方法文章

评估局部或全身药物干预后小鼠对挥发性全身麻醉药敏感性的变化

DOI：

10.3791/51079

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2013年10月16日

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1Department of Anesthesiology and Critical Care, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Pharmacology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Neuroscience, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 4Center for Sleep and Circadian Neurobiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

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丧失翻正反射长期以来被用作实验室动物无意识状态（也称为催眠）的标准行为替代指标。通过精心控制的高通量评估系统，可以检测药理学干预引起的挥发性麻醉剂敏感性的改变，该系统也可适用于任何吸入性治疗药物的递送。

摘要

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全身麻醉的一个理想终点是无意识状态，也称为催眠状态。在动物中定义催眠状态不如在人类患者中那样直接明确。在啮齿类动物中，广泛使用的催眠状态的行为替代指标是翻正反射消失（LORR），即动物不再对其本能地避免仰卧位所带来脆弱性的倾向作出反应的时点。我们开发了一套系统，可在严格控制潜在干扰因素（包括温度波动和气体流量变化）的同时，对24只小鼠进行LORR的同步评估。这些暴露舱可对固定麻醉暴露后翻正反射恢复所需潜伏期（RORR）所衡量的麻醉敏感性进行可靠评估。此外，通过逐步增加（或减少）麻醉药物浓度，这些暴露舱还可用于测定群体在诱导（或苏醒）过程中的敏感性，以EC50和Hill斜率表示。最后，本文所述的受控环境暴露舱可适用于多种其他用途，包括吸入性给药其他药物、毒理学研究以及生命体征的同步实时监测。

引言

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全身麻醉药的定义基于其能够在多种物种中诱导可逆性催眠状态的能力，然而，如此多样的一类药物如何均能引发单一终点效应的机制至今仍不明确。多年来已提出多种理论，最早的是麻醉药效与脂溶性之间的迈耶-奥弗顿（Meyer-Overton）相关性，该理论认为麻醉的机制源于对细胞膜的普遍干扰1,2。近年来的证据表明，影响神经元信号传导的蛋白质靶点也参与介导麻醉效应。小鼠已被证明是探索这些理论不可或缺的模型，因为小鼠与人类在对麻醉药的反应方面具有高度同源性。尽管无法询问小鼠在全身麻醉下的主观意识状态，但某些原始反射可作为啮齿类动物催眠状态的有效替代指标。在出生后的最初几天内，小鼠会发育出一种反射性的翻正反应，使其无法被被动地保持仰卧体位3。小鼠失去翻正反射时的麻醉剂量与人类的催眠剂量具有良好的相关性4。

翻正反射消失（LORR）的评估现已成为测试小鼠及其他多种动物（包括大鼠、豚鼠、兔、雪貂、绵羊和犬）麻醉敏感性的常用实验室标准方法5-8。在特定物种中，个体发生LORR所需的麻醉剂剂量极为一致，但可因环境因素发生显著改变。例如，睡眠剥夺的大鼠对挥发性和静脉麻醉药的敏感性更高9 ，而有氧能力较高的大鼠对异氟烷的敏感性则较低10。低体温也被证明可在多种物种中显著降低诱导催眠所需的多种麻醉药剂量11-14。为了可靠地确定实验动物群体中发生L....

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方案

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本文所述所有涉及动物的实验程序均已获得宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 测试装置概述

  1. 测试装置由24个透明丙烯酸圆柱形腔室组成，每个腔室长10 cm，直径5 cm（总体积为200 ml）。该尺寸适用于典型的25 g成年小鼠。每个腔室两端设有气体进出口。出口端可拆卸，以便于将动物装入腔室。气体端口使用聚四氟乙烯胶带仔细密封，而腔室的可拆卸端则采用橡胶O形圈垫片进行密封。
  2. 每个腔室安装在一个置于水浴中的支架上。支架设计使得仅腔室的下部（气体进口以下部分）浸入水中。为保持稳定，腔室后端依靠一个支撑物，使整个腔室保持水平放置。这可确保每个腔室与水浴充分均匀接触。
  3. 聚乙烯管将氧气罐连接至麻醉蒸发器，然后通过一个10 L/min的流量计。管道随后分成25根等长的小直径分流管，以确保向24个腔室及一个麻醉剂分析仪均匀输送气流。
  4. 每个腔室的气体进口对侧设有真空管出口。这种设计促进单向气流，避免呼出的二氧化碳被重复吸入。各真空管在集流管处汇合后连接至实验室内部的负压抽吸系统。主真空管路上设有泄压阀，以确保每个腔室内维持大气压条件。
  5. 水浴中注入足量的水，以完全接触每个腔室的底部。水通过泵在水浴中循环，并恒定维持在37 oC。

