यूवी जोखिम सुनिश्चित करने के लिए उदर सतह के नीचे बेहोश जानवर (स्थान पर पूर्णावरोधक टेप के साथ प्रत्येक) रखें. पराबैंगनी विकिरण का चुना खुराक प्रशासन के लिए, क्रमिक रूप से विकिरण की सही खुराक के लिए 1 सेमी त्वचा के 2 क्षेत्रों का पर्दाफाश करने के लिए छेद को कवर छोटे पूर्णावरोधक टेप हटा दें. 40 जे / 2 मीटर प्रयोग में सबसे बड़ी खुराक है, तो इसलिए, ऊपर के उदाहरण का उपयोग करते हुए, तो जानवर नहीं होगा 40 जे / 2 मीटर हालत में 27 मिनट और 47 सेकंड में कुल और त्वचा के लिए दीपक के तहत किया जाएगा टेप पूरे समय overlying. जोखिम में शेष 208 सेकंड है जब वहाँ हालांकि, 5 जूल / 2 मीटर हालत overlying टेप हटा दिया जाएगा. प्रत्येक हालत एक साथ समाप्त होता है कि इतना टेप हटाने के समय किया जाना चाहिए.
  7. यूवी जोखिम के बाद, अचानक या पीढ़ी सशक्त आंदोलनों के साथ त्वचा चीर करने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, ध्यान से पृष्ठीय त्वचा से टेप छील. अनुमति देने के लिए एक गर्म शांत जगह में जानवरों रखेंसंज्ञाहरण से वसूली.
  8. पर्विल (लाली) या सूजन के विचारशील क्षेत्रों के लिए देखने के लिए 24-48 घंटे के लिए चूहों मॉनिटर (सूजन) यूवी विकिरण के विशिष्ट खुराक के संपर्क में शारीरिक साइटों के लिए इसी. फ़ोटोग्राफ़ी की त्वचा निष्कर्षों दस्तावेज़.
  9. मेड मूल्य पर्विल और / या त्वचा की संपूर्ण उजागर चक्र की शोफ द्वारा परिभाषित के रूप में सूजन का कारण बनता है कि यूवी के न्यूनतम खुराक से मेल खाती है. त्वचा की रंजकता हालांकि, पर्विल और शोफ अभी भी आम तौर पर सही है, भाग में यूवी प्रदर्शन के दौरान टेप में छिद्र से परिभाषित आकार के लिए धन्यवाद का आकलन किया जा सकता है, मेड के दृढ़ संकल्प को चुनौती दे सकता है ध्यान दें.

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

Bonferroni पोस्ट टेस्ट (ग्राफ़ पैड चश्मे). पी मूल्यों <0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता है के साथ एक तरह से एनोवा द्वारा चूहों के साथियों के बीच डेटा का विश्लेषण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C57BL 6 / चूहों वर्णित (चित्रा 1 ए) के रूप में K14-एससीएफ transgene शामिल eumelanotic pheomelanotic या अवर्णकयुक्त पृष्ठभूमि पर उत्पन्न किया गया. गोरी चमड़ी वाले विस्तार के साथियों (MC1R ई / ई, Tyr + + /) चूहों वाहन (70% इथेनॉल, 30% propylene glycol) या 40% कच्चे Coleus forskohlii रूट निकालने (80 माइक्रोन प्रति या तो दो बार दैनिक खुराक के साथ topically इलाज किया गया 5 दिन (चित्रा 2 बी) के लिए) खुराक. एपिडर्मल रंजकता पर सामयिक उपचार के प्रभाव का दृश्य निरीक्षण से और चिंतनशील वर्णमिति (चित्रा 1 बी) द्वारा दोनों निर्धारित किया गया है. जड़ निकालने का आवेदन K14-एससीएफ ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि नहीं है लेकिन आनुवंशिक रूप से मिलान गैर ट्रांसजेनिक जानवरों में में मजबूत एपिडर्मल काला के साथ जुड़े थे. हम pharmacologically प्रेरित मेलेनिन epide में जमा होने के लिए interfollicular एपिडर्मल melanocytes क्रम में उपस्थित होना चाहिए संकेत मिलता है कि इन परिणामों की व्याख्याRMIS. जड़ निकालने गहरा क्योंकि forskolin इसके अलावा संयंत्र phytochemicals की उपस्थिति के रंग का है हालांकि गैर ट्रांसजेनिक जानवर रूट निकालने (चित्रा 1 बी) के साथ darkening त्वचा प्रदर्शन करने में विफल के रूप में, त्वचा काला, कारण दवा से एक रंगाई प्रभाव को पूरी तरह नहीं हो सकता. एक दो बार दैनिक ढंग से लागू जब अधिक से अधिक काला कई दिनों (चित्रा 1C) के बाद महसूस किया है, हालांकि, topically लागू forskolin के प्रभाव melanizing, के रूप में छोटे रूप में 2 दिनों में उल्लेख किया जा सकता है. दवा (चित्रा -1) के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज पृष्ठीय त्वचा वर्गों के फोंटाना-मेसन मेलेनिन धुंधला द्वारा दिखाया के रूप में melanization की डिग्री, खुराक पर निर्भर है.

