评估局部或全身药物干预后小鼠对挥发性全身麻醉药敏感性的变化

摘要

丧失翻正反射长期以来被用作实验室动物无意识状态（也称为催眠）的标准行为替代指标。通过精心控制的高通量评估系统，可以检测药理学干预引起的挥发性麻醉剂敏感性的改变，该系统也可适用于任何吸入性治疗药物的递送。

摘要

全身麻醉的一个理想终点是无意识状态，也称为催眠状态。在动物中定义催眠状态不如在人类患者中那样直接明确。在啮齿类动物中，广泛使用的催眠状态的行为替代指标是翻正反射消失（LORR），即动物不再对其本能地避免仰卧位所带来脆弱性的倾向作出反应的时点。我们开发了一套系统，可在严格控制潜在干扰因素（包括温度波动和气体流量变化）的同时，对24只小鼠进行LORR的同步评估。这些暴露舱可对固定麻醉暴露后翻正反射恢复所需潜伏期（RORR）所衡量的麻醉敏感性进行可靠评估。此外，通过逐步增加（或减少）麻醉药物浓度，这些暴露舱还可用于测定群体在诱导（或苏醒）过程中的敏感性，以EC₅₀和Hill斜率表示。最后，本文所述的受控环境暴露舱可适用于多种其他用途，包括吸入性给药其他药物、毒理学研究以及生命体征的同步实时监测。

引言

全身麻醉药的定义基于其能够在多种物种中诱导可逆性催眠状态的能力，然而，如此多样的一类药物如何均能引发单一终点效应的机制至今仍不明确。多年来已提出多种理论，最早的是麻醉药效与脂溶性之间的迈耶-奥弗顿（Meyer-Overton）相关性，该理论认为麻醉的机制源于对细胞膜的普遍干扰^1,2。近年来的证据表明，影响神经元信号传导的蛋白质靶点也参与介导麻醉效应。小鼠已被证明是探索这些理论不可或缺的模型，因为小鼠与人类在对麻醉药的反应方面具有高度同源性。尽管无法询问小鼠在全身麻醉下的主观意识状态，但某些原始反射可作为啮齿类动物催眠状态的有效替代指标。在出生后的最初几天内，小鼠会发育出一种反射性的翻正反应，使其无法被被动地保持仰卧体位³。小鼠失去翻正反射时的麻醉剂量与人类的催眠剂量具有良好的相关性⁴。

翻正反射消失（LORR）的评估现已成为测试小鼠及其他多种动物（包括大鼠、豚鼠、兔、雪貂、绵羊和犬）麻醉敏感性的常用实验室标准方法^5-8。在特定物种中，个体发生LORR所需的麻醉剂剂量极为一致，但可因环境因素发生显著改变。例如，睡眠剥夺的大鼠对挥发性和静脉麻醉药的敏感性更高⁹ ，而有氧能力较高的大鼠对异氟烷的敏感性则较低¹⁰。低体温也被证明可在多种物种中显著降低诱导催眠所需的多种麻醉药剂量^11-14。为了可靠地确定实验动物群体中发生LORR的麻醉剂量，必须严格控制评估环境，以最大限度减少应激、维持正常体温，并确保所有受试动物接受等量的药物。遗传因素同样被证实会影响麻醉敏感性^15-18，这一点并不令人意外。因此，在实验设计中也应充分考虑并控制遗传背景的影响¹⁹。

我们开发了一种装置，可在维持恒定37 ^oC环境的同时，向24只小鼠提供完全相同的气态麻醉剂。我们暴露室的透明圆柱形设计便于快速评估翻正反射消失（LORR），并易于整合遥测生理学测量。该系统已被证实可准确测定野生型小鼠中异氟烷、氟烷和七氟烷诱导的EC₅₀以及苏醒时间²⁰。我们还利用该系统观察了具有基因突变和靶向下丘脑损伤的小鼠在麻醉敏感性方面的变化^21-23。本文中，我们描述了在药理学干预后使用该受控环境装置评估麻醉敏感性的两种方法。挥发性麻醉药诱导和苏醒敏感性的稳态表型分析需要8–10小时，因此最适合用于实验条件保持不变的研究，例如慢性或长效药理学干预研究。然而，对于随时间推移效应显著减弱的短效处理，我们还提供了一种简便的程序，用于评估立体定位微注射或静脉给药处理后对麻醉苏醒过程中翻正反射变化的影响。这些测试仅是该受控环境系统潜在应用中的一小部分，该系统可适用于多种物种的大量受试对象接受各类吸入性治疗。

