Summary
Esecuzione di test di coltura cellulare per indagare adesione batterica e l'invasione in condizioni aerobiche è di solito non rappresentativo della
Abstract
Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Abbiamo sviluppato un modello in vitro di infezione che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas. La camera di diffusione verticale (VDC) modello simula le condizioni nell'intestino umano, dove i batteri saranno in condizioni di tessuto, mentre molto basso di ossigeno sarà fornita con l'ossigeno dal flusso sanguigno. Posizionamento polarizzati cellulari (IEC) monostrati epiteliali intestinali cresciute in Snapwell inserisce in un VDC crea compartimenti apicale e basolaterale separati. Il vano basolaterale è riempito con mezzo di coltura cellulare, sigillato e perfusi con l'ossigeno wHilst compartimento apicale è pieno di brodo, tenute aperte e incubate in condizioni microaerobiche. Sia Caco-2 e T84 IECs possono essere mantenuti nel VDC in queste condizioni, senza apparenti effetti negativi sulla sopravvivenza delle cellule o l'integrità monostrato. Esperimenti Coculturing eseguiti con differenti C. jejuni ceppi wild-type e diverse linee IEC nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale riproducibile risultano in un incremento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche 1. L'ambiente creato nel modello VDC imita più da vicino l'ambiente incontrate da C. jejuni nell'intestino umano e mette in evidenza l'importanza di esibirsi in saggi di infezione in vitro in condizioni che mimano più da vicino la realtà in vivo. Noi proponiamo che l'uso del modello VDC consentirà nuove interpretazioni delle interazioni scommettonoween batteri patogeni e cellule ospiti.
Introduction
Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. L'uso di tali saggi di coltura cellulare, adesione batterica alle cellule ospiti, l'identificazione dei recettori della cellula ospite, cellula ospite vie di segnalazione e l'invasione batterica delle cellule ospiti sono stati tutti studiati in dettaglio, con conseguente molte importanti osservazioni. Tuttavia tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche che possono non essere rappresentativi della ambiente in vivo. Una limitazione importante di modelli in vitro utilizzati per studiare le infezioni gastrointestinali è che le condizioni di coltura tra cui alti livelli di ossigeno in generale favoriscono la sopravvivenza delle cellule eucariotiche. Tuttavia le condizioni nel lume intestinale saranno quasi anaerobica. Patogeni enterici in un ambiente povero di ossigeno esprimono geni di virulenza cui espressione cambia in condizioni aerobiche 2. Come tale, i dati ottenuti utilizzando standard di coltura cellulare modelli may dare un'indicazione imprecisa delle interazioni batteriche con le cellule ospiti.
Campylobacter jejuni è il principale agente eziologico della gastroenterite acuta batterica in tutto il mondo, con sintomi che vanno dalla diarrea lieve a grave enterite infiammatoria. La maggioranza di C. jejuni infezioni provocano gastroenterite non complicata, tuttavia C. jejuni è anche l'agente infettivo più comunemente identificato in neuropatie periferiche, incluse la sindrome di Guillain-Barré (GBS). Nel Regno Unito, si stima che ci siano oltre 500.000 casi di enteriti causate da C. jejuni infezione ogni anno, con un costo previsto per l'economia del Regno Unito di £ 580.000.000. Nel mondo in via di sviluppo, C. jejuni è una delle principali cause di mortalità tra i bambini. Nonostante l'indubbia importanza di infezione da Campylobacter e di decenni di ricerca, tra cui l'analisi genomica basata approfondita, C. jejuni patogenesi è ancora poco understood, a differenza di altri patogeni enterici come Salmonella, Escherichia coli, Shigella e Vibrio cholerae. La mancanza di un comodo piccolo modello animale è una delle ragioni principali per questo 3. Anche il ampiamente utilizzato in modelli di infezione in vitro sono più appropriati per lo studio microaerofili C. jejuni che per altri patogeni enterici che sono anaerobi facoltativi. Mentre C. jejuni è riconosciuto come un agente patogeno invasivo, i meccanismi di C. jejuni invasione delle cellule epiteliali intestinali (IECs) sono ancora poco chiari 4,5. C. jejuni invasione ha dimostrato di essere dipendente sia microfilamenti, microtubuli, una combinazione di entrambi o nessuno 5. La confusione in questa zona è molto probabilmente dovuta all'uso di appropriati nelle condizioni di saggio in vitro.
