在有氧条件下进行细胞培养实验以研究细菌黏附和侵袭通常不能代表 在体 环境。垂直扩散室模型可用于研究人类病原体的相互作用 空肠弯曲菌 与肠道上皮细胞在更佳条件下共培养 体内类条件下，导致细菌侵袭性增强。
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摘要
摘要
细菌病原体与宿主细胞的相互作用已被广泛研究 体外 细胞培养方法。然而，由于此类细胞培养实验是在有氧条件下进行的，这些 体外 模型可能无法准确代表 体内 宿主与病原体相互作用发生的环境。我们已开发出一种 体外 一种允许细菌与宿主细胞在不同培养基和气体条件下共培养的感染模型。垂直扩散室（Vertical Diffusion Chamber, VDC）模型模拟了人体肠道内的环境，其中细菌处于极低氧条件，而组织则通过血液获得氧气供应。将生长于Snapwell插入式培养小室中的极化肠道上皮细胞（IEC）单层置于VDC中，可形成独立的顶腔和基底外侧腔室。基底外侧腔室中加入细胞培养基，密封后通入氧气进行灌注；顶腔腔室则加入液体培养基，保持开放状态，并在微需氧条件下孵育。在此条件下，Caco-2和T84两种IEC细胞均可在VDC中维持培养，对细胞存活率或单层完整性均未见明显不良影响。已利用该系统在不同条件下开展多种共培养实验 C. jejuni 野生型菌株和不同IEC细胞系在VDC模型中，当顶端室处于微需氧条件时，与需氧培养条件相比，可重复地导致相互作用的细菌数量（增加近10倍）和细胞内细菌数量（增加近100倍）显著上升1VDC模型所创造的环境更接近于实际遇到的环境 C. jejuni 在人类肠道中，并强调了进行 体外 更接近模拟真实情况的感染实验 体内 现实。我们提出，利用VDC模型将有助于对细菌病原体与宿主细胞之间相互作用进行新的解读。
引言
细菌病原体与宿主细胞的相互作用已被广泛研究 体外 细胞培养方法。利用此类细胞培养实验，已对细菌对宿主细胞的黏附、宿主细胞受体的鉴定、宿主细胞信号通路以及细菌侵入宿主细胞等过程进行了深入研究，并取得了大量重要发现。然而，此类细胞培养实验通常在有氧条件下进行，可能无法真实反映 体内 环境。一个主要限制是 体外 用于研究胃肠道感染的模型存在一个问题，即培养条件（包括高氧水平）通常有利于真核细胞的存活，而肠道腔内的环境几乎为厌氧状态。在极低氧环境中，肠道病原体会表达毒力基因，而这些基因在有氧条件下其表达会发生改变。2因此，使用标准细胞培养模型获得的数据可能无法准确反映细菌与宿主细胞之间的相互作用。
空肠弯曲菌 是全球细菌性急性胃肠炎的主要致病因子，其症状从轻度腹泻到严重的炎症性肠炎不等。大多数 C. jejuni 感染通常导致非复杂性胃肠炎，然而 C. jejuni 也是外周神经病（包括吉兰-巴雷综合征（GBS））中最常检出的感染性病原体。据估计，在英国，由其引起的肠炎病例每年超过50万例。 C. jejuni 每年感染造成的预计经济损失为英国经济带来 £5.8亿。在发展中国家， C. jejuni 是导致儿童死亡的主要原因。尽管其重要性毋庸置疑 弯曲杆菌 感染以及数十年的研究，包括基于基因组学的全面分析， C. jejuni 发病机制仍不甚清楚，与其他肠道病原体（如 沙门氏菌, 大肠杆菌, 志贺氏菌，以及 霍乱弧菌缺乏便捷的小型动物模型是造成这一现状的主要原因之一3此外，还广泛使用 体外 感染模型更不适合用于研究微需氧菌 C. jejuni 比其他兼性厌氧的肠道病原体更甚。尽管 C. jejuni 被公认为一种侵袭性病原体，其机制 C. jejuni 肠上皮细胞（IECs）的侵袭机制仍不明确4,5. C. jejuni 侵袭已被证明依赖于微丝、微管、两者共同作用，或均不依赖5该领域的混淆很可能源于使用了不恰当的方法 体外 检测条件