方案

本文所述所有涉及动物的实验程序均已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 测试装置概述

1. 测试装置由24个透明丙烯酸圆柱形腔室组成，每个腔室长10 cm，直径5 cm（总体积为200 ml）。该尺寸适用于典型的25 g成年小鼠。每个腔室两端设有气体进出口。出口端可拆卸，以便于将动物装入腔室。气体端口使用聚四氟乙烯胶带仔细密封，而腔室的可拆卸端则采用橡胶O形圈垫片进行密封。
2. 每个腔室安装在一个置于水浴中的支架上。支架设计使得仅腔室的下部（气体进口以下部分）浸入水中。为保持稳定，腔室后端依靠一个支撑物，使整个腔室保持水平放置。这可确保每个腔室与水浴充分均匀接触。
3. 聚乙烯管将氧气罐连接至麻醉蒸发器，然后通过一个10 L/min的流量计。管道随后分成25根等长的小直径分流管，以确保向24个腔室及一个麻醉剂分析仪均匀输送气流。
4. 每个腔室的气体进口对侧设有真空管出口。这种设计促进单向气流，避免呼出的二氧化碳被重复吸入。各真空管在集流管处汇合后连接至实验室内部的负压抽吸系统。主真空管路上设有泄压阀，以确保每个腔室内维持大气压条件。
5. 水浴中注入足量的水，以完全接触每个腔室的底部。水通过泵在水浴中循环，并恒定维持在37 ^oC。

2. 暴露前检查系统

1. 检查水浴的温度是否在整个水浴中保持为37 ^oC。
2. 以5 L/min的流速通入氧气（每室200 ml/min + 麻醉剂分析仪）。将每个腔室浸入水中，观察是否有气泡产生或水进入腔室，这两种现象均表明存在泄漏。在开始实验前应密封所有泄漏点。
3. 对于每个腔室，在其后串联一个500 ml/min的流量计，以确保25条气体管路之间的流量平衡。这可保证输入的5 L/min气流均匀分配，使每个腔室获得200 ml/min的气流。若任何腔室未达到预期流量，应检查其进气和出气管路是否存在堵塞。
4. 校准麻醉剂分析仪，确保在纯氧流动时显示的异氟烷浓度为0.00%。

3. 植入式温度遥测仪

1. 在适应性训练前一周，使用 2% 异氟烷对每只小鼠进行麻醉。
2. 用聚维酮碘对小鼠背部颈部区域进行消毒。
3. 使用无菌预装注射针头，将温度感应芯片皮下注射于肩胛骨之间。
4. 每日监测注射部位是否存在感染及感应芯片移位情况。

4. 使动物适应测试环境

1. 在首次评估前四天，将所有小鼠放入独立的饲养盒中，持续通入100%氧气，每次2小时 。
2. 在评估前四天内每天重复步骤4.1，以避免因新环境带来的应激干扰。

5. 实施拟测试其对麻醉敏感性影响的药理学干预

1. 该干预措施可能包括向脑部特定区域进行立体定位注射²⁴、静脉注射或腹腔注射²⁵，或通过套管将药物递送至特定脑区²⁶。
2. 由于这些操作本身可能改变动物的麻醉敏感性，与未经处理的动物相比，因此应设置接受相同操作但注射溶剂对照的适当对照组。
3. 如果计划按照下文第6步所示逐步递增和/或递减测定麻醉敏感性，请确保所用药物干预具有足够长的作用持续时间；否则，跳至第7步。

6. 采用逐步测定诱导和苏醒的EC₅₀评估麻醉敏感性

1. 将每只动物分别放入通有100%氧气的独立舱室中。
2. 将异氟烷浓度设定为0.4%*，持续15分钟。在此阶段的最后2分钟内 ，通过轻轻翻转舱室使小鼠仰卧，评估每只动物的翻正反射。仅当小鼠在2分钟内能够将全部四肢恢复至舱室底部时，才认为其翻正反射完整。
   1. *请注意，0.4%异氟烷对C57BL/6J小鼠而言属于亚催眠剂量。若任何小鼠在第一步即失去翻正反射，则初始剂量过大，应在后续实验日中降低剂量。
3. 记录每只小鼠的翻正反射状态，并扫描获取每只小鼠的体温数据。记录模板见表1。
4. 将异氟烷浓度每次增加约0.05%，维持15分钟 ，并重复步骤7.2。持续进行此操作，直至所有动物均失去翻正反射。
5. 可选：重复相同操作，逐步降低异氟烷浓度，直至所有动物恢复翻正反射（参见步骤6.3）。
6. 实验结束时，关闭异氟烷供应，并用100%氧气冲洗整个系统15分钟。这有助于防止小鼠在恢复意识并返回饲养笼前发生缺氧，同时保护实验人员免受麻醉剂暴露。
7. 可选：若因资源或时间限制导致动物数量或麻醉浓度水平较少，则曲线拟合参数估计值——特别是Hill斜率——可能出现被低估的、虚假偏低的误差估计。在此情况下，可能需要在最多两个额外的实验日中重复步骤6.1–6.6所述的麻醉敏感性测量，以完整获得Hill斜率的真实参数及其相应的误差估计。