(आंकड़े 2 ए और बी) ऊपर उल्लिखित के रूप में आगे, यूवी संवेदनशीलता पर topically लागू forskolin के प्रभाव विस्तार चूहों में मेड परीक्षण (MC1R ई / ई, Tyr + + /) द्वारा निर्धारित किया गया था. मेड दृढ़ संकल्प ani बीच तुलना की गई(15 दिन, 15 कुल खुराक के लिए एक बार दैनिक प्रशासन) एक मानक दृष्टिकोण बनाम (5 दिन, 10 कुल खुराक के लिए दिन में दो बार प्रशासन) एक त्वरित दवा उपचार के साथ इलाज MALS. गैर ट्रांसजेनिक चूहों गैर मेलेनिन दवा प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए शामिल किया गया. दोनों उपचार forskolin इलाज K14-एससीएफ पशुओं में darkening त्वचा की समान मात्रा में हुई. विशेष रूप से, forskolin उजागर जानवरों के लिए एल * (चिंतनशील वर्णमिति सफेद काला पैमाने पर) मूल्यों 31.9 ± 1.8 और मानक आवेदन बनाम त्वरित आवेदन के लिए 31.1 ± 1.6, क्रमशः थे. इलाज समूह में या तो forskolin जोखिम से कोई स्पष्ट विषाक्त प्रभाव होते थे, इस प्रकार, हम कि पहले से इस्तेमाल के रूप में त्वरित forskolin एडमिनिस्ट्रेशन (10 कुल खुराक, खुराक प्रति 80 माइक्रोन के लिए दो बार एक दिन) के रूप में प्रभावी रूप से पृष्ठीय त्वचा की सुरक्षित melanization पदोन्नत निष्कर्ष निकाला है कि (15 कुल खुराक के लिए एक बार एक दिन, खुराक प्रति 80 माइक्रोन).