已采用多种不同的细胞培养实验来研究C. jejuni与宿主细胞之间的相互作用。Caco-26、INT 4077和T848细胞系均已被用于研究不同C. jejuni菌株的黏附和侵袭能力。然而，C. jejuni与肠上皮细胞（IECs）之间的细菌黏附和侵袭水平显著低于其他肠道病原体9。通常在CO2培养箱中、接近大气氧浓度的条件下进行C. jejuni与IECs的共培养，以满足IECs存活所需的环境。与大气氧条件相比，C. jejuni在肠道腔内低氧环境中的基因表达将存在显著差异。
已开发出一种垂直扩散室（VDC）系统，可在不同的培养基和气体条件下实现细菌与宿主细胞的共培养1,10,11。该系统模拟了人体肠道内的环境，其中细菌处于极低氧环境中，而组织则通过血液获得氧气。将极化的人肠上皮细胞（IEC）单层培养于特殊的0.4 μm滤膜上，并置于VDC中，形成顶腔和基底外侧两个独立隔室，分别加入细菌培养液和细胞培养基（图1）。将VDC放入可变气氛培养箱中，培养条件为85% N2、5% O2 和 10% CO2，温度37 °C，此为C. jejuni生长的最适条件。顶腔隔室保持开放，暴露于可变气氛培养箱内的微需氧环境中；而密封的基底外侧隔室则通过持续通入5% CO2/95% O2混合气体以供给氧气，并配有排气管防止压力积聚。通过在24小时内监测跨上皮细胞单层的经上皮电阻（TEER），证实了在此条件下Caco-2细胞的存活以及单层结构的完整性，表明在顶腔低氧条件下Caco-2细胞单层仍能存活，且顶腔与基底外侧隔室保持物理分离。在可变气氛培养箱（微需氧条件）中与标准细胞培养CO2培养箱（有氧条件）中维持的VDC内细胞单层的TEER值无显著差异，说明细胞单层在不同气体环境下均能保持结构完整1。在微需氧条件下，细胞间紧密连接仍然存在，并均匀分布于细胞边界之间，其闭合蛋白（occludin）染色模式与在有氧条件下培养的细胞相似1。
相互作用 C. jejuni 通过评估细菌相互作用（黏附与侵袭）和侵袭，研究了在VDC中Caco-2和T84细胞的情况。两种不同的 C. jejuni 野生型菌株被使用1. C. jejuni 11168H 是原始序列菌株 NCTC11168 的高运动性衍生株。在雏鸡定植模型中，11168H 菌株表现出更高的定植水平，因此被认为是用于宿主-病原体相互作用研究的合适菌株。81-176 是一种人源分离株，也是目前研究最广泛、侵袭性最强的实验室菌株之一。 C. jejuni 菌株在微需氧或需氧条件下被接种至VDC的顶端腔室。我们观察到，在这两种条件下，菌株的黏附和侵袭率均更高。 C. jejuni 在微需氧条件下1. 增加的 C. jejuni 相互作用并非由微需氧条件下细菌数量增加所致1该数据支持了我们的假设，即VDC顶端区室中的低氧环境可增强细菌与宿主之间的相互作用，并表明这些细菌的侵袭特性 C. jejuni 在这些条件下会增加。这是首次报道利用VDC模型研究侵袭性细菌病原体，凸显了进行此类研究的重要性 体外 更接近模拟真实情况的感染实验 体内 该模型可用于研究多种不同细菌物种的宿主-病原体相互作用。
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方案
1. 在特殊0.4 μm 滤膜上培养肠上皮细胞单层
- 在标准组织培养箱中，于37 °C、5% CO2和95%空气条件下，使用添加了10% (v/v) 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和1% (v/v) 非必需氨基酸的Dulbecco改良必需培养基（DMEM）培养Caco-2细胞。每0.4 μm滤膜接种4 × 105个Caco-2肠上皮细胞，培养21天使其形成极化，每2–3天更换一次培养基。