7. 通过苏醒时间评估麻醉敏感性的短期变化

1. 将每只动物放入通有100%氧气的独立舱室中。
2. 将异氟烷浓度设定为1.2%，该浓度相当于野生型C57BL/6J小鼠的诱导ED₉₉²⁰。根据预期的急性干预作用持续时间，维持30-60 min 。
3. 通过轻轻翻转每个舱室使小鼠仰卧，以确认所有动物均出现翻正反射消失（LORR）。
4. 关闭异氟烷，通入100%氧气。记录每只动物恢复翻正反射所需的时间。翻正反射恢复的定义为四肢均置于舱室底部，并通过连续三次测试均显示翻正反射存在来确认。

结果

图1 展示了逐步翻正反射缺失（LORR）实验在确定药理学干预长期效应方面的实用性。伊博酸（ibotenic acid, IBA）是一种谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体激动剂，常作为兴奋性毒素用于诱导永久性神经元损伤。本实验中，我们在测试前一周向C57BL/6J小鼠的腹外侧视前区（ventrolateral preoptic area, VLPO）双侧各注射10 nl的1% IBA。该核团中的大多数神经元在清醒状态下放电率较低，而在非快速眼动睡眠、快速眼动睡眠期间，以及暴露于催眠剂量的全身麻醉药时，其活动会特异性增强^23,27-29成功的VLPO损毁应导致对异氟烷诱导的麻醉产生抵抗。在异氟烷浓度逐级增加时，失去翻正反射的小鼠比例随麻醉浓度以对数形式绘图₁₀ 量表。对每组小鼠（溶剂注射组和IBA注射组）的数据采用S型剂量-反应曲线进行拟合。由于该实验始终以所有动物保持直立开始，并以所有动物失去翻正反射结束，因此曲线的下限和上限常数分别被固定为0和1。曲线其余的自由参数为EC₅₀，或小鼠有50%失去翻正反射时的麻醉剂浓度，以及反映...

讨论

尽管对单只小鼠进行翻正反射消失（LORR）评估看似是一项简单的任务，但为了从一组动物中收集可靠的数据，仍必须保持受试个体间生理条件的一致性。本文介绍的这种高度可控、高通量的LORR装置为实验标准化和效率最大化提供了一种有效方法。通过遵循体温调节和气流均匀分配的基本原则，该系统可轻松复制并根据实验者的具体需求进行定制。腔室尺寸可根据其他物种（如大鼠）进行调整，通过在进气端和真空端增加更多分支接口，还可扩展以容纳更多腔室。透明的丙烯酸腔室使所有受试动物均清晰可见，便于对实验过程进行录像，以便后续进行事后结果复核。此外，丙烯酸材料也兼容射频遥测系统，可用于监测体温、血压和生物电位等指标。

我们介绍了两种不同的方法，用于评估药理学干预后麻醉敏感性。无论是苏醒时间测试还是逐步诱导测试，都需要实验者评分动物翻正反射的有无。即使对LORR（翻正反射消失）有明确的定义，例如"在被翻转为仰卧位后两分钟内无法将四肢全部置于实验舱底部"，评分仍可能具有一定的主观性。为确保一致性，最好由同一位对处理分组不知情的实验人员在整项实验过程中对所有动物进行评分。在选择用于评估麻醉敏感性的测试方法时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂名称	公司	目录编号	备注
Oxygen	Airgas	OX300
Isoflurane	Butler Schein		可替换为任何感兴趣的挥发性麻醉剂
材料名称	公司	目录编号	备注
质量流量计 - 10 SLPM	Omega Engineering	FMA-A2309
质量流量计 - 500 SCCM	Omega Engineering	FMA-A2305
麻醉剂分析仪/气体指示器	AM Bickford	FI-21 Riken
加热水泵	Fisher Scientific	13-874-175
温度应答器	BMDS	IPTT-300
射频温度读取器	BMDS	DAS-6007