Un certo numero di differenti saggi di coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare le interazioni di C. jejunicon le cellule ospiti. Caco-2 6, 7 INT 407 e T84 8 linee cellulari sono stati tutti utilizzati per studiare le capacità di adesione e invasione di diversa C. ceppi jejuni. Tuttavia, i livelli di adesione batterica e invasione per C. jejuni con IECs sono notevolmente inferiori rispetto ad altri patogeni enterici 9. La coculturing di C. jejuni con IECs viene normalmente eseguita in un incubatore CO 2 in condizioni vicine a livelli di ossigeno atmosferico, necessaria per la sopravvivenza di IECs. C. espressione genica jejuni sarà molto differente nell'ambiente ossigeno basso del lume intestinale rispetto a condizioni di ossigeno atmosferico.
L'uso di un sistema di camera di diffusione verticale (VDC) è stato sviluppato che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas 1,10,11. Questo sistema simula le condizioni nell'intestino umano, dove i batteri saranno ONUder condizioni di tessuto mentre molto basso ossigeno saranno forniti con l'ossigeno dal flusso sanguigno. Monostrati polarizzati IEC coltivate in speciali 0,4 micron filtri sono stati collocati in un VCC creando un compartimento apicale e basolaterale, che sono stati riempiti singolarmente con brodo batterica e coltura cellulare rispettivamente (Figura 1). Il VDC è stata posta in atmosfera variabile incubatore contenente 85% N 2, O 2 5%, e 10% di CO 2 a 37 ° C, con condizioni ottimali per C. jejuni. Il compartimento apicale stata lasciata aperta ed esposta all'atmosfera microaerobica all'interno della variabile atmosfera incubatrice, mentre il vano basolaterale sigillata è stata fornita con l'ossigeno da una costante somministrazione di 5% 95% O 2 miscela di gas con un tubo di uscita evitando accumuli di pressione CO 2 / . Caco-2 sopravvivenza cellulare e integrità monostrato in queste condizioni sono state confermate dal monitoraggio ele transepitelialeResistenza ctrical (TEER) attraverso il monostrato oltre 24 ore per dimostrare sopravvivenza della separazione Caco-2 monostrato cellulare e fisica dei compartimenti apicale e basolaterale in condizioni di bassa ossigeno nel compartimento apicale. La TEER di monostrati in VDCs mantenuto in atmosfera incubatrice variabile (condizioni microaerobiche) ed in una coltura cellulare di CO 2 incubatore standard (condizioni aerobiche) non ha evidenziato differenze significative, indicando integrità del monostrato cellulare in diverse condizioni meteorologiche 1. In condizioni microaerobiche, giunzioni strette sono rimasti presenti e uniformemente distribuito tra i bordi delle celle con un pattern di colorazione occludina simili alle cellule mantenute in condizioni aerobiche 1.
Le interazioni di C. jejuni con Caco-2 e T84 cellule del VDC sono stati studiati per valutare l'interazione batterica (adesione e invasione) e l'invasione. Due diversi C. jejuni wild-type straiNS sono stati utilizzati 1. C. jejuni 11168H è un derivato hypermotile dell'originale ceppo sequenza NCTC11168. Il ceppo 11168H mostra molto più alti livelli di colonizzazione in un modello di colonizzazione pulcino ed è quindi considerato un ceppo adatto da utilizzare per studi di interazione ospite-patogeno. 81-176 è un umano isolare ed è uno dei più invasive ceppi di laboratorio ampiamente studiate. C. jejuni ceppi sono stati aggiunti al compartimento apicale di un VDC in condizioni sia microaerobiche o aerobico. Abbiamo osservato tassi più elevati sia per l'interazione e l'invasione sono stati registrati per C. jejuni in condizioni microaerobiche 1. L'aumento C. interazioni jejuni non erano dovuti ad un aumento del numero di batteri in condizioni microaerobiche 1. Questi dati supportano la nostra ipotesi che l'ambiente a basso ossigeno nel compartimento apicale del VDC migliora interazioni batteri-ospite e indica che le proprietà invasive di C. jejuni sono incrfacilitato in queste condizioni. Questo era il primo rapporto di utilizzo del modello VCC per studiare un patogeno batterico invasiva e mette in evidenza l'importanza di eseguire saggi di infezione in vitro in condizioni che imitare maggiormente la situazione in vivo. Il modello VDC potrebbe essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per molte differenti specie batteriche.
