Summary
Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.
Abstract
Lipoxygenase (LOX) 활동은 알츠하이머 병과 같은 신경 퇴행성 질환에 연루되었지만 파킨슨 병 (PD) 병기 발생에 미치는 영향은 덜 이해됩니다. 유전자 환경 상호 작용 모델은 단독으로 유전 적 또는 독성 질병 모델을 사용하여 관찰되지 않을 수 있는 독성에 있는 특정 세포 통로의 충격을 마스킹해제에 있는 유틸리티가 있습니다. 뚜렷한 LOX 이소지메스가 PD 관련 신경변성에 선택적으로 기여하는지 평가하기 위해,형질전환(즉, 5-LOX 및 12/15-LOX 결핍) 마우스는 장애에서 세포 손상과 사망을 모방한 독소로 도전할 수 있다. 여기서 우리는 PD와 관련된 신경 변성에 LOX isozymes의 뚜렷한 기여를 해명하기 위해 nigrostriatal 병변을 생성하는 신경 독소, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라 하이드로피리딘 (MPTP)의 사용을 설명합니다. 마우스에 MPTP의 사용, 비 인간 영장류, PD의 nigrostriatal 손상을 재현하기 위해 잘 설립된다. MPTP 유도 병변의 정도는 도파민의 HPLC 분석과 대사산물 및 티로신 하이드록실라제(TH)에 대한 스트리에이텀의 반정성 서양 얼룩 분석에 의해 측정되며, 도파민합성을 위한 속도 제한 효소이다. LOX 이소지메 선택적 감도를 입증할 수 있는 염증성 마커를 평가하기 위해, 글리아 세동 산성 단백질(GFAP) 및 이바-1 면역조직화학은 실질적인 니그라를 함유하는 뇌 단면에서 수행되며, GFAP 웨스턴 블롯 분석은 현저균질상에서 수행된다. 이 실험적인 접근은 nigrostriatal 변성 및 PD의 근본적인 유전자 환경 상호 작용에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
유전자 환경 상호 작용 모델의 사용은 특발성 파킨슨 병 (PD)에 영향을 미칠 가능성이 있는 위험 요소를 모방하는 접근법을 제공하고 유전적 또는 독성 시스템만1,2를사용하여 해명될 가능성이 없는 기계론적 통찰력을 분별할 수 있는 기회를 제공한다. 여기서 우리는 이 점을 설명하고 신경염증 및독성에대한 립산소증(LOX)의 선택성을 더 잘 이해하기 위해 니그로스트리아탈 변성3의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 마우스 모델의 적용을 설명한다. LOX isozymes에 대한 역할은 뇌졸중7 및 알츠하이머 병8,9를포함한 CNS 질환뿐만 아니라 말초 장애5,6에서 널리 평가되었지만, PD와 관련된 니그로스 트리아탈 기능 및 변성에서 이소지메의 가족의 역할은 잘 이해되지 않고 연구를 보증한다. MPTP 신경독소는 니그로스트리아탈 통로의 우대변성을 입증하고 PD환자(10)의운동장애를 뒷받침하는 스트루아탈 도파민 고갈 및 니그랄 도파민 세포 손실을 재구성한다. 이 모델은 비운동 및 모터 PD 행동과 솔직한 α-synuclein 양성 Lewy 신체 병리학의 전체 간부를 재현하지는 않지만, 111에 의해 안정적으로 nigral cell death를 생산할 수 있는 최고의 특성이 있는 비침범성 모델이기 때문에 nigrostriatal 손상및초기 단계 번역 테스트에 기여하는 새로운 기계성 표적을 해명하는 데 유용했습니다. 급성, 아급성에서 만성16-18에이르기까지 패러다임으로 MPTP 마우스의 광범위한 사용은 치료요법18,21,22에따라 다른 독성 메커니즘의 활성화와 함께19,20에서 심한 nigrostriatal 손상으로 가벼운 결과를 초래하는 투약의 표준화를 허용했다. 따라서, 이는23-25를활용한 치료제 또는 형질전환 모델에 따라 개선되거나 감소된 니그로스트라탈 손상을 초래할 수 있는 '병변의 창'을 허용한다.
또한 번역 및 발견 생물학 연구 결과에 필수적인 손상을 평가하는 데 사용되는 기술과 그러한 방법이 제공하는 증거입니다. MPTP 마우스 모델의 경우, 병변을 평가하기 위한 확립된 지표는 HPLC에 의한 도파민 및 대사산물을 포함한 현트리아탈 도파민의 마커, 티로신 하이드록실라제(TH), 도파민 합성의 속도 제한 효소 및 면역학적 인 비올레를 이용한 퇴행성 발생의지표이다. 이들은 고전적인 신경 화학, 생화학적, 및 조직학적 절차이지만, 기술은 nigrostriatal dopaminergic 통로 내의 손상의 정도에 중요하고 재현 가능한 판독을 제공하고, 독성의 메커니즘을 나타내며, PD의 퇴행성 사건을 이해하는 데 중요한 도구가 입증되었습니다.
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Protocol
참고: 모든 동물 절차 및 동물 관리 방법은 기관의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아야 합니다. 여기에서 기술된 연구는 SRI 인터내셔널의 IACUC에 의해 수립된 지침에 따라 수행되었습니다.
1. LOX 결핍 마우스의 획득 및 유지 보수
- 5-LOX 결핍 또는 12/15-LOX-결핍 마우스와 7-8 주에 각각의 변형 및 성일치 제어를 구입하고 도착 후 시설에 적응하기 위해 며칠을 허용하십시오.
- 12-h 밝은 어두운 주기에 그룹 하우징에서 마우스를 유지하고 음식과 식수 광고 리비툼을제공합니다.
2. MPTP 예방 조치, 저장, 준비, 오염 제거 및 폐기
참고: 인간에 있는 정맥 노출에서 MPTP 중독은 파킨슨증을 일으키는 원인이 되기 위하여 보였습니다10; MPTP는 매우 지평성이며 혈액 뇌 장벽(26)을쉽게 교차 할 수 있습니다. 안전한 취급, 해독 및 폐기를 보장하기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 그것의 물질 대사는 효소 monoamine 산화 효소 B (MAO-B)27에의하여 1-메틸-4-페닐-2,3-디하이드로피리디늄으로 변환을 포함하는 다중 단계를 포함한다. MAO-B 억제제는 우발적인 인간 중독의 경우에 이용될 수 있다.
- MPTP를 기관의 보건 안전 위원회의 지시에 따라 활용하기 전에 적절한 안전 및 취급 교육을 받을 수 있도록 하십시오. 각 기관은 문헌17,22에종합적으로 설명된 권장 사항을 기반으로 MPTP 사용을 위한 자체 표준 운영 절차를 수립하고 구현할 수 있다.