Forskolin प्रेरित एपिडर्मल melanization में हुईमेड (आंकड़े -2 सी डी) द्वारा न्याय के रूप में गहरा यूवी संरक्षण. इस प्रकार, जबकि मेड वाहन के साथ 5 दिनों के लिए दो बार के लिए इलाज K14-एससीएफ विस्तार चूहों के लिए 0.0 केजे / एम 2 5.0 ± था मतलब, सामयिक forskolin के साथ इलाज के साथियों के लिए औसत मेड> 30.0 ± 0.0 kJ / 2 मीटर (आंकड़े 2 एक था और सी). वास्तव में, 30.0 जे / 2 मीटर की एक खुराक के इस प्रयोग में पर्विल उत्पन्न करने के लिए अपर्याप्त था. (15 कुल खुराक, खुराक प्रति 80 माइक्रोन के लिए एक बार एक दिन) मानक forskolin खुराक का उपयोग करना, हम forskolin साथ इलाज K14-एससीएफ विस्तार चूहों के लिए औसत मेड जूल / 2 मीटर (चित्रा 2 बी, डी) 50.0 ± 7.1 थी. महत्वपूर्ण बात है, forskolin पूर्व उपचार क्योंकि K14-एससीएफ की मध्यस्थता एपिडर्मल melanocytes (आंकड़े -2 सी, डी) की कमी की वजह से या tyrosinase कमी (चित्रा 2 ई) के दोनों, melanization के काबिल जानवरों की मेड को प्रभावित नहीं किया. Forskolin अनुप्रयोगों जिले थे2 दिन पहले यूवी जोखिम के लिए जारी रखा और यूवी जोखिम के बाद भी जारी नहीं किए गए थे, हम गैर रंगदार शिविर प्रभाव मेड परिणामों में एक भूमिका निभा नहीं था कि समाप्त. बल्कि, डेटा एपिडर्मल melanization इस मॉडल में जो forskolin प्रेरित यूवी संरक्षण द्वारा तंत्र था कि सुझाव है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Forskolin के सामयिक उपचार निष्पक्ष चमड़ी एक्सटेंशन (MC1R ई / ई) चूहों में त्वचा काला को बढ़ावा देता है. इस अध्ययन में इस्तेमाल C57BL 6 / जानवरों की (ए) फोटो. पशु आनुवंशिक रूप melanocortin 1 रिसेप्टर (MC1R) और tyrosinase (Tyr) loci में छोड़कर मिलान कर रहे हैं. साथ मामला है MC1R, दोषपूर्ण है जब MC1R (blondish) कार्यात्मक लेकिन pheomelanotic है जब रंजकता (काला) eumelanotic है कि नोटएक्सटेंशन (MC1R ई / ई) उत्परिवर्ती. एपिडर्मल रंजकता K14-एससीएफ transgene से त्वचा में interfollicular एपिडर्मल melanocytes की अवधारण पर निर्भर करता है, और आसानी से कानों में देखा जा सकता है. विस्तार (बी) फोटो (MC1R ई / ई) K14-एससीएफ या गैर ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ इलाज वाहन नियंत्रण (70% इथेनॉल के 30% propyl ग्लाइकोल) या 40% w / वी (80 माइक्रोन) forskolin के 400 μl 5 दिनों के लिए मुंडा पृष्ठीय त्वचा के लिए दैनिक दो बार आवेदन किया, 10 आवेदनों में से कुल. चिंतनशील वर्णमिति से त्वचा का रंग माप प्रत्येक समूह के लिए प्रदर्शन किया गया. चिंतनशील वर्णमिति परिणाम एल * (काले सफेद) रंग अक्ष पर माध्य (± एसडी) reflectometry इकाइयों के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं. Forskolin के सामयिक प्रशासन नहीं बल्कि गैर ट्रांसजेनिक चूहों में K14-एससीएफ ट्रांसजेनिक जानवरों में काला मजबूत त्वचा के कारण होता है ध्यान दें. K14-एससीएफ की forskolin इलाज कान का काला दिखा (ग) समय पाठ्यक्रम प्रयोगसंकेत समय के लिए विस्तार चूहों (forskolin इलाज कान नीला त्रिकोण द्वारा संकेत कर रहे हैं). वाहन तुलना के लिए सही कान के लिए आवेदन किया था. (डी) के रूप में वर्णित forskolin का संकेत खुराक के साथ इलाज जानवरों से लिया फोंटाना-मेसन दाग त्वचा वर्गों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. न्यूनतम erythematous खुराक (मेड) परीक्षण द्वारा निर्धारित रूप में forskolin प्रेरित melanization यूवी की मध्यस्थता सूजन के खिलाफ की रक्षा करता है. 5 दिन (ए, सी) के लिए या एक बार दैनिक वाहन या forskolin के साथ या तो 15 दिन (बी, डी, ई) के लिए दैनिक दो बार इलाज जानवरों के यूवी पूर्णावरोधक टेप और यूवीबी खुराक के (ए, बी) स्थिति. गु ई पिछले सामयिक उपचार से पहले विकिरण को 48 घंटा लागू किया गया था. पृष्ठीय त्वचा 2 परिपत्र apertures छिद्रित बाहर 1 सेमी के साथ यूवी पूर्णावरोधक टेप का उपयोग कर, और उचित खुराक उपज के लिए जोखिम बार अलग से यूवीबी के विभिन्न खुराक के संपर्क में था. विकिरण के बाद, उजागर त्वचा के हलकों कुछ प्रयोगों में एक कलम के साथ लेबल रहे थे. मेड, पर्विल और / या एक विशेष खुराक के संपर्क में त्वचा के पूरे चक्र का शोफ द्वारा परिभाषित, प्रदर्शन के बाद 48 घंटे निर्धारित किया गया है. एसडी परिणाम ± मेड जूल / 2 मीटर यूवीबी के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं, * पी ​​≤ 0.001. (ई) त्वचा का रंग reflectometry और वाहन या forskolin साथ 10 दिनों के लिए इलाज tyrosine की कमी K14-एससीएफ सूरजमुखी मनुष्य विस्तार चूहों के लिए मेड मूल्यों. के लिए क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .

70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
चित्रा 3. प्रयोग के समग्र स्कीमा. विस्तार के साथियों (MC1R ई / ई) K14-एससीएफ या गैर ट्रांसजेनिक जानवर बिजली बाल काटना और / या रासायनिक depilation द्वारा पृष्ठीय फर हटाने के द्वारा तैयार की गई. पशु तो संकेत खुराक कार्यक्रम द्वारा वाहन (70% इथेनॉल, 30% propylene glycol) या तो सामयिक अनुप्रयोगों के साथ या 40% कच्चे forskolin निकालने के साथ इलाज किया गया. त्वचा रंजकता पर प्रभाव colorimetrically और फोंटाना-मेसन मेलेनिन धुंधला करके, फ़ोटोग्राफ़ी दस्तावेज थे. यूवी संवेदनशीलता न्यूनतम erythematous खुराक (मेड) परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

गोरी चमड़ी वाले मानव के एक पशु मॉडल का उपयोग करना, हम एक forskolin युक्त कच्चे जड़ निकालने के सामयिक आवेदन मजबूती के साथ त्वचा में मेलेनिन उत्पादन प्रेरक द्वारा बाह्य त्वचा darkens हैं. एपिडर्मल melanization मानव त्वचा में होता है, बेसल एपिडर्मिस में स्टेम सेल कारक की अभिव्यक्ति पर निर्भर है लेकिन नहीं अनुवांशिक असंशोधित माउस त्वचा में. आनुवंशिक रूप से असंशोधित चूहों के पृष्ठीय त्वचा त्वचा को वर्णक प्रदान करने के लिए interfollicular melanocytes के लिए पर्याप्त संख्या का अभाव है. केवल इस तरह के स्टेम सेल कारक (किट ligand) या hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) के रूप में एक मेलानोसाईट वृद्धि कारक के विधान अभिव्यक्ति की सेटिंग में melanocytes पशु 50-51 के जीवन भर epidermis की बेसल परत में बनाए रखा जा सकता है. गोरी चमड़ी वाले मानव की हमारी पशु मॉडल C57BL 6 / murine लाइन का विस्तार वर्णक संस्करण में K14-एससीएफ transgene के समावेश पर आधारित है. किसी भी उम्र के जानवरों किया जा सकता हैइस्तेमाल किया, हमारे प्रयोगों आमतौर पर युवा वयस्क (उम्र के 4-12 सप्ताह) चूहों को शामिल करना. क्योंकि शिविर संकेतन का नुकसान होता है कि एक छोटा melanocortin 1 रिसेप्टर (MC1R) का विस्तार चूहों बल्कि 52-54 eumelanin से (K14-एससीएफ या HGF-मिले ट्रांसजेनिक राज्यों में) कोट और त्वचा में रियायत के तौर पर pheomelanin व्यक्त करते हैं. बदल मेलानिन अभिव्यक्ति का एक परिणाम के रूप में, K14-एससीएफ विस्तार चूहों और अधिक यूवी संवेदनशील होने के कारण एपिडर्मल eumelanin वर्णक 1 की प्रचुर मात्रा में बयान करने के लिए जेट काले त्वचा है जो उनके MC1R जंगली प्रकार समकक्षों की तुलना में कर रहे हैं. हम eumelanin उत्पादन के बाद से बहुत MC1R संकेतन कि नकल pharmacologic उत्तेजक eumelanin उत्पादन बचाव हो सकता है कि, एक उत्परिवर्ती MC1R की सेटिंग में कम है कि समझाया. MC1R एक जी एस युग्मित transmembrane रिसेप्टर है कि अपने उच्च आत्मीयता ligand के बंधन पर α-मेलानोसाईट हार्मोन (α-MSH), melano समर्थक भेदभाव संकेत संचारित उत्तेजकदूसरा दूत शिविर का adenylyl साइक्लेस सक्रियण और उत्पादन के माध्यम से एक प्रत्यय जिसका अर्थ कोशिका है कोशिका द्रव्य. इस प्रकार, हम forskolin की सामयिक आवेदन, adenylyl साइक्लेस का एक शक्तिशाली प्रत्यक्ष उत्प्रेरक है कि एक सेल पारगम्य diterpenoid, MC1R-दोषपूर्ण, pheomelanotic राज्य में eumelanin उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए सक्षम होना हो सकती है.