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Protocol
1. La crescita di monostrati IEC su speciali filtri 0,4 micron
- Coltura cellule Caco-2 a modificate mezzi essenziali di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina e 1% (v / v) aminoacidi non essenziali in un standard di coltura tissutale incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 e il 95% di aria. Seme di 4 x 10 5 Caco-2 IECs per 0,4 micron filtro e crescono di polarizzazione di 21 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni.
- Misurare la TEER per confermare lo stato di polarizzazione del monostrato utilizzando un misuratore di resistenza Volt-Ohm. Nei nostri studi, la TEER di 21 giorni Caco-2 cellule cresciute in questi filtri 0,4 micron è 700-800 Qcm 2.
2. Preparazione di C. jejuni e la Medi batterica per il saggio Coculturing
- 24 ore prima della partenza desiderata del saggio coculturing VDC, preparare un piatto fresco di agar sangue di C. jejuni e incubare a 37 ° C in condizioni microaerobiche (85% N 2, O 2 5% e 10% CO 2) nella variabile atmosfera incubatrice.
- Allo stesso tempo, Preincubare 30 ml di brodo brucella a 37 ° C in condizioni microaerobiche in un'atmosfera incubatore variabile.
3. Preparazione e sterilizzazione della mezza Chambers VDC prima del test
- Immergere completamente camere VDC mezzo così come gli O-ring e le spine nella soluzione di sterilizzazione.
- Usando una sterile siringa da 20 ml, lavare la soluzione di sterilizzazione attraverso le prese di gas in entrambe le camere e mezzo. In caso contrario si potrebbe causare la contaminazione dei campioni durante coculturing.
- Lasciare tutte le componenti immersi nella soluzione di sterilizzazione per> 1 ora.
- Risciacquare tutti i componenti con acqua fresca sterile, utilizzando un altro sterile 20 ml siringa per lavare le prese di gas.
4. Preparazionedi inoculo batterico
- Raccogliere metà un piatto di C. crescita jejuni dalla piastra di agar sangue preparato il giorno precedente in 1 ml di brodo brucella preincubato. Questo dovrebbe produrre ~ 10 10 ufc / ml.
- Misurare la densità ottica della sospensione batterica a 600 nm per semiquantify batteriche unità formanti colonie (CFU).
- Regolare la sospensione batterica al livello desiderato inoculo in 4 ml di brodo brucella preincubato.
- Eseguire una diluizione seriale a questa sospensione batterica finale successiva metallizzazione delle appropriate diluizioni su piastre di agar sangue in triplice copia ed incubare a 37 ° C in atmosfera variabile incubatore per 48 ore per quantificare il numero di CFU batteriche presenti nel inoculo.
5. Impostazione del VDC
- Posizionare la metà camera inferiore di un VDC piatta sulla panca. Montare un O-ring sulla camera di metà inferiore.
- Staccare un filtro che trasportano i IECs da tegli vettore e lavare tre volte con 400 ml di PBS sterile. Posizionare il filtro sulla camera di metà inferiore, assicurandosi che l'o-ring rimanga in posizione.
- Abbassare delicatamente la camera di metà superiore in posizione. Una volta che le due mezze camere sono assemblati, fissare insieme con l'anello-morsetti. Collocare il VDC orizzontalmente sul banco, con le due aperture rivolte verso l'alto.
- Aggiungere il 4 ml di inoculo batterico nella camera di metà apicale.
- Aggiungere 4 ml di mezzo di coltura cellulare nella metà camera di basolaterale.
- Mettere i pezzi di fine nelle aperture entrambe le camere e mezzo.
6. Fissaggio del VDC al collettore gas all'interno della variabile Atmosfera Incubator
- Collocare il VDC nella variabile atmosfera incubatore in prossimità del collettore gas.
- Aprire il regolatore di alimentazione gas collegato al collettore gas. Fissare il tubo dal collettore in ingresso del gas sulla metà camera di basolaterale del VDC. Fissare il gas tubo di uscita che porta fuori dell'atmosfera variabile incubatore a uno dei punti vendita del codolo sulla metà camera di basolaterale.