- 준비 에 앞서 일회용 실험실 코트 또는 전신 정장, 더블 니트릴 장갑, 수술 용 마스크, 헤어 커버, 안전 고글 및 일회용 신발 커버를 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. 적절한 PPE는 동물 및/또는 침구를 취급할 때 MPTP, 주사 패러다임 및 72 시간 후 주입의 준비 도중 착용되어야 합니다.
- 준비하기 전에 계산을 수행합니다. 체적 수수에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 100-150 μl의 전달은 전형적으로 25-30 g 마우스에 사용된다.
- 식염수에 3 mg / ml MPTP 솔루션을 준비하려면 보정 계수 (1.211 MPTP-HCl : 1.0 MPTP 무료 베이스);를 적용하십시오. 식염수 차량에서 MPTP-HCl의 농도는 3.633 mg/ml입니다.
- 신경 독소를 처리하기 전에 MPTP 준비 및 잠재적 유출 제거에 필요한 모든 장비, 소모품 및 시약을 준비하십시오.
- 적절한 저장소 위치에서 MPTP-HCl 소스 바이알을 제거합니다.
참고: MPTP는 보조 컨테이너 내의 닫힌 바이알에서 RT에서 유지 관리되어야 하며 "MPTP"라고 표시된 잠긴 캐비닛 내에 저장되어야 합니다.- 포장패드 나 종이 타월로 주변 비늘을 덮어 10 % 표백제 용액으로 감쇠하여 유출 된 분말의 위험을 줄입니다. 예방 조치로 조직과 10 % 표백제 용액을 근처에 두십시오.
- 연기 후드에 있는 분석 균형을 사용하여, 무게 50 MPTP-HCl의 mg 유리 유리 병에 10% 표백에 젖은 조직을 포함 하는 이차 봉쇄. 유리 유리 바이알 "MPTP"에 농도 및 날짜로 레이블을 지정합니다.
- 소스 바이알을 닫고 10 % 표백제로 외부를 닦으셔.
- 13.763ml의 멸균 식염수식을 바이알에 천천히 넣고 믹싱을 위해 완전히 닫습니다. (용액은 3.633mg/ml MPTP-HCl입니다.)
- 후드에서 0.22 μm 필터를 사용하여 10% 표백제에 젖은 조직으로 이차 용기 내에 라벨이 부착된 주입 유리알로 여과하여 MPTP 용액을 신중하게 살균합니다. 표백제에 흠뻑 젖은 조직으로 유출을 청소하십시오.
- 적절하게 라벨이 부착된 생체 위험 용기에 날카로운 유리병을 조심스럽게 폐기하십시오. 동물 시술실로 운반하기 위해 표백제에 젖은 조직으로 보조 용기에 MPTP 용액을 유지하십시오.
참고: 기화가 흡입 위험이 있기 때문에 멸균을 위한 MPTP 솔루션을 자동 clave하지 마십시오.
- MPTP 소스 바이알을 보조 컨테이너로 반환하고 저장 위치에 배치합니다. 10% 표백제사용으로 주걱, 분석 스케일 및 후드 표면을 10분 동안 오염 제거합니다.
3. MPTP 관리
- "MPTP"(와이어 푸드 그릴 제외), 일회용 케이지 라이너, 습식 식품 펠릿 및 하이드로겔을 수원으로 표시하는 폴리에스테르 여과 라이너가 포함된 표준 미세화기 천공 뚜껑이 있는 일회용 케이지를 준비합니다. 모든 동물의 무게와 기록 볼륨 3 mg/ml MPTP 식염수에 필요한 15 mg/kg 주입.
참고: MPTP 대사산물은 주사28,29다음에 3일 동안 배설물에서 검출할 수 있습니다. 그러나, 마우스는 MPTP n-oxide, 그것의 친성 때문에 막을 교차하지 않는 비독성유도체를 배설한다 (30).- 위에 나열된 모든 PPE를 착용하고 일회용 흡수 패드 위에 마우스를 들고, 일회용 26 게이지 결핵 주사기로 4 일 동안 매일 4 일 동안 15 mg / kg 용량에 대한 식염수 차량 또는 MPTP 용액을 주입합니다.
- 사용 후 주사기를 요약하지 마십시오. 전용 및 라벨이 부착된 MPTP 바이오 위험 샤프 용기에 넣습니다. 10% 표백제와 조직을 근처에 유지하여 우발적인 드립을 청소하십시오.
- 일회용 케이지에 MPTP로 주입된 동물, 케이지당 최대 5마리의 마우스를 배치하고 오픈 랙에 집을 놓습니다. 통풍이 잘 되는 랙은 사용하지 마십시오.
- 마지막 주입 후 72 시간까지 마우스와 하우징 룸 도어가 들어있는 랙에 MPTP를 놓습니다.
참고: 마우스가 MPTP 중독 후 최대 12시간까지 과도 저체온증을 경험하기 때문에 하우징 룸의 온도가 22.2- 24.4oC 사이인지 확인합니다. 31 - 사용 후 표백제로 작업 표면을 오염 제거(단계 2.8 참조), 남은 MPTP 용액을 10%에 상응하는 부피를 첨가하여 폐기하고, 생물유해액체 폐기물로 내용물을 폐기한다.
- 사용된 PPE를 전용 폐기 빈에 모두 폐기하십시오. 필요한 경우 폐기 하기 전에 10% 표백제와 함께 스프레이.
- 마지막 주입 후 72 시간까지 마우스와 하우징 룸 도어가 들어있는 랙에 MPTP를 놓습니다.
- 동물을 정기적으로 확인하고 마지막 주입 후 72 시간 동안 주사 패러다임 동안 매일 음식과 수원을 새로 고칩니다. 참고: 케이지 외부를 둘러싼 지역에서는 오염이 예상되지 않지만, 이 지역은 예방 조치로 표백제 용액으로 처리됩니다(2.8단계에 설명된 대로). 이 기간 동안 모든 마우스와 장비를 취급할 때주의해야 합니다.
- 마지막 주입 후 3 일, 적절하게 라벨 바이오 위험 가방에 모든 케이지와 라이너를 폐기. 동물을위한 일반 PPE 및 일반 주택의 사용을 재개; 문과 선반 플래카드를 제거합니다.
4. 조직 수확
- 마지막 MPTP 주입 다음 7 일 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 안락사. 관상 평면에 1mm 슬롯과 사전 차가운 뇌 금형을 사용하여 얼음에 즉시 뇌를 해부.
- 전방 분리의 수준에서 2mm 두께의 전뇌 슬라이스에서 줄무늬를 해부합니다.