2. 暴露前检查系统

  1. 检....

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结果

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图1展示了逐步LORR（翻正反射丧失）实验在评估药理学干预长期效应方面的应用价值。异喹啉酸（IBA）是一种谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的激动剂，常被用作兴奋性毒素以诱导永久性神经元损伤。本实验中，我们在测试前一周，向C57BL/6J小鼠的腹外侧视前区（VLPO）双侧各注射10 nl的1% IBA。该核团中的大多数神经元在清醒状态下放电频率较低，而在非快速眼动睡眠、快速眼动睡眠期间以及暴露于催眠剂量的全身麻醉药时，其活动显著增强23,27-29。成功的VLPO损伤应导致对异氟烷诱导的催眠状态产生抵抗。在每一递增浓度的异氟烷暴露下，记录丧失翻正反射的小鼠比例，并以log10标度绘制其与麻醉剂浓度的关系。对每组小鼠（溶剂对照组与IBA注射组）的数据均拟合为S型剂量-反应曲线。由于该实验始终以所有动物处于直立状态开始，以全部动物丧失翻正反射结束，因此曲线的下限和上限参数分别被固定为0和1。曲线其余的自由参数包括EC50（即50%小鼠丧失翻正反射时的麻醉剂浓度）和Hill斜率（反映群体在催眠状态转换过程中的变异性）。采用F检验分析.......

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讨论

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尽管对单只小鼠进行翻正反射消失（LORR）评估看似是一项简单的任务，但为了从一组动物中收集可靠的数据，仍必须保持受试个体间生理条件的一致性。本文介绍的这种高度可控、高通量的LORR装置为实验标准化和效率最大化提供了一种有效方法。通过遵循体温调节和气流均匀分配的基本原则，该系统可轻松复制并根据实验者的具体需求进行定制。腔室尺寸可根据其他物种（如大鼠）进行调整，通过在进气端和真空端增加更多分支接口，还可扩展以容纳更多腔室。透明的丙烯酸腔室使所有受试动物均清晰可见，便于对实验过程进行录像，以便后续进行事后结果复核。此外，丙烯酸材料也兼容射频遥测系统，可用于监测体温、血压和生物电位等指标。

我们介绍了两种不同的方法，用于评估药理学干预后麻醉敏感性。无论是苏醒时间测试还是逐步诱导测试，都需要实验者评分动物翻正反射的有无。即使对LORR（翻正反射消失）有明确的定义，例如"在被翻转为仰卧位后两分钟内无法将四肢全部置于实验舱底部"，评分仍可能具有一定的主观性。为确保一致性，最好由同一位对处理分组不知情的实验人员在整项实验过程中对所有动物进行评分。在选择用于评估麻醉敏感性的测试方法时.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由 R01 GM088156 和 T32 HL007713-18 资助。我们感谢宾夕法尼亚大学研究仪器车间的 Bill Pennie 和 Michael Carman 在组装翻正反射装置过程中提供的帮助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂名称公司目录编号备注
OxygenAirgasOX300
IsofluraneButler Schein可替换为任何感兴趣的挥发性麻醉剂
材料名称公司目录编号备注
质量流量计 - 10 SLPMOmega EngineeringFMA-A2309
质量流量计 - 500 SCCMOmega EngineeringFMA-A2305
麻醉剂分析仪/气体指示器AM BickfordFI-21 Riken
加热水泵Fisher Scientific13-874-175
温度应答器BMDSIPTT-300
射频温度读取器BMDSDAS-6007

参考文献

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  1. Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
  2. Overton, C. E.

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