- Chiudere l'altra presa alla fine-pezzo sulla metà camera di basolaterale. Apertura del flusso del gas sul collettore gas, avendo cura di aprire molto lentamente per evitare la pressione del gas in eccesso, in quanto questo può portare all'espulsione del mezzo basolaterale.
- L'obiettivo è un flusso di gas di 1 bolla ogni 2-5 sec. Controllare periodicamente il flusso di gas durante il corso dell'esperimento e regolare se necessario.
7. Smontaggio del VDC dopo co-coltura
- Dopo il periodo di co-coltura appropriato, chiudere il regolatore di alimentazione gas collegato al collettore gas. Chiudere il flusso di gas nel Vcc nel collettore. Scollegare l'ingresso del gas, l'uscita del gas ed il fermo dalla VDC.
- Rimuovere il VDC da un'atmosfera incubatore variabile. Rimuovere il surnatante apicale e basolaterale e conservare a -80 ° C per subsequent analisi.
- Rimuovere i morsetti ad anello e delicatamente smontare il VDC. Rimuovere il filtro dalla camera di metà e trasferimento in un piatto di coltura cellulare da 6 pozzetti sterili. Lavare le IXC tre volte con 400 ml di PBS sterile.
- Per il conteggio del numero totale di batteri interagenti, aggiungere 400 ml di PBS sterile contenente 0,1% (v / v) Triton X-100 al IECs e incubare per 20 min a temperatura ambiente per lisare il CEI. Eseguire una diluizione seriale a questa lisato cellulare successiva metallizzazione delle appropriate diluizioni su piastre di agar sangue in triplice copia ed incubare a 37 ° C in atmosfera variabile incubatore per 48 ore per quantificare il numero di interagire CFU batteriche.
- Per il conteggio del numero totale di batteri invasori, aggiungere 400 ml di DMEM cella mezzo di coltura contenente 150 ug / ml di gentamicina ai IECs ed incubare per 2 ore in un incubatore per colture tessuto normale a 37 ° C in 5% di CO 2 e il 95% AIR per uccidere i batteri extracellulari,poi seguire come al punto 7.4 di cui sopra.
8. Pulizia del VDC dopo co-coltura
Lavare il VDC con acqua sterile e conservare per la prossima tornata di esperimenti.
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Representative Results
Esperimenti Coculturing eseguite con il C. jejuni ceppo selvatico e IECs nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale hanno dimostrato un aumento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche in un momento maniera dipendente dalla 1. Questa osservazione era riproducibile utilizzando due diversi C. jejuni ceppi wild-type (11168H e 81-176) e due linee IEC diversi (Caco-2 e T84), mettendo in evidenza la validità del modello VCC 1.
I risultati rappresentativi presentati qui sono un confronto tra il numero di C. jejuni interagendo con o invadere cellule Caco-2 dopo 3, 6, o 24 ore di co-coltura sia sotto coltura cellulare condizioni di saggio standard in un incubatore CO 2 (Figure 2A e B) o nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel com apicalevano (Figure 2C e D). I dati per due diverse C. jejuni ceppi wild-type (11168H e 81-176) sono presentati. Sotto le condizioni di coltura cellulare standard utilizzate nella stragrande maggioranza degli studi nella letteratura scientifica, <10 7 cfu state osservate interazione con cellule Caco-2 (Figura 2A) rispetto a ~ 10 8 cfu osservata interazione con cellule Caco-2 nel VDC modello (Figura 2C) dopo 24 ore. Dopo coculture nel modello VDC, ~ 10 7 cfu intracellulare sono stati isolati da cellule Caco-2 (Figura 2D), rispetto a solo ~ 10 5 intracellulare cfu isolati da cellule Caco-2 (Figura 2B) dopo co-coltura in condizioni standard di coltura cellulare per 24 hr.
Un confronto diretto tra il numero di C. jejuni interagire con o invadere IECs dopo co-coltura nel modello VDC sia con microaerobica o aerobica condizionizioni nel compartimento apicale è stata eseguita in precedenza 1. Utilizzare dei risultati del modello VDC in un aumento interagendo C. jejuni di quasi 10 volte e un aumento intracellulare C. jejuni di quasi 100 volte dopo 24 ore co-coltura 1.