- 使用伏特-欧姆电阻计测量经时跨上皮电阻（TEER），以确认单层细胞的极化状态。在我们的研究中，于这些0.4 μm滤膜上培养21天的Caco-2细胞TEER值为700–800 Ωcm2。
2. 准备 C. jejuni 共培养实验用的细菌培养基
- 在进行VDC共培养实验的预期起始时间前24小时，制备新鲜的含C. jejuni的血琼脂平板，并将其置于可变气氛培养箱中，于37 °C、微需氧条件（85% N2、5% O2和 10% CO2）下培养。
- 同时，在可变气氛培养箱中，将30 ml布氏肉汤置于37 °C、微需氧条件下预培养。
3. 检测前VDC半室的准备与灭菌
- 将VDC半腔室、O型圈和塞子完全浸入消毒液中。
- 使用无菌的20 ml注射器，将消毒液通过两个半腔室的气体入口进行冲洗。若未执行此步骤，共培养过程中可能导致样品污染。
- 将所有组件浸没在消毒液中至少>1小时。
- 用新鲜的无菌水冲洗所有组件，并使用另一支无菌的20 ml注射器冲洗气体入口。
4. 细菌接种物的制备
- 将前一日在血琼脂平板上培养的约半板 C. jejuni 菌落收集至 1 ml 预先温育的布氏肉汤中，菌液浓度应约为 ~1010 cfu/ml。
- 在 600 nm 波长下测定细菌悬液的光密度，以半定量分析细菌菌落形成单位（CFUs）。
- 将细菌悬液用 4 ml 预先温育的布氏肉汤调整至所需的接种浓度。
- 对该终末细菌悬液进行系列稀释，取适当稀释度的菌液三份重复接种于血琼脂平板，随后在变气氛培养箱中 37 °C 培养 48 小时，以定量测定接种物中的细菌 CFU 数量。
5. 设置垂直扩散池（VDC）
- 将VDC装置的下半腔平放在实验台上。将一个O型圈安装到下半腔上。
- 从载体上取下一个带有IECs的滤膜，用400 μl无菌PBS洗涤三次。将滤膜放置在下半腔上，确保O型圈保持原位。
- 轻轻将上半腔放置到位。当两个半腔组装完成后，使用环形夹具将其夹紧。将VDC水平放置在实验台上，使两个开口朝上。
- 向顶端半腔中加入4 ml细菌接种液。
- 向基底外侧半腔中加入4 ml细胞培养基。
- 将端盖插入两个半腔的开口中。
6. 在可变气氛培养箱内将VDC连接至气体歧管
- 将VDC放置于可变气氛培养箱中，并靠近气体歧管。
- 打开连接至气体歧管的气体供应调节阀。将歧管的管路连接至VDC基底外侧半室的气体入口。将从可变气氛培养箱引出的气体出口管连接至基底外侧半室端件上的一个出口。
- 封闭基底外侧半室端件上的另一个出口。打开气体歧管的气体流路，注意应非常缓慢地开启，以避免气体压力过高，否则可能导致基底外侧培养基被冲出。
- 目标气体流速为每2-5秒产生1个气泡。在实验过程中应定期检查气体流速，并在必要时进行调整。
7. 共培养后拆卸 VDC
- 在适当的共培养期结束后，关闭连接至气体分配管的气体供应调节阀，关闭气体分配管向VDC的气体流入，断开VDC的气体入口、气体出口及塞子。
- 将VDC从可变气氛培养箱中取出，收集顶侧和基底侧的上清液，并于-80 °C保存以备后续分析。
- 移除环形夹，轻柔拆开VDC装置，取出半腔室中的滤膜并转移至无菌的6孔细胞培养板中，用400 μl无菌PBS洗涤肠上皮细胞（IECs）三次。
- 为定量与细胞相互作用的细菌总数，向IECs中加入含0.1%（v/v）Triton X-100的400 μl无菌PBS，室温孵育20分钟以裂解IECs。对所得细胞裂解液进行系列稀释，取适当稀释度样本三份重复接种于血琼脂平板，随后在可变气氛培养箱中37 °C孵育48小时，以定量相互作用细菌的菌落形成单位（CFUs）。
- 为定量侵入性细菌的总数，向IECs中加入含150 μg/ml庆大霉素的400 μl DMEM细胞培养基，在标准组织培养箱中37 °C、5% CO2及95%空气条件下孵育2小时以杀灭胞外细菌，之后操作同上述第7.4步。
8. 共培养后对VDC的清洗
用无菌水清洗VDC，并储存以备下一轮实验使用。
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结果
在VDC模型中，于顶端腔室采用微需氧条件，将C. jejuni野生型菌株与IEC细胞共培养的实验表明，与需氧培养条件相比，随着时间推移，与细胞相互作用的细菌数量（增加近10倍）以及细胞内细菌数量（增加近100倍）均显著上升1。该结果在两种不同的C. jejuni野生型菌株（11168H和81-176）以及两种不同的IEC细胞系（Caco-2和T84）中均能重复，凸显了VDC模型的可靠性1。
此处展示的代表性结果是对数量的比较 C. jejuni 在CO₂培养箱内的标准细胞培养实验条件下共培养3、6或24小时后，与Caco-2细胞相互作用或侵入Caco-2细胞2 培养箱（图2A 和 B）或在顶端腔室为微需氧条件的VDC模型中（图2C 和 D）。两种不同 C. jejuni 野生型菌株（11168H 和 81-176...
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讨论
使用 体外 用于研究细菌病原体与宿主细胞相互作用的细胞培养方法，是许多研究实验室广泛采用的一种技术。然而，由于此类细胞培养实验通常在有氧条件下进行，这些 体外 模型可能无法准确代表 体内 宿主与病原体相互作用发生的环境。该环境被广泛使用 体外 感染模型特别不适用于研究微需氧菌 C. jejuni 与其他兼性厌氧的肠道病原体相比。文献中关于人类肠上皮细胞（IECs）侵袭机制的研究存在较大混淆 C. jejuni4,5我们推测，侵袭机制之所以如此难以被理解，是因为 体外 这些研究中使用的模型未能准确反映 体内 情况。使用标准的细胞培养检测方法，检测水平 C. jejuni IECs 的侵袭率始终非常低9VDC 模型的开发是我们为解决这一问题而提出的应对方案。
我们已证实，在微需氧条件下，两种不同的IEC细胞系可在VDC中于顶腔表面维持24小时，且未观察到任何不利影响1
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
Dominic Mills 获得了布卢姆斯伯里学院博士生奖学金（2007–2010年）的支持。作者谨此感谢 Ozan Gundogdu 和 Abdi Elmi 在建立 VDC 模型过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于 Snapwell 小室的专用垂直扩散系统 | 哈佛仪器 | 66-0001 | 多面体 &和六个 Snapwell 小室 |
| 胶囊 | 哈佛仪器公司 | 66-0020 | |
| O型圈 | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| 夹子 | 哈佛仪器公司 | 66-0012 | |
| Snapwell 滤器（孔径 0.4 μm) | 康宁科斯特 | 3407 | |
| Millicell ERS-2 伏欧电阻计 | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II 分光光度计 | Biochrom | 80-3003-72 |
参考文献
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
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