इन अध्ययनों के लिए शुद्ध forskolin का प्रयोग, तथापि, लागत निषेधात्मक साबित कर दिया. K14-एससीएफ विस्तार मॉडल में एपिडर्मल काला लिए आवश्यक forskolin की न्यूनतम राशि का निर्धारण प्रारंभिक प्रयोगों अधिक से अधिक काला 20% निहित है कि कच्चे तेल निकालने (वजन प्रति वजन) forskolin का उपयोग कर मात्रा समाधान के प्रति एक 40% वजन के उपयोग के साथ हुई सुझाव दिया. हम एक 8% अंतिम forskolin के 400 μl के उस आवेदन की गणना (मात्रा प्रति वजन, 40% x 20%) समाधान पृष्ठीय त्वचा हर आवेदन के लिए लगभग 80 माइक्रोन forskolin के वितरण में नतीजा होगा. बेशक, वितरित खुराक की बहुत, त्वचा द्वारा अवशोषित नहीं है बजाय फर आसपास या आवेदन के समय पशु से गिरने से लथपथ जा रहा है. इस प्रकार यह जानवरों दवा के प्रत्येक आवेदन के साथ प्राप्त है कि सही एहसास हुआ खुराक रिपोर्ट करने के लिए मुश्किल है. बहरहाल, इस तरह से लागू किए जाने पर, eumelanin की त्वचा और उत्पादन में वर्णक एंजाइमों की मजबूत प्रेरण में forskolin परिणाम. वास्तव में, K14-एससीएफ ट्रांसजेनिक विस्तार जानवरों दूसरा आवेदन (चित्रा 1C) के बाद त्वचा का स्पष्ट काला प्रदर्शन किया.

हम पहले से दवा 1,48-49 के दैनिक आवेदन के साथ darkening त्वचा प्रकाशित किया है, यहाँ हम pharmacologic प्रेरित melanization के प्रशासन द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, सुझाव है कि दिन में दो बार आवेदन मजबूत एपिडर्मल काला और महत्वपूर्ण यूवी संरक्षण के साथ जुड़ा हुआ है अधिक बार एक बार एक दिन से भी दवा. एपिडर्मिस में eumelanin प्रेरण की वजह से है जो त्वचा काला, के रूप में के लिए रहता हैसामयिक forskolin उपचार जारी कर रहे हैं लंबे समय के रूप में. (तीन महीनों के माध्यम से) भी पुरानी आवेदन चूहों 49 से अच्छी तरह से सहन लग रहा था. त्वचा काला में वृद्धि मेलेनिन संश्लेषण के बजाय एपिडर्मिस. 49 में melanocytes के प्रसार की वजह से है. सामयिक उपचार बंद हो जाने के बाद एपिडर्मल मेलेनिन सामान्य keratinocyte नवीकरण के साथ खो दिया है, त्वचा धीरे - धीरे इसकी आधारभूत गोरा रंग (2-3 सप्ताह) को वापस fades. त्वचा का काला आसानी हालांकि त्वचा का रंग चिंतनशील वर्णमिति 55-56 का उपयोग निष्पक्ष मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, चूहों की साधारण दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस विधि त्वचा के रंग को मापने के लिए एक गैर इनवेसिव त्वरित और पीड़ारहित विधि है. रंग सही एल * एक * बी * (प्रयोगशाला) रंग अंतरिक्ष मॉडल 57-58 का उपयोग वर्णित किया जा सकता.

