在有氧条件下进行细胞培养实验以研究细菌黏附和侵袭通常不能代表 在体 环境。垂直扩散室模型可用于研究人类病原体的相互作用 空肠弯曲菌 与肠道上皮细胞在更佳条件下共培养 体内类条件下，导致细菌侵袭性增强。
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摘要
摘要
细菌病原体与宿主细胞的相互作用已被广泛研究 体外 细胞培养方法。然而，由于此类细胞培养实验是在有氧条件下进行的，这些 体外 模型可能无法准确代表 体内 宿主与病原体相互作用发生的环境。我们已开发出一种 体外 一种允许细菌与宿主细胞在不同培养基和气体条件下共培养的感染模型。垂直扩散室（Vertical Diffusion Chamber, VDC）模型模拟了人体肠道内的环境，其中细菌处于极低氧条件，而组织则通过血液获得氧气供应。将生长于Snapwell插入式培养小室中的极化肠道上皮细胞（IEC）单层置于VDC中，可形成独立的顶腔和基底外侧腔室。基底外侧腔室中加入细胞培养基，密封后通入氧气进行灌注；顶腔腔室则加入液体培养基，保持开放状态，并在微需氧条件下孵育。在此条件下，Caco-2和T84两种IEC细胞均可在VDC中维持培养，对细胞存活率或单层完整性均未见明显不良影响。已利用该系统在不同条件下开展多种共培养实验 C. jejuni 野生型菌株和不同IEC细胞系在VDC模型中，当顶端室处于微需氧条件时，与需氧培养条件相比，可重复地导致相互作用的细菌数量（增加近10倍）和细胞内细菌数量（增加近100倍）显著上升1VDC模型所创造的环境更接近于实际遇到的环境 C. jejuni 在人类肠道中，并强调了进行 体外 更接近模拟真实情况的感染实验 体内 现实。我们提出，利用VDC模型将有助于对细菌病原体与宿主细胞之间相互作用进行新的解读。
引言
细菌病原体与宿主细胞的相互作用已被广泛研究 体外 细胞培养方法。利用此类细胞培养实验，已对细菌对宿主细胞的黏附、宿主细胞受体的鉴定、宿主细胞信号通路以及细菌侵入宿主细胞等过程进行了深入研究，并取得了大量重要发现。然而，此类细胞培养实验通常在有氧条件下进行，可能无法真实反映 体内 环境。一个主要限制是 体外 用于研究胃肠道感染的模型存在一个问题，即培养条件（包括高氧水平）通常有利于真核细胞的存活，而肠道腔内的环境几乎为厌氧状态。在极低氧环境中，肠道病原体会表达毒力基因，而这些基因在有氧条件下其表达会发生改变。2因此，使用标准细胞培养模型获得的数据可能无法准确反映细菌与宿主细胞之间的相互作用。
空肠弯曲菌 是全球细菌性急性胃肠炎的主要致病因子，其症状从轻度腹泻到严重的炎症性肠炎不等。大多数 C. jejuni 感染通常导致非复杂性胃肠炎，然而 C. jejuni 也是外周神经病（包括吉兰-巴雷综合征（GBS））中最常检出的感染性病原体。据估计，在英国，由其引起的肠炎病例每年超过50万例。 C. jejuni 每年感染造成的预计经济损失为英国经济带来 £5.8亿。在发展中国家， C. jejuni 是导致儿童死亡的主要原因。尽管其重要性毋庸置疑 弯曲杆菌 感染以及数十年的研究，包括基于基因组....
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方案
1. 在特殊0.4 μm 滤膜上培养肠上皮细胞单层
- 在标准组织培养箱中，于37 °C、5% CO2和95%空气条件下，使用添加了10% (v/v) 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和1% (v/v) 非必需氨基酸的Dulbecco改良必需培养基（DMEM）培养Caco-2细胞。每0.4 μm滤膜接种4 × 105个Caco-2肠上皮细胞，培养21天使其形成极化，每2–3天更换一次培养基。
- 使用伏特-欧姆电阻计测量经时跨上皮电阻（TEER），以确认单层细胞的极化状态。在我们的研究中，于这些0.4 μm滤膜上培养21天的Caco-2细胞TEER值为700–800 Ωcm2。
2. 准备 C. jejuni 共培养实验用的细菌培养基
- 在进行VDC共培养实验的预期起始时间前24小时，制备新鲜的含C. jejuni的血琼脂平板，并将其置于可变气氛培养箱中，于37 °C、微需氧条件（85% N2、5% O2和 10% CO2）下培养。
- 同时，在可变气氛培养箱中，将30 ml布氏肉汤置于37 °C、微需氧条件下预培养。
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结果
在VDC模型中，于顶端腔室采用微需氧条件，将C. jejuni野生型菌株与IEC细胞共培养的实验表明，与需氧培养条件相比，随着时间推移，与细胞相互作用的细菌数量（增加近10倍）以及细胞内细菌数量（增加近100倍）均显著上升1。该结果在两种不同的C. jejuni野生型菌株（11168H和81-176）以及两种不同的IEC细胞系（Caco-2和T84）中均能重复，凸显了VDC模型的可靠性1。
此处展示的代表性结果是对数量的比较 C. jejuni 在CO₂培养箱内的标准细胞培养实验条件下共培养3、6或24小时后，与Caco-2细胞相互作用或侵入Caco-2细胞2 培养箱（图2A 和 B）或在顶端腔室为微需氧条件的VDC模型中（图2C 和 D）。两种不同 C. jejuni 野生型菌株（11168H 和 81-176.......
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讨论
使用 体外 用于研究细菌病原体与宿主细胞相互作用的细胞培养方法，是许多研究实验室广泛采用的一种技术。然而，由于此类细胞培养实验通常在有氧条件下进行，这些 体外 模型可能无法准确代表 体内 宿主与病原体相互作用发生的环境。该环境被广泛使用 体外 感染模型特别不适用于研究微需氧菌 C. jejuni 与其他兼性厌氧的肠道病原体相比。文献中关于人类肠上皮细胞（IECs）侵袭机制的研究存在较大混淆 C. jejuni4,5我们推测，侵袭机制之所以如此难以被理解，是因为 体外 这些研究中使用的模型未能准确反映 体内 情况。使用标准的细胞培养检测方法，检测水平 C. jejuni IECs 的侵袭率始终非常低9VDC 模型的开发是我们为解决这一问题而提出的应对方案。
我们已证实，在微需氧条件下，两种不同的IEC细胞系可在VDC中于顶腔表面维持24小时，且未观察到任何不利影响1
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
Dominic Mills 获得了布卢姆斯伯里学院博士生奖学金（2007–2010年）的支持。作者谨此感谢 Ozan Gundogdu 和 Abdi Elmi 在建立 VDC 模型过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于 Snapwell 小室的专用垂直扩散系统 | 哈佛仪器 | 66-0001 | 多面体 &和六个 Snapwell 小室 |
| 胶囊 | 哈佛仪器公司 | 66-0020 | |
| O型圈 | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| 夹子 | 哈佛仪器公司 | 66-0012 | |
| Snapwell 滤器（孔径 0.4 μm) | 康宁科斯特 | 3407 | |
| Millicell ERS-2 伏欧电阻计 | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II 分光光度计 | Biochrom | 80-3003-72 |
参考文献
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al.
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重印与许可