- 메스를 사용하여 주변 피질 및 피질 영역을 제거합니다. 신경화학적 또는 생화학적 분석을 위한 별도의 1.5ml 마이크로센심분리기 튜브에서 각 반구의 스냅 동결 줄기 조직.
- 전방 시상 하 부 및 침지 수정 조직의 수준에서 관상 평면에서 중간 뇌 /힌뇌를 차단 4% 포름알데히드 수성 용액.
5. 조직 처리
- 생화학 공정
- 200-μL Tris-EDTA 용해 완충제(25m Tris-EDTA 베이스, 1:100 프로테아제 및 인산염 억제제 칵테일)에서 초음파 세포 파괴기를 사용하여 한 반구의 현저 조직을 10-12Hz에서 10펄스, 10-12Hz에서 10°C로 균질화하고 10분 X10에서 10°C에 10°C에 대한 원심을균질화하였다.
- 신중하게 슈퍼 나탄을 흡인하고, 150 μl 용해 버퍼에서 펠릿을 재구성. 분수는 SDS 페이지와 서양 블로팅에 의한 생화학 적 분석에 사용됩니다.
참고: 수성 용액의 불안정성으로 인해 준비 의 1 시간 이내에 프로테아제 및 인산 억제제 함유 버퍼를 사용합니다.
- 신경화학 과정
- HPLC에 대해 -80°C에 저장된 각 샘플에서 다른 반구에서 해부된 줄무늬를 활용합니다. 얼음에 미세 분리 튜브에 ttriatal 조직을 해동, 500-μl 0.3N 과염소산 (PCA)를 추가하고 초음파 처리를 사용하여 균질화.
참고: 0.3N PCA 100ml를 만들고, 90ml ddH2O를 측정하고, 100ml 졸업 실린더에 추가하고, 2.58 ml의 70% PCA를 추가하고, 100ml 마크를 넣습니다. 이 샘플 버퍼는 최대 1개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. - 500 μl 얼음-차가운 0.3N PCA에서 striatal 조직을 초음파 처리하여 10-12Hz에서 10 펄스를 원하고 얼음 위에 놓습니다. 균질성을 보장하기 위해 샘플을 10초 동안 두 번째로 초음파 처리한 다음 원심분리기는 16,100xg에서4oC에서 12분 동안 원심분리기를처리합니다.
- 즉시 1.5ml 마이크로 센트심분리기 튜브에 상신을 데칭하고 -80 ° C에 저장합니다. 후드의 펠릿 분획을 공기 건조시.
- 전기화학적 검출을 통해 HPLC에 의해 도파민과 대사산물, 3,4디하이드록시페닐레이스산(DOPAC) 및 호모바닐라산(HVA)을 측정하기 위해 사용할 때까지 -80°C에서 상체를 유지한다.
- 일단 건조되면 0.5N NaOH (500 μL)로 펠릿 분수를 재구성하고 잠시 초음파 처리합니다. 로우리 방법을 사용하여 총 단백질의 측정을 위해 사용할 때까지 재구성된 펠릿 분수를 4°C에 저장합니다.
- HPLC에 대해 -80°C에 저장된 각 샘플에서 다른 반구에서 해부된 줄무늬를 활용합니다. 얼음에 미세 분리 튜브에 ttriatal 조직을 해동, 500-μl 0.3N 과염소산 (PCA)를 추가하고 초음파 처리를 사용하여 균질화.
- 면역 히스토케스화학 공정
- 침수 수정 중뇌 블록 하룻밤 4% 포름알데히드 수성 용액 및 저온 보호 등급 자당 용액 (10% 인산염 완충 식염수 (0.01 M PBS; 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, ddH2O, pH 7.4) 24시간, 4°C에서 조직이 가라앉을 때까지 PBS에서 30%. 과도한 자당 용액을 제거하고 드라이 아이스를 얼리고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하기 위해 잠시 냉동 보호 블록을 얼룩.
- 극저온에서 중뇌와 뒷뇌를 포함하는 뇌 블록의 미세 절개.
- -80°C에서 조직을 제거하고- 16°C에서 -16°C로 대화하여 극저온에서 1h로 상량화하고, 조직 포함 매체에 장착합니다.
- -16°C에서 40μm 두께의 관상 계면을 냉동 보호용 용액(0.01M PBS 30%, 에틸렌 글리콜 30%, pH 7.4)으로 수집합니다. 조직을 연속적으로 6 1.5ml 마이크로센심심분리기 튜브로 240m 간격으로 수집하고 -20°C에 보관하십시오.
6. 면역 블로팅
- BCA 분석체에 의해 현액 상피 분획(섹션 5.1에 설명된 대로 제조)에서 단백질 농도를 결정합니다.
- 각 샘플에 필요한 희석을 계산하여 20 μl의 부피로 잘 전달되는 우물당 10 μg를 산출합니다.
- 1X Laemmli 버퍼 용액에서 10 μg 단백질을 산출하기 위해 4X Laemmli 완충제 및 균질화 완충제로 상체 단백질을 희석합니다. 예제 계산:
- 필요한 단백질과 부피의 최종 농도를 결정합니다. 이 경우 20 μl(0.5 mg/ml)에 10 μg가 필요합니다.
- 필요한 단백질 용액의 최종 양을 결정합니다. 적재를 위해서는 20μl이 필요하지만 추가 부피가 30 μl을 준비해야 합니다.
- 최종 부피 및 농도가 공지되고, 단백질 상골 분획의 농도가 공지되기 때문에(BCA 분석체에 의해 결정됨), 방정식을 사용하여 요구되는 단백질 상피물의 부피를 계산합니다.
V상골 = (V파이널 x C파이널)/C 상체
따라서, 1.5 mg/ml의 상체 단백질 농도를 위해,
V수퍼네티드 = (30 μl x 0.5 mg/ml)/1.5 mg/ml
V상수 = 10 μl - 30 μl/4 = 7.5 μl에서 1배 농도를 산출하는 데 필요한 4배 Laemmli 버퍼의 양을 계산합니다. 참고: 4X Laemmli 버퍼는 샘플 준비에서 1배 강도로 희석되어야 합니다.
- 부피를 30 μl로 가져오는 데 필요한 균질화 버퍼의 양을 계산하고 원하는 최종 단백질 농도0.5 mg/ml를 얻습니다.
- 균질화 완충제의 12.5 μl에 단백질 상류제의 10 μl을 피펫팅 한 다음 소용돌이로 샘플을 준비합니다. 30 μl 샘플 작업 용액과 0.5 mg/ml 농도에 4X Laemmli 버퍼7.5 μl을 추가합니다.
- 설명된 절차를 사용하여 모든 샘플을 준비하고, 소용돌이를 사용하고 5 분 동안 끓입니다.