इन प्रयोगों के लिए हम Coleus forskolii संयंत्र, forskolin के प्राकृतिक स्रोत के एक कच्चे जड़ निकालने पर भरोसा किया. यह तैयारीक्योंकि शुद्ध किया forskolin साथ इन प्रयोगों प्रदर्शन की उच्च लागत का इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोग, उदाहरण के लिए, पांच दिनों के लिए छह पशुओं को दिन में दो बार आवेदन के लिए forskolin कुल लगभग 2 जी की आवश्यकता है. वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध HPLC शुद्ध forskolin के 2 जी कच्चे तेल निकालने के लिए कम से कम $ 5 की तुलना में, अधिक से कम 20,000 डॉलर खर्च करने होंगे. शुद्ध forskolin हमारे पशु मॉडल 1 में एपिडर्मल मेलेनिन प्रेरित हालांकि, हम alkaloids, phenols और टैनिन सहित कच्चे जड़ निकालने में अन्य संयंत्र व्युत्पन्न यौगिकों के संभावित प्रभावों से इंकार नहीं कर सकते हैं. वास्तव में, गिनी पिग या मानव त्वचा explants का उपयोग पहले काम कच्चे जड़ निकालने में यौगिकों forskolin 59 की त्वचीय अवशोषण को बढ़ावा देने सकता है कि सुझाव दिया. अभी तक, हालांकि, पहचान और इन यौगिकों के तंत्र अनजान रहते हैं. इस प्रकार, हम कच्चे तेल की जड़ निकालने में स्वाभाविक रूप से मौजूद अन्य यौगिकों के प्रभाव को संशोधित करने से इंकार नहीं कर सकते हैं.

जटिल forskolin मिश्रण हैआसानी से सामयिक आवेदन के लिए त्वचा के लिए लागू किया जाता है कि एक आकर्षक मसाले की तरह सुगंध के साथ एक गहरे भूरे रंग के तरल. अघुलनशील सामग्री हटा दिया गया है क्योंकि, दैनिक आवेदन एक बार त्वचा द्वारा अवशोषित नहीं crusting या जमा छोड़ देता है. इस तरह से तैयार है जब कच्चे तेल की जड़ निकालने गहरे भूरे है हालांकि इस तथ्य से प्रदर्शन के रूप में, दवा से प्रेरित त्वचा काला, केवल एक डाई प्रभाव नहीं है कि त्वचा melanization के काबिल नहीं जानवरों पर यौगिक (जैसे MC1R ई / ई tyrosinase की सामयिक आवेदन एपिडर्मल melanocytes कि कमी की कमी सूरजमुखी मनुष्य जानवरों या गैर ट्रांसजेनिक चूहों) (आंकड़े 1 बी और 2 ई) darkening त्वचा पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. हम सबूत की अवधारणा प्रदर्शनों त्वचा में शिविर का हेरफेर यूवी सुरक्षात्मक अंधेरे त्वचा pigmentation पैदा कर सकते हैं के रूप में इन प्रयोगों को देखने. हालांकि, यह forskolin के सामयिक प्रशासन क्योंकि दवा की गैर विशिष्ट प्रकृति की एक संभव या व्यावहारिक चिकित्सकीय विकल्प है कि संभावना नहीं है. मैंndiscriminate और adenylyl cyclases और शिविर के शामिल होने की गैर लक्षित सक्रियण अस्वीकार्य toxicities के कारण होने की उम्मीद की जा सकती है. महत्वपूर्ण बात है, दूसरों त्वचीय शिविर प्रेरण और melanization 35 को लक्षित वैकल्पिक pharmacologic द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि, साबित K14-एससीएफ विस्तार पशु मॉडल में मेलेनिन विनियमित ऊपर से तेज़ी के साथ, एक phosphodiesterase 4 अवरोध करनेवाला (Rolipram) की है कि सामयिक प्रशासन से पता चला है. त्वचा में शिविर के स्तर के सामयिक हेरफेर मानव उपयोग के लिए अनुवाद किया जा सकता से पहले जाहिर है, अपनी सुरक्षा को ध्यान से मूल्यांकन किया जाना होगा. बहरहाल, हमारे डेटा दृढ़ता से कम से कम erythematous खुराक (मेड) परीक्षण द्वारा निर्धारित रूप में औषधीय प्रेरित melanization यूवी सुरक्षात्मक है कि सुझाव देते हैं.