Figura 1. Schematica della camera di diffusione verticale (VDC) cellule epiteliali intestinali modello. (IXC) vengono coltivate su permeabili 0,4 micron filtro supporta e inserito in un VDC, creando così un apicale e un compartimento basolaterale. Questi vani possono quindi essere regolati individualmente rispetto alla media e composizione di gas per consentire l'coculturing delle IECs con C. jejuni con condizioni microaerobiche alla superficie apicale delle IECs e condizioni aerobiche sulla superficie basolaterale delle IECs.
Figura 2. Rappresentante dei risultati confrontando i numeri di C. jejuni 11168H o 81-176 ceppi wild-type che interagiscono con (A e C) o di invadere (B e D) cellule Caco-2 dopo 3, 6 o 24 ore quando il test è stato eseguito in co-coltura sia condizioni standard di coltura cellulare in un CO 2 incubatore (A e B) o nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale (C e D). Tutti gli esperimenti rappresentino almeno tre biologica replicati eseguiti in duplicato in ogni esperimento. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
L'uso di metodi di coltura cellulare in vitro per studiare le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti è una tecnica largamente impiegata in molti laboratori di ricerca. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l'ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Il ampiamente usato in modelli di infezione in vitro sono particolarmente appropriati per lo studio microaerofili C. jejuni rispetto ad altri patogeni enterici che sono anaerobi facoltativi. Vi è una notevole confusione nella letteratura per quanto riguarda i meccanismi di invasione di IECs umani di C. jejuni 4,5. Suggeriamo che la ragione dei meccanismi di invasione sono così poco conosciute perché i modelli in vitro utilizzati in questi studi non riflettono accuratamente la situazione in vivo. Utilizzando saggi standard di coltura cellulare, il livellodi C. jejuni invasione di IECs è sempre molto bassa 9. Lo sviluppo del modello VCC è stata la nostra risposta per risolvere questo problema.
Abbiamo stabilito che due diverse linee IEC possono essere mantenuti nella VDC con condizioni microaerobiche alla superficie apicale senza effetti sfavorevoli osservato per un periodo hr 24 1. Un aumento dipendente dal tempo dei numeri di entrambi interagenti e intracellulare C. jejuni 11168H wild-type ceppo di batteri è stata osservata dopo coculturing con Caco-2 IECs del VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale 1. Queste osservazioni sono state ulteriormente confermate tramite una seconda linea IEC (T84), nonché una seconda C. jejuni ceppo selvatico (81-176), che indica nessuna linea di cellule batteriche o di specifici effetti di deformazione 1. Tale aumento dei livelli di interazione invasione batterica e risultato di accrescere, risposta immunitaria innata polarizzato dalla IECs 1. Higi suoi livelli di IL-8 sono stati rilevati dopo coculturing microaerobica, il che indica che la maggiore sfida batterica è accompagnata da un aumento della risposta dell'ospite. Livelli più elevati di IL-8 sono stati rilevati nei surnatanti basolaterale rispetto ai supernatanti apicali, indicando che la secrezione di IL-8 da parte IECs verifica prevalentemente dalla superficie basolaterale IEC. IL-8 è come attrattivo neutrofili, che sarebbe di uso limitato nel lume intestinale. Questi dati dimostrano che la configurazione a due compartimentale del VDC consente anche per l'identificazione di una efficiente risposta dell'ospite polarizzata.
Diverse caratteristiche riguardanti il lato tecnico / configurazione del modello VDC devono essere considerati prima di applicare il modello per studiare qualsiasi organismo patogeno. In primo luogo, le IECs devono essere coltivate per formare un monostrato impermeabile su speciali filtri 0.4 micron. Questo richiede tra 14-21 giorni a seconda della linea cellulare utilizzata e rende gli esperimenti alquanto lunghi rispetto al classico cocultuesperimenti anelli eseguiti in piastre di coltura cellulare e l'utilizzo di IECs coltivate per tra 1-7 giorni. D'altra parte, solo dopo un lungo periodo di crescita sono le IECs dimostrato di formare un monostrato completamente polarizzato. Tali monostrati polarizzati imitano la situazione in vivo nell'epitelio intestinale umana molto più strettamente le linee non-polarizzata, nonconfluent IEC utilizzati in alcuni studi e, come tale fornire un altro vantaggio del modello VDC. In secondo luogo, gli speciali filtri di 0,4 micron sono notevolmente più costoso di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti standard. Il principale limite del VDC è il relativamente basso rendimento. Ciò è dovuto principalmente alla disponibilità di camere VCC e la configurazione richiedono il collettore gas. Solo relativamente di basso numero di repliche parallelo possono essere eseguite contemporaneamente, a differenza del metodo di coltura cellulare classico. Il modello VDC è pertanto meno indicato per esperimenti di screening su larga scala o esperimenti richiedono un elevato numero di replicaTES. Un altro fattore da considerare è che l'effetto della gravità di eseguire saggi co-coltura nel modello VDC significa che oltre batteri ora inizia a aggregare sul fondo del compartimento apicale conseguente riduzione della possibilità di un'interazione con il monostrato IEC. Tuttavia utilizzando il modello VDC, abbiamo dimostrato che le interazioni di un nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN mutante sono notevolmente ridotti rispetto alla motilità, aggregando ceppo wild-type 11168H dopo 6 ore 1. Attualmente stiamo lavorando su modifiche al modello VDC che dovrebbero permettere un mixing nel compartimento apicale che avrebbe più da vicino imitare peristalsi nel lume intestinale. Pertanto, mentre il modello VDC è migliore, i metodi di coltura cellulare aerobici classico grazie ad ulteriori mimando la situazione in vivo, specialmente per i batteri come C. jejuni che ha requisiti rigorosi atmosferici, il modello VDC presenta ancora alcune limitazioni che devono essere presein considerazione durante la progettazione di esperimenti.
Nostra dati supporta i risultati riportati per un modello VDC analogo utilizzato per studiare il patogeno umano gastrica Helicobacter pylori, che ha mostrato una maggiore adesione batterica alle cellule ospiti, aumentata sintesi di fattori di virulenza batterici nonché un host risposta immunitaria innata aumentata quando H. pylori è stato co-coltivate con cellule epiteliali sotto microaerobica rispetto alle condizioni aerobiche 11. Come sia H. pylori e C. jejuni richiedono condizioni microaerobiche per la crescita, la constatazione che le condizioni microaerobiche promuovere l'interazione dei microrganismi con cellule ospiti è sorprendente. Tuttavia, un altro studio con un sistema VDC per analizzare le interazioni dei anaerobio facoltativo enteroemorragica Escherichia coli con IECs ha dimostrato un aumento dei livelli di interazione dei batteri in condizioni di co-coltura anaerobiche / microaerobica nel compartimento apicale VDC 10. Tindica che il suo comportamento di batteri che sono in grado di proliferare in condizioni di ossigeno atmosferico viene modificata anche quando co-coltivate con IECs in condizioni anaerobiche / microaerobica. Questo suggerisce che il modello VCC è un modello migliorato e di valore per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno di molti batteri patogeni differenti in condizioni che assomigliano più fedelmente la situazione in vivo nel lume intestinale umana.
Dal punto di vista del modello, il modello VDC ha dimostrato di possedere alcuni chiari vantaggi rispetto aerobica in C. jejuni modelli coculturing-IEC vitro. L'ambiente creato nel modello VDC imita più da vicino l'ambiente nell'intestino umano durante C. infezione jejuni, portando ad un aumento altamente significativo numero di batteri interagiscono con e invadendo le IECs. Il modello VDC in questo formato corrente è ideale per studiare le interazioni dei batteri enterici con gastrica o intestinalecellule epiteliali, ma c'è la possibilità di adattare il modello VCC per lo studio delle severe anaerobi da campioni di feci o per i campioni microbiologici orali, come solo due esempi. Il principio fondamentale deve sempre essere quello di mirare a svolgere questi esperimenti co-coltura in condizioni che mimano più da vicino la situazione in vivo. Il modello VCC sarà uno strumento importante per ulteriori studi di C. jejuni interazioni ospite-patogeno e dovrebbero essere applicabili allo studio dei meccanismi patogenetici di molti batteri diversi.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Dominic Mills è stato sostenuto da un Bloomsbury Collegi PhD Studentship (2007-2010). Gli autori desiderano ringraziare sia Ozan Gundogdu e Abdi Elmi per la loro assistenza nello sviluppo del modello VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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