참고: 스크류 탑 마이크로센심분리기 튜브를 사용하여 끓는 동안 압력으로 인한 누출 및 개방을 방지합니다. - 5분 후, 즉시 얼음 위에 놓습니다. 젤당 시료 작동 용액 20 μl(단백질 10μg)을 적재합니다. 12% 트리스 글리신 젤에 SDS-PAGE에 의해 별도의 단백질 샘플.
- 분자량의 확인을 위해 미리 얼룩진 단백질 사다리를 사용하십시오. 러닝 버퍼는 25m Tris-베이스, 192m 글리신, 0.1% SDS, ddH2O, pH 8.3이다.
- 전기 포고증에 의해 단백질을 분리 : 단백질을 해결하기 위해 우물 (10 분)과 125 V (약 1 시간; 단백질 사다리가 완전히 분리 될 때까지)를 취소80 V에서 실행합니다.
- 트리스 글리신 전달 버퍼 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 0.04 % SDS, 20 % 메탄올 및 ddH2O, pH 8.3)에서 0.2 μm 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 단백질 - 니트로 셀룰로오스 전이를 수행 4 ° C에서 40 V.
- 1x 트리스 식염수(TS; 25mM Tris, 0.9% NaCl in ddH2O, pH 7.4)로 씻어낸 후 Ponceau S의 lncubate에서 10분 동안 10분 동안 ddH 2 O로 헹구고 ddH2O에서 헹구고 동등한 단백질 로딩의 대략적인 검증을 제공한다. 이미지를 스캔하여 PBS를 사용하여 노트북 및 데스테인에 대한 레코드를 유지합니다.
참고: 밀리-Q 또는 HCl을 함유한 ddH2O로 블롯을 세척(0.2%) 약 5 분 동안. 레코드를 검색합니다. 후속 배양 단계(즉, 차단 버퍼에 배치)에 의해 멤브레인에서 Ponceau S 얼룩을 제거합니다. - TS에서 5% 비지방 분유에서 1시간 동안 TS에서 블로트 블롯을 차단하고 토끼 안티 티로신 하이드록실라세(1:1000), 항β-액틴(1:200)으로 4ºC에서24h를배양합니다. 안티 GFAP (1:1000) 5 % 우유 -TS.
- TS에서 0.05% Tween-20 및 1 x 5분으로 TS에서 3 x 5분 세척한 다음 HRP-컨쥬게이드 이차 항체(5%의 우유를 함유한 TS의 1:5000)에서 배양한 다음, RT에서 2h의 종에 일치합니다.
- 루미노 및 과산화수소 용액의 동일한 볼륨을 사용하여 화학 발광 기판을 준비하고 1-3 분 동안 신청하십시오. 암실에 는 필름 노출을 위해 플라스틱 슬리브에 얼룩을 놓고 필름에 노출됩니다. 그런 다음 자동 프로세서를 사용하여 필름을 개발합니다.
- 37°C에서 30분 동안 시판적으로 사용할 수 있는 스트리핑 버퍼가 있는 스트립 블롯은 TS에서 0.05% Tween-20으로 3x 10분, TS에서 1x 10분 세척한 다음 로딩 제어 또는 기타 관심 단백질을 다시 조사합니다.
- 광학 밀도 측정을 위해 Image J 소프트웨어로 신호를 정량화하고 내부 로딩 제어 β-actin으로 정규화합니다.
7. 신경화학
- 분석을 위한 조직은 섹션 5.2에서 상술한 바와 같이 제조된다. 모바일 위상 레시피의 표 1을 참조하십시오.
참고: 모든 시약은 순결≥99.0%여야 하며 HPLC 등급이어야 합니다. 깨끗하고 전용 된 유리 제품 및 교반 바으로 버퍼 무결성을 보장합니다. 모바일 위상 버퍼는 준비 후 7일 이내에 활용되어야 합니다.- 디수소 인산과 구연산을 계량하고, ddH2O 1L을 넣고 2L 졸업 한 실린더에 섞습니다. 0.22 μm GSTF 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
참고: 이것은 인산염과 구연산에 있는 오염물질의 추출을 최대화합니다, 배경 전류를 최소화하는 것을 돕습니다. - OSA다음에 아세토닐및 EDTA 솔루션을 추가합니다. 인산으로 pH를 3.0으로 조정하기 전에 HPLC 등급 ddH2O를 약 1900 ml에 추가합니다.
- HPLC 등급 ddH2O를 2-L 마크에 추가한 다음 2-L 플라스크에 붓습니다. 전용 교반바를 넣고, 진공 상태에서 10분간 교반하여 이동국을 탈가스로 >.
- 디수소 인산과 구연산을 계량하고, ddH2O 1L을 넣고 2L 졸업 한 실린더에 섞습니다. 0.22 μm GSTF 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.
- 도파민에 대 한 표준을 준비, 그리고 표준 곡선에 대 한 DOPAC와 HVA. 표준의 재고 솔루션은 0.3 N PCA에서 1 mg / ml로 제조됩니다.
- 무게 12.4 도파민-HCl의 mg, 추가 10.0 0 0 ml의 0.3 N PCA 만들기 위해 1 mg/ml 도파민.
- 무게 10.0 DOPAC의 mg, 추가 10.0 0 0 0 0 0 N PCA의 ml 1 mg/ ml DOPAC.
- 무게 10.0 mg HVA, 추가 10.0 0 0 0 0 N PCA의 ml 1 mg/ml HVA.
- 스톡 솔루션에서 작동하는 표준 솔루션을 준비합니다. 5점 표준은 농도 곡선을 생성하는 데 사용됩니다.
- 줄무늬 도파민의 측정을 위해, 12.5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 그리고 200 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
- 무액달 DOPAC의 경우 표준 농도2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml 및 40 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
- 줄무늬 HVA의 경우 표준 농도 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml 및 80 ng/ml의 표준 농도를 준비하십시오.
- 5점 기준 생성: 0.3N PCA를 사용하여 5 μg/ml에 1 mg/ml 도파민 스톡 용액을 희석하십시오. 0.3N PCA를 사용하여 1 μg/ml에 1 mg/ml DOPAC 스톡 솔루션을 희석하고 0.3N PCA를 사용하여 2 μg/ml에 1 mg/ml HVA 스톡 용액을 희석시 희석합니다.
- 5 μg/ml 도파민 1ml, 1 μg/ml DOPAC 1ml, 25ml 체피 플라스크에 2 μg/ml HVA 1 ml를 옮기고 0.3 N PCA로 25ml 마크로 볼륨을 가져옵니다.
참고: 체피 플라스크의 혼합 표준은 5점 표준의 가장 높은 농도를 함유하고 있습니다: 도파민 200 ng/ml, DOPAC 의 40 ng/ml, HVA80 ng/ml. - 혼합 기준 1ml를 깨끗한 1.5ml 마이크로센심분리기 튜브로 옮기십시오. 1:1 직렬 희석을 네 번 수행하여 후속 4점 표준을 생성합니다.
- 예를 들어, 혼합 표준의 250 μl에, 원래 농도의 50%에서 혼합 표준을 생성하기 위해 250 μl의 샘플 버퍼 및 소용돌이를 철저히 추가합니다. 원하는 희석이 달성될 때까지 반복프로세스를 반복합니다.
- HPLC 시스템(펌프, 자동 샘플러, 역상 컬럼(C18, 150×3.2mm, 3 μm)을 준비합니다. HPLC 시스템의 모든 이전 솔루션을 대체하고 갇힌 기포를 신선한 모바일 단계로 대체하기 위해 신선한 모바일 단계로 펌프를 제거합니다. 자동 샘플러를 4°C로 냉각합니다. 컬럼을 35°C로 데우면 총 압력을 줄입니다.
- 전기화학 검출기의 제1 및 제 2 전극에 대해 -150 mV 및 220 mV로 전압을 설정합니다. 적어도 2 h에 대 한 시스템을 평형, 이상적으로 하룻밤, 0.2 ml/min의 유량으로 이동 상.
참고: 평형 동안 셀이 켜져야 하며 기준선 판독값을 모니터링해야 합니다. 안정적인 판독값은 시스템이 사용할 준비가 되었다는 것을 나타냅니다. 평형 단계의 2 시간 동안 이동 단계가 재순환하는 대신 폐기물 용기로 들어갈 수 있도록 하십시오. 이 기간 이후에는 이동상이 평형을 위해 밤새 재활용할 수 있습니다. - 평형이 완료되면 이동상 유량속도를 0.6ml/분으로 조정합니다. 각 5점 표준에 20 μl을 주입합니다.
- 전기화학 검출기의 제1 및 제 2 전극에 대해 -150 mV 및 220 mV로 전압을 설정합니다. 적어도 2 h에 대 한 시스템을 평형, 이상적으로 하룻밤, 0.2 ml/min의 유량으로 이동 상.
- 얼음에 striatal 샘플을 해동하고 각 샘플의 2 x 20 μl을 HPLC 시스템에 주입합니다. 각 줄무늬 샘플 집합에 걸쳐 처음부터 무작위로 표준을 활용합니다.
- 이 소프트웨어를 사용하여 도파민, DOPAC 및 표준 및 샘플에서 생산되는 HVA 피크 아래 영역을 분석합니다. 보존 시간별 별분과 측정을 통해 피크 아래 영역을 해당 표준에 대해 5점 곡선과 비교하여 측정합니다.
- 섹션 5.2.3에 설명된 대로 펠릿 분수를 준비합니다. 줄무늬 펠릿에 로우리 단백질 분석작업을 수행합니다. 참고: 이 분석은 mg/ml의 줄무늬 샘플에 존재하는 단백질의 양을 측정합니다. 이 정보는 알라바이트의 ng/mg 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
8. 면역 작용화학
- GFAP/TH 이중 면역 형광
- -20°C 냉동고에서 단면 중뇌를 함유한 튜브를 제거하고 RT. PBS가 포함된 트레이에서 극저온방부제 용액에서 실질적인 니그라를 함유한 조직 섹션을 제거합니다.
- 폴리에스테르 메쉬 하의를 가진 폴리스티렌 인서트에 티슈 섹션을 배치하여 자유 부동 면역 화학작용을 합니다. PBS에서 3 x 5 분 세척하십시오.
- 180 μl 블록 솔루션 (5 % 일반 당나귀 혈청, 1 % PVP, 1 % BSA 및 PBS의 0.3 % Triton X-100)을 가진 96 웰 플레이트로 섹션을 전송합니다. RT에서 40분 동안 인큐베이션을 합니다.
참고: 모든 세척 및 인큐베이션 단계는 셰이커에 가벼운 교반으로 수행됩니다. - 1차 항체 용액을 함유하는 우물로 섹션을 이송한다(웰당 180 μl). 1 차 적인 항체 칵테일, 토끼 안티 GFAP (1:1000) 및 양 안티 TH (1:400) PBS에서 희석 1% BSA 와 0.3% TX-100, 4°C에서 24 시간. 1차 종의 IgG는 부정적인 면역 염색 조절의 역할을 한다.
- 이차 항체 칵테일 (1:200 당나귀 안티 토끼 568 및 1:200 FITC 당나귀 항양 PBS0%TX-100)에서 배양하십시오. 호일을 사용하여 준비 및 인큐베이션 중에 빛으로부터 용액을 보호합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
- 부정적인 대조를 위해, 1차 항체에 사용되는 것과 동일한 농도로 희석된 1차 종으로부터 IgG의 섹션을 배양한다.
- 2 x PBS와 1 x TS를 RT. 마운트 티슈 섹션에서 각각 5분 동안 세척할 수 있으며, Hoechst 얼룩과 커버슬립이 있는 마운팅 매체의 슬라이드를 장착합니다.
- 이차 항체 칵테일 (1:200 당나귀 안티 토끼 568 및 1:200 FITC 당나귀 항양 PBS0%TX-100)에서 배양하십시오. 호일을 사용하여 준비 및 인큐베이션 중에 빛으로부터 용액을 보호합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
- 2 x PBS와 1 x TS를 RT. 마운트 티슈 섹션에서 각각 5분 동안 세척할 수 있으며, Hoechst 얼룩과 커버슬립이 있는 마운팅 매체의 슬라이드를 장착합니다.
- 4°C의 슬라이드 박스에 보관하여 이미징까지 빛과 산화로부터 슬라이드를 보호합니다.
- 먼저 음극을 분석하여 형광의 배경 수준을 결정한 다음 형광 현미경 을 사용하여 양성 면역 반응성에 대해 평가하십시오.
- 크로마겐 강수량이 있는 이바1 면역히스토케
- -20°C 냉동고에서 단면 중뇌를 함유한 튜브를 제거하고 RT. PBS가 포함된 트레이에서 극저온방부제 용액에서 실질적인 니그라를 함유한 조직 섹션을 제거합니다.
- 무료 부동 면역 화학을 위해 폴리스티렌 인서트에 조직 섹션을 배치합니다. PBS에서 섹션 3 x 5분 세척하고, 사전 가열된 10mM 구연산 모노하이드레이트, pH 9.0, 80°C를 30분 동안 포함하는 12웰 플레이트에 직접 배치하여 에피토프 검색을 위해 하십시오.
- RT에서 20 분 냉각 플레이트. PBS에서 3 x 5 분 인서트 하고 세척할 수 있는 반품 섹션.
- 180 μl 차단 용액 (일반 염소 세럼 10 %, PBS의 1 % BSA)을 포함하는 96 웰 플레이트로 섹션을 옮기고 RT에서 40 분 동안 배양하십시오.
- 180-μl 희석 1차 항체를 포함하는 우물로 섹션을 이송한다(1%에서 1%BSA-PBS). 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 섹션을 삽입으로 전송합니다. 3 x 5 분 PBS를 세척하고 RT에서 1 시간 동안 바이오티니드 이차 항체 (1:200 in 1.5 % 정상 혈청-PBS)를 적용하십시오.
- 사용 30분 전에 ABC 솔루션을 준비하십시오. 3 x 5 분 PBS를 세척하고 RT에서 1 시간 동안 ABC 솔루션으로 전송하십시오.
- 후드에 DAB 솔루션을 준비합니다. PBS에서 2x 5분, TS에서 1x 5분 세척하고 DAB에서 섹션을 배양합니다.
- 3-4 분 동안 개발하십시오. 음수 컨트롤은 색상에 빛을 유지해야 합니다.
참고: DAB는 알려진 발암물질이기 때문에 연기 후드에서 이 단계를 수행합니다. 오염 제거를 위해 ddH2O에서 0.2M 칼륨 퍼망가네이트의 용액은 우발적 인 드립의 경우 근접하여 유지되어야합니다.
- 3-4 분 동안 개발하십시오. 음수 컨트롤은 색상에 빛을 유지해야 합니다.
- ddH2O에서 섹션을 간단히 헹구고 TS 3 x 5분에서 헹구습니다. 연기 후드에 슬라이드와 공기 건조 하룻밤에 섹션을 마운트합니다.
- DdH2O, 소용돌이, 연기 후드에 0.2M 칼륨 퍼망가네이트의 동일한 볼륨으로 DAB 폐기물을 오염 제거한 후 연기 후드에 적절하게 표시된 DAB 쓰레기통에 보관하십시오.
참고: 표백제 솔루션은 DAB의 돌연변이 특성을 제거하지 않습니다.- 재사용 항목(예: 폴리스티렌 인서트)을 오염 제거하고 세제로 세척합니다.
- 크레실 바이올렛 (CV)로 가볍게 탈수 / 카운터 스테인. 모든 탈수/세척 단계는 3분: 에탄올 70%, 95%, 100%, 95%, ddH2O, CV(30초), ddH20 x 2, 95% 에탄올 + 빙하 에이스산(0.1%) x 2, 100% 에탄올 및 자일렌.
- 디스티렌 톨루엔 자일렌 장착 매체및 연기 후드의 드라이의 커버슬립.
- 가벼운 현미경에 의해 양성 면역 반응성을 관찰하십시오. 1차 종의 IgG는 부정적인 면역 염색 조절의 역할을 한다.
9. 통계
- 유전자형과 독성 치료 사이의 차이를 비교하기 위해 유전자형과 양방향 ANOVA 사이의 차이를 비교하기 위해 편차(ANOVA)의 편도 분석에 의해 수단 간의 차이를 평가합니다. ANOVA테스트(p≤0.05)에 의해 차이가 관찰될 때 Tukey의 HSD 포스트 호크 분석을 활용하십시오.
참고: 실험(n = 6-9 마우스/그룹)은 재현성을 보장하기 위해 최소 2회 수행됩니다.
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Representative Results
이 독소 노출 패러다임은 MPTP- 대 식염수 주입 동물에서 중요하고 검출 가능한 20% 현저도 도파민 고갈을 생성할 수 있습니다. MPTP의 다른 제비는 약간 더 많거나 적은 병변을 얻을 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요합니다; 따라서, 더 나은 정밀도를 위해, 신경 독소의 새로운 제비가 이용될 때 형질전환에서 사용하기 전에 야생형 마우스에 있는 예비 실험은 추천됩니다. 온화한 병변의 사용은 간질이 관찰될 수 있는 질유전자의 충격을 허용합니다; 심한 병변은 해로운 유전 적 변화의 효과를 가리기 위해 감쇠 또는 너무 손상에 너무 강력한 부상으로 '바닥 효과'를 생성 할 수 있습니다. TTP가 현저도 도파민에 미치는 영향은 5-LOX 이소지메 결핍 마우스에서 크게 달랐지만, 12/15-LOX 이소지메-결핍마우스(도 1)는아니었다. 더욱이, 이러한 방법으로, 우리는 식염수 처리 마우스의 5-LOX 결핍으로 인해 도파민 수준에 상당한 차이를 분별 할 수 있었다(도 1).
TH 및 GFAP용 면역블로팅은 각각 야생형 마우스의 줄무늬 수준에서 손상 및 신경염증의 확인을 허용했으며, 5-LOX 이소지메-결핍 성수기(그림3A 및 3B)에서감소된 효과가 있었다. 병변은 또한 실질적인 니그라(도2A 및 2B)의수준에서 식별할 수 있다. 동일한 마우스에서, TH 양성 뉴런의 고갈 및 증가된 GFAP 면역 반응성은 이중 라벨 면역형성라벨링(그림 2A)을사용하여 관찰할 수 있다. 더욱이, 현저하게 상승된 마이크로글리아(즉, Iba1 면역반응성)는 야생형에서, 그러나 5-LOX 이소지메-결핍이 아니라, 마우스는 MPTP노출(도 2B)에이어 실질적인 니그라에서 명백하다. 따라서, MPTP 모델은 뇌 변성 및 염증에 대한 유전 적 소인의 영향을 평가하는 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다.
그림 1. LOX 는 MPTP 도전 후 현저도 도파민에 대한 선택적 효과를 이소지메로 선택적으로 효과. (A) 현액 균질은 WT에서 HPLC에 의해 도파민 (DA)을 측정하는 데 사용되었고 5-LOX-/- 식염수 또는 MPTP (n =6-8/그룹)를 부여합니다. ‡, 유전자형으로 인한 유의한 효과를 표시; p<0.05. *, 유전자형 및 치료로 인해 상당한 효과를 표시; p<0.05. 치료로 인한 유의한 차이는 MPTP가 이 형질전환선에서 현저DA 고갈을 생성하지 않았다는 것을 나타내는5-LOX-/-- 마우스(n.s.)에서 지적되지 않았다. (B) 현액 균질은 WT 및 12/15-LOX-/---리터메이트 주어진 식염수 또는 MPTP(n=6-9/그룹)에서 DA를 측정하는 데 사용되었다. 유전자형으로 인한 DA 수준에 는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. MPTP 치료로 인한 중요하고 유사한 감소는 두 유전자형 모두에서 지적되었다. *, p<0.01. 데이터는 SEM에 ± 의미로 표시됩니다.
그림 2. MPTP 챌린지 에 이어 니그랄 TH와 아스트로글리아에 대한 5-LOX 이소지메 효과. (A) TH(FITC; green) 및 GFAP(568; 적색)에 대한 면역형염색은 WT 및 5-LOX-/-리터메이트로부터의 뇌 섹션에서 식염수 또는 MPTP를 부여하였다. 더 적은 TH 양성 세포 바디 (*) 및 향상된 GFAP 면역 반응성은 WT-MPTP 단에서 명백합니다. Bar = 25 μm. (B) 마이크로글리아에 이바-1에 대한 면역 조직화학 적 조직학은 DAB (갈색 크로마트겐)를 사용하여 검출되었다; 섹션은 크레실 바이올렛에 의해 반염색되었다. WT및 5-LOX-/---리터메이트의 니그랄 섹션을 식염수 또는 MPTP로 처리하였다. 절제된 세포 체와 긴 분지 과정을 가진 Microglia는 식염수 처리된 마우스 (화살표 머리)에서 실질적인 nigra에서 관찰됩니다. 둥근 세포 체와 짧고 두껍게 한 과정을 가진 활성화 된 microglia는 MPTP 처리 된 마우스 (화살표)에서 실질적인 니그라에서 관찰되었다. 바 = 10 μm.
그림 3. 5-LOX isozyme 효과 에 무늬 TH 및 독성 모욕 다음 염증. (A) Striatal TH 단백질 수준은 WT 및5-LOX-/-리터메이트주어진 식염수 또는 MPTP(n=6-8/그룹)로부터 의 혼모네이트의 서양 블롯 분석에 의해 반정적으로 측정하였다. 광학 밀도에 의해 측정된 면역 반응성은 β 액틴으로 정규화되었다. *, p<0.05. (B) 유사하게, GFAP는 WT및5-LOX-/-리터메이트로부터 의 정량적 균주해석에 의해 반정적으로 측정되었고 식염수 또는 MPTP(n=6-8/그룹)로 주어졌으며 β 액틴으로 정규화하였다. *, p<0.05. 데이터는 SEM에 ± 의미로 지적됩니다.
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Discussion
이 유전자 환경 상호 작용 연구의 디자인은 우리가 nigrostriatal 통로에 있는 5-LOX isozyme의 이중 본질에 관하여 새로운 정보를 얻기 위하여 허용했습니다. 5-LOX 이소지메와 그들의 야생형 쓰레기메이트가 결핍된 형질 성 전환기에서 식염수 또는 MPTP 처리 후에 striatal monoamines를 측정하기 위하여 HPLC를 수행해서, 우리는 그것의 결핍이 독성 조건하에서 보호되는 것처럼 보인다는 것을 주의할 수 있었습니다(그림 1),그러나 일반적인 조건하에서, 효소의 부족은 striatal 도파민 수준을 감소시키고 삭제될 수 있습니다. 따라서, 우리는 5-LOX isozyme정상 조건하에서 striatal dopaminergic 음색에 기여한다는 것을 증명할 수 있습니다, 그러나 독성 도전4다음손상에 기여할 수 있습니다.
추가 평가는 NIGrostriatal 독성에서 LOX isozymes의 역할에 새로운 기계론적 통찰력을 빌려야하지만, 서양 얼룩 분석(그림 3)뿐만 아니라 면역 조직 화학 연구(그림 2)신경 염증 마커는 적어도 부분적으로, 5 LOX isozyme-결핍 코호트에서 감쇠 된 것으로 나타났습니다. 이러한 사실 인정은, 고전적인 생화학 및 조직학 기술을 사용하여, 마이크로 및 천체 신경교 활성화4의전능에 있는 5-LOX 제품의 중요한 역할을 나타냅니다.
조사된 유전자 환경 상호 작용에 따라, 글리아 활성화 이외에 병리학적 판독을 분석할 수 있다. PD에서 특히 중요성은 실질적인 니그라에서 도파민성 뉴런의 손실과 잠재적으로 병리학적 축적 및 α-synuclein의 집계입니다. 이 라인을 따라, α-시뉴클레인 과발현을 가진 형질전환 마우스에 있는 독성 노출의 충격은 nigral 세포 사멸의 평가에 의해 감시되고 있다(즉, 편견없는 입체 세포 계산을 사용하여) 및 불용성 α-synuclein 증착32-35.
여기서 설명된 패러다임에 사용되는 MPTP 투여량은 단정하지만, 현저손상(도1)및 글리아슬 활성화를 위한 경미한 병변을생성한다(그림 2 및 3). 전형적으로, 독성제의 더 높은 투여량은 강력한 니그랄 도파민 세포 손실 및 현액 도파민 고갈23,24,32,36-38,39를생성하는 데 사용된다. MPTP의 독성은 공급 업체와 제비 마다 다를 수 있습니다. 따라서 복용량 원하는 병 변을 생산 하기 위해 조정 해야 할 수 있습니다. 더욱이, 고려해야 할 그밖 요인은 연구 결과를 위해 이용된 동물의 긴장 그리고 성입니다. 신경독소에 대한 선택적 민감도는 JNK 및 C-Jun36-39를포함하여 변성을 중재하는 세포외 경로의 활성화의 차이로 인해 적어도 부분적으로 인해 마우스의 뚜렷한 배경 변주에서 입증되었다. MPTP 독성의 성 의존적 차이도40,41로보고되었으며, 남녀 모두 가난한 사육 라인에 사용되는 형질 전환생 쥐를 이용한 연구에서 가변성에 기여할 수 있다. 이러한 경우, 성일치 야생형 컨트롤의 사용은 매우 중요합니다4. 이러한 성관련 효과는 WT 마우스에서 관찰된 병변의 차이를 고려하여 5-12/15-LOX 결핍 마우스의 영향을 시험하여 한 성별이 한 줄에 사용되었고 다른 남녀 모두에 대해 둘 다 성별을 사용할 수있다(그림 1). 유전자 환경 상호 작용 연구의 경우 심각한 부상을 발생 시키는 MPTP 도전(예를 들어 >80% 줄무늬 도파민 감소) 이 가능한 유전 효과를 마스크 수 있습니다 권장 하지 않습니다.
MPTP 노출은 니그랄 세포 사멸 을 생성하는 동안3,42,현자 도파민 고갈3,복잡한 나는 억제43-45,및 신경교 활성화46,47 인간 PD에서보고된, 마우스에서, 안정적인 파킨슨증(즉, 모터 적자)과 솔직한 α-시뉴클레인 병리학(즉, 루이 바디 및 중성염)을 생성하는 천천히 진보적인 변성은 모델에서 질병의 특징을 완전히 재구성하지 못한다. 그러나 MPTP 마우스가 PD 관련 신경 변성에 기여하는 세포 외 경로를 이해하는 데 중요한 역할을했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 노출 패러다임의 변이, 예를 들어, 독성의 별개의 메커니즘의 활성화를 밝혔다: 저용량, 아급성 노출은 제한된 면역반응으로 세포 사멸을 촉진(49 더 높은 복용량을 가진 급성 치료는 표시 microglial 활성화50) 실제로, 이러한 요인은 효능 연구를 위한 모형을 이용할 때 그리고, 현재 연구 결과와 관련있을 때, 잠재적인 유전 위험 요소의 충격을 마스크하기 위하여 고려되어야 합니다.
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Disclosures
공개할 것은 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 NIGMS 056062의 국가 학회에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL) | Sigma-Aldrich | M0896 | for PD modeling |
| 4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution, phosphate-buffered (PFA) | American MasterTech Scientific | BUP0157 | for immersion fixation |
| Perchloric acid ACS reagent, 70% (PCA) | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC acid extraction |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | for tissue homogenization |
| Ethylenediaminotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E1644 | for tissue homogenization |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | for tissue homogenization |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P5726 | for tissue homogenization |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | for Lowry protein assay |
| Sucrose, molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389 | for cryoprotection |
| Phosphate buffered saline, powder, pH 7.4 (for 0.01 M PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | for IHC |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce/Thermo | 23225 | for protein determination |
| Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1.0 mm, 12-well | Invitrogen/Life Technologies | EC60052BOX | for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 | for SDS-PAGE |
| Novex Sharp Prestained Protein Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5800 | protein ladder |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | for SDS-PAGE |
| Sodium dodecyl sulfate, electrophoresis, 98.5% (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | for SDS-PAGE |
| Methyl Alcohol, Anhydrous, Reagent | American MasterTech Scientific | SPM1057C | methanol for transfer |
| Sodium chloride (NaCl), ACS reagent | Sigma-Aldrich | S9888 | saline and buffers |
| Nonfat dry milk powder | Carnation | n/a | for immunoblotting |
| Ponceau S solution in 5% acetic acid | Sigma-Aldrich | P7170 | for immunoblotting |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), sheep polyclonal | Chemicon/Millipore | AB1542 | for immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH), rabbit polyclonal | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | for immunoblotting |
| Anti-β Actin, rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | for immunoblotting |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), rabbit polyclonal | Chemicon/Millipore | AB5804 | for immunofluorescence |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), mouse monoclonal | Covance Inc. | SMI-22R | for immunoblotting |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | for immunoblotting |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Peroxidase Conjugated | Fisher Scientific | 31462 | for immunofluorescence |
| goat anti-sheep, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31480 | for immunofluorescence |
| goat anti-mouse, peroxidase conjugated | Pierce/Thermo | 31430 | for immunofluorescence |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Pierce/Thermo | 34078 | for immunoblotting |
| CL-XPosure Film 7 in x 9.5 in | Pierce/Thermo | 34089 | for immunoblotting |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Pierce/Thermo | 21059 | for immunoblotting |
| Citric acid monohydrate, ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | C1909 | for IHC |
| Normal Donkey Serum | Millipore | S30-100ML | for IHC |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Sigma-Aldrich | P5288 | for IHC |
| Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized | Sigma-Aldrich | A3294 | for IHC |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-01 | for IHC |
| Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568-labeled | Invitrogen/Life Technologies | A10042 | for IHC |
| Donkey Anti-Sheep IgG (H+L), FITC | Jackson ImmunoResearch | 713-095-147 | for IHC |
| VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | for IHC |
| Normal Goat Serum | Millipore | S26-100ML | for IHC |
| VECTASTAIN ABC Kit (Rabbit IgG ) | Vector Laboratories | PK-4001 | for IHC; 10 µl each of solutions A and B per 1 ml PBS (per instructions ) |
| DAB Peroxidase Substrate Kit, 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | for IHC; per 5 ml cold ddH2O, add 2 drops buffer stock solution, 2 drops DAB, and 1 drop H2O2 (H2O2 is added immediately before use) |
| Hydrogen peroxide, 30% | Sigma-Aldrich | 216763 | for quench step in IHC |
| Rabbit anti-Iba1 | Biocare Medicals | CP290A | for IHC |
| Cresyl Violet Solution, Regular Strength | FD Neurotechnologies | PS102-01 | counterstain for Iba1 IHC |
| 95% Ethanol, reagent alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | dehydration for IHC |
| 100% Absolute ethanol | Mallinckrodt | 7019-10 | dehydration for IHC |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | destaining for IHC |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | clearing agent for IHC |
| DPX Mountant | Sigma-Aldrich | 06522 | mounting medium for DAB IHC |
| O.C.T. Compound - Frozen Section Embedding Medium | American MasterTech Scientific | EMOCTCS | embeddium medium for cryostat cutting |
| Potassium permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | to decontaminate DAB solution |
| Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | for HPLC |
| 3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) | Sigma-Aldrich | 850217 | for HPLC |
| Homovanillic acid (HVA) | Sigma-Aldrich | H1252 | for HPLC |
| Perchloric acid (PCA) - 70% | Sigma-Aldrich | 244252 | for HPLC |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Sigma-Aldrich | 71504 | for HPLC |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | for HPLC |
| 1-Octanesulfonic acid sodium salt (OSA) | Sigma-Aldrich | O8380 | for HPLC |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | for HPLC |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 | for HPLC |
| HPLC-grade distilled deionized water (ddH2O) | Millipore | for HPLC | |
| 0.22 µm GSTF membrane | Millipore | for filtration | |
| Corning Netwells | Sigma-Aldrich | CLS3477 | polystyrene insert with polyester mesh bottom, for IHC |
| Ultrasonic cell disrupter (Soniprep 150) | MSE | MSE.41371.274 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414R | |
| ESA MD-150 reverse-phase column | ESA | ||
| HPLC Pump (Ultimate 3000) | Dionex | ISO-3100BM | |
| HPLC Autosampler (Ultimate 3000) | Dionex | WPS-3000TSL | |
| Electrochemical detector | ESA | Coulochem III | |
| Guard Cell | ESA | 5020 | |
| Analytical Cell | ESA | 5011A | |
| Chromeleon software | Dionex | ||
| Eclipse E400 | Nikon | E400 | light/fluorescent microscope |
| Disposable mouse cage | Ancare | N10HT | |
| Microfilter top | Ancare | N10MBT | |
| 5-LOX- deficient mice | The Jackson Laboratory | 004155 | |
| 12/15-LOX-deficient mice | The Jackson Laboratory | 002778 |
References
- Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
- Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
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