संक्षेप में, forskolin, एक adenylyl साइक्लेस उत्प्रेरक के सामयिक प्रशासन, दोषपूर्ण शिविर नीचे संकेत के आधार पर निष्पक्ष चमड़ी मानव की एक murine मॉडल के epidermis के एक मजबूत melanization में हुईएक दोषपूर्ण melanocortin 1 रिसेप्टर (MC1R) की धारा. न्यूनतम erythematous खुराक (मेड) परीक्षण द्वारा मापा के रूप में एपिडर्मल melanization, यूवी सुरक्षात्मक था. हम परिकल्पना है कि pharmacologic शिविर हेरफेर के रूप में अच्छी तरह से बचाव एपिडर्मिस की यूवी सुरक्षात्मक eumelanization, लेकिन अन्य MC1R निर्भर यूवी सुरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं नहीं कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी सहायता के लिए मलिंडा चंचल धन्यवाद देता हूँ. हम भी वर्तमान और अतीत के धन स्रोतों को स्वीकार करते हैं: राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), वेंडी विल केस कैंसर रिसर्च फंड, Markey कैंसर फाउंडेशन, बच्चों के चमत्कार नेटवर्क और जेनिफर और डेविड डिकेंस मेलेनोमा रिसर्च फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20% Buckton Scott USA Inc. n/a Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP Butler Schein NCD 11695-6776-1 Dublin, OH, USA
Xylazine Anased Injection LA04612 Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP Putney NDC 26637-411-01 St. Joseph, MO, USA
Ethanol Decon Labs. 2705
Propylene glycol Adesco 05751L Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair Church Dwight JF-11 4381322 Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B Westinghouse F15T8UV-B
Radiometer photometer International light 1LT400A Peabody, MA,USA
Chromameter Konica Minolta CR-400 Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400 Konica Monilta DR-400 Ramsey, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
  2. Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. , 126-770 (1990).
  3. Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
  4. Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
  5. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
  6. Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
  7. Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
  8. Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
  9. Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
  10. Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
  11. Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
  12. Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
  13. Tucker, M. A. Melanoma epidemiology. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 23, 383-395 (2009).
  14. Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
  15. Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
  16. Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
  17. Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
  18. Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
  19. Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
  20. Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
  21. Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
  22. Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
  23. Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
  24. Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35, 193-199 (2009).
  25. Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
  26. Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
  27. Slominski, A., Wortsman, J. Neuroendocrinology of the skin. Endocr. Rev. 21, 457-487 (2000).
  28. Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
  29. Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
  30. Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
  31. Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
  32. Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
  33. Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
  34. Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U. Melanocortins in human melanocytes. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52, 75-78 (2006).
  35. Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
  36. Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. , (2012).
  37. Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
  38. Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
  39. Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. , (2009).
  40. Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
  41. Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
  42. Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
  43. Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
  44. Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
  45. Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
  46. Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
  47. Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
  48. Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
  49. Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
  50. Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
  51. Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. , 187-1565 (1998).
  52. Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
  53. Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
  54. Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
  55. Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
  56. Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
  57. Anderson, R. R., Parrish, J. A. The optics of human skin. J. Invest. Dermatol. 77, 13-19 (1981).
  58. Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
  59. Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).

Tags

चिकित्सा अंक 79 त्वचा सूजन भामिति पराबैंगनी किरणों त्वचा pigmentation melanocortin 1 रिसेप्टर MC1R forskolin शिविर मतलब erythematous खुराक त्वचा pigmentation मेलानोसाईट मेलेनिन धूप की कालिमा यूवी सूजन
एक humanized माउस मॉडल में एपिडर्मल मेलेनिन और संरक्षण के खिलाफ सनबर्न की pharmacologic प्रेरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C.,… More

Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C., Scott, T. L., D'Orazio, J. A. Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (79), e50670, doi:10.3791/50670 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter