Summary
Förlust av den rätande reflex har länge fungerat som en vanlig beteende surrogat för medvetslöshet, även kallad hypnos, i försöksdjur. Förändringar i flyktiga narkos känslighet som orsakats av farmakologisk intervention kan upptäckas med ett noga kontrollerat system med hög genomströmning bedömning, som kan anpassas för leverans av alla inhalerade terapeutiskt.
Abstract
En önskvärd endpoint av narkos är det tillstånd av medvetslöshet, även känd som hypnos. Definiera det hypnotiska tillståndet hos djur är mindre rättfram än det är hos människor. En allmänt använd beteende surrogat för hypnos hos gnagare är förlusten av upprätningsreflex (LORR), eller den punkt där djuret inte längre svarar på deras medfödda instinkt att undvika sårbarhet rygg VILA. Vi har utvecklat ett system för bedömning LORR i 24 möss samtidigt medan noga kontrollerar för eventuella blandar ihop, bland annat temperatursvängningar och varierande gasflöden. Dessa kammare medger tillförlitlig bedömning av narkoskänslighet mätt med latens för att återvända för den rätande reflex (RORR) efter en fast narkos exponering. Alternativt, med hjälp av steg ökar (eller minskar) i bedövningsmedel koncentration, kamrarna möjliggör även bestämning av en befolkning känslighet för induktion (eller uppkomst) mätt medEC50 och Hill lutning. Slutligen kan de kontrollerade miljökammare som beskrivs här anpassas för en mängd olika alternativa användningar, bl.a. inhalerad leverans av andra droger, toxikologiska studier, och även realtidsövervakning av vitala funktioner.
Introduction
Narkosmedel definieras av sin förmåga att orsaka ett reversibelt tillstånd av hypnos i en mängd olika arter, men en förklaring till hur en sådan skiftande klass av läkemedel allt kan framkalla en sällsam endpoint fortfarande instabil. Ett antal teorier har belägen under åren, med början i Meyer-Overton korrelation mellan narkos potens och fettlöslighet, vilket föreslås allmänna membranstörningar som grund för hypnos 1,2. Nyare uppgifter tyder på att protein mål som påverkar neuronal signalering bidrar till bedövande effekt. Möss har visat sig vara en oumbärlig modell för att utforska dessa teorier på grund av homologin mellan mus och människa narkos lyhördhet. Även om en mus som inte kan tillfrågas om sin subjektiva medvetande under narkos, vissa primitiva reflexer fungerar som användbara surrogatmått gnagare hypnos. Under de första dagarna efter födseln, möss utvecklar en reflexiv rätande response som hindrar dem från att passivt placeras i ryggläge 3. Dosen av anestesi där en mus förlorar sin rätande reflex korrelerar väl med mänskliga hypnotiska doser 4.
Bedömning av förlust av upprätningsreflex (LORR) har blivit ett vanligt laboratoriestandard för att testa narkos känslighet hos möss, samt en mängd andra arter, inklusive råtta, marsvin, kanin, iller, får och hund 5-8. Dosen av en viss bedövningsmedel där LORR kommer att ske för medlemmar av en art är extremt konsekvent, men det kan förskjutas avsevärt av miljöfaktorer. Till exempel, sömnbrist råttor är känsligare för både flyktiga och intravenösa bedövningsmedel 9 och råttor med hög aerob kapacitet är mindre känsliga för isofluran 10. Hypotermi har också visat sig minska dosen av många anestetika krävs för hypnos i ett stort spektrum av arter 11-14. Föratt tillförlitligt identifiera bedövnings dos vid vilken LORR sker i en grupp försöksdjur, är det viktigt att bedömningen miljön följas noga för att minimera stress, behålla euthermia, och leverera lika mycket läkemedel till alla ämnen. Föga förvånande är genetiska faktorer också kända för att förändra narkos känslighet 15-18. Följaktligen bör noggrant övervägande också ägnas kontrollen för genetisk bakgrund 19.
Vi har utvecklat en anordning som säkerställer identiska gasformigt bedövningsmedel levereras till var och en av 24 möss under upprätthållande av en konstant 37 ° C omgivning. Den transparenta cylindriska utformningen av våra exponeringskammare möjliggör snabb LORR bedömning och enkel integration av telemetriska fysiologiska mätningar. Detta system har visat att noggrant mäta isofluran, halotan och sevofluran induktion EC50 och tid till uppkomst i vildtyp möss 20. Vi har även använtdetta system för att observera förändringar i narkoskänslighet i möss med genetiska mutationer och riktade hypotalamus lesioner 21-23. Här beskriver vi två sätt på vilka narkos känslighet kan bedömas efter en farmakologisk intervention med hjälp av vår kontrollerad miljö apparat. Steady-state fenotypning av flyktiga narkosinduktion och uppkomst känslighet kräver 8-10 timmar och är därmed bäst anpassade för studier där försöksbetingelserna inte förändras, till exempel vid kroniska eller långverkande farmakologiska interventioner. Men för kortverkande behandlingar vars effekter skingra kraftigt över tiden vi också presentera en enkel procedur för att utvärdera förändringar i upprätningsreflex följande stereotaktiskt-riktade microinjections eller intravenösa läkemedelsbehandlingar som väsentligt påverkar narkos uppkomst. Dessa tester utgör en liten delmängd av de potentiella tillämpningar för denna kontrollerad miljö-systemet, som skulle kunna anpassas för valfritt antal subjjekt av olika arter för att få någon typ av inhalerade terapeutiska.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla som deltar i djurförsök som beskrivs häri har godkänts av University of Pennsylvanias Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Översikt av testapparater
- Testapparaten består av 24 tydliga akryl cylindriska kammare 10 cm lång och 5 cm i diameter (total volym av 200 ml). Denna storlek är lämplig för en typisk 25 g vuxen mus. Chambers har portar vid varje ände för gas-inlopp och utlopp. Utloppsänden är borttagbar, så att djur lätt kan lastas in i kammaren. Öppningar gasporten är noggrant tätas med teflonband, medan gummi O-ringspackningarna används för att täta den löstagbara änden av de cylindriska kamrarna.
- Varje kammare är monterad på ett ställ som sitter inne i ett vattenbad. Hyllan är monterad, så att endast den nedre delen av kamrarna (nedan gasinloppen) är nedsänkt. För stabilitet, den bakre änden av kammaren vilar på ett stöd, så att hela chamber sitter vågrätt. Detta säkerställer jämn kontakt av hela kammaren med badet.
- Polyetenslang ansluts en syretank till en anestetisk förångare, och passerar sedan genom en 10 L / min flödesmätare. Slangen delar sig i 25 motstånd med samma längd med liten diameter för att säkerställa lika flöde levereras till var och en av de 24 kamrarna och en agent analysator.
- Vakuumledningarna gå ur varje kammare vid den motsatta änden av gasinloppet. Detta främjar enkelriktat flöde som eliminerar återandning av utandad koldioxid. Vakuum linjerna kombineras på ett grenrör för att ansluta till en egen sugledning. En pop-off ventil längs huvudvakuumledningen säkerställer atmosfäriska tryckförhållanden inom varje kammare.
- Badet är fylld med tillräckligt med vatten för att helt kontakta bottnen av varje kammare. Vattnet cirkuleras genom badet och hölls vid en konstant 37 ° C medelst en pump.
2. Kontrollera systemet före exponering
- CHeck, att temperaturen hos vattenbadet är 37 ° C under hela badet.
- Flödes syre med en hastighet av 5 L / min (200 ml / min per kammare + agent analysator). Sänk varje kammare under vatten och leta efter bubblor eller vatten tränger in i kammaren, som båda är tecken på läckage. Täta eventuella läckor innan experimentet.
- För varje kammare, anslut en 500 ml / min flödesmätare i rad efter kammaren för att se till att flödena är balanserade över var och en av de 25 gasledningar. Detta säkerställer att ingång 5 L / min flöden kommer att fördelas jämnt så att varje kammare erhåller 200 ml / min flöde. Varje kammare inte får det förväntade flödet bör ha sitt inflöde och utflöde slang kontrolleras för hinder.
- Kalibrera agent analysator för att säkerställa en avläsning av 0,00% isofluran när 100% syre flödar.
3. Implantat Temperatur Transponder
- En vecka före tillvänjning, söva varje mus med 2% isofluran.
- Sterilisera rygghalsområdet med Betadine.
- Injicera en temperatur transponder subkutant mellan skulderbladen med hjälp av den sterila, prepackaged injektor nål.
- Övervaka injektionsstället dagligen för infektion och migrering av transpondern.
4. Vänja djur till Testa Chambers
- Fyra dagar före den första bedömningen, placera alla möss i individuella kammare för 2 timmar med 100% syrgas flödar.
- Upprepa steg 4.1 dagligen under de fyra dagar före bedömningen för att undvika de förbryllande effekterna av stress på grund av en ny miljö.
5. Utför farmakologisk behandling som du vill testa för effekter på Bedövning Känslighet
- Detta ingrepp kan vara en stereotaktisk injektion i en specifik del av hjärnan som 24 en intravenös eller intraperitoneal injektion 25 eller tillförsel av ett läkemedel till en specifik hjärnområde via kanyl 26.
- Eftersom dessa förfaranden själva kan förändra narkos känslighet jämfört med en naiv djur, bör en ordentlig kontrollgrupp genomgå samma procedur med fordons injektioner.
- Se till att farmakologisk behandling har en lämpligt lång verkningstid om du planerar att göra en stegvis ökande och / eller minskande bestämning av narkos känslighet som visas i steg 6 nedan, annars gå till steg 7.
6. Bedöm Bedövning känslighet med hjälp av Stepwise EC 50 Fastställande för induktion och Emergence
- Placera varje djur i enskilda kammare med 100% syrgas flödar.
- Ställ isofluran koncentration till 0,4% * 15 min. Under de sista 2 min av denna period, bedöma varje djur rätande reflex med mjukt böljande kammaren tills musen är placerad på rygg. Den rätande reflex anses vara intakt om och endast om musen kan återställa allaav sina tassar på golvet av kammaren inom 2 min.
- * Observera att 0,4% isofluran är en subhypnotic dos i C57BL/6J-möss. Om några möss förlorar sin rätande reflex i det första steget, den första dosen var för stor och bör minskas på senare dagar.
- Anteckna tillståndet för rätande reflex för varje mus och scanna varje mus för temperaturdata. En mallposten, visas i tabell 1.
- Öka isofluran koncentrationen med ~ 0,05% i 15 min och upprepa steg 7.2. Fortsätt att göra detta tills alla djuren har förlorat sin rätande reflex.
- Tillval: upprepa samma procedur för att minska stegvisa isofluran doser tills alla djur har återfått sin rätande reflex (se steg 6.3).
- För att avsluta försöket, stäng av isofluran och spola hela systemet med 100% syrgas i 15 min. Detta kommer att bidra till att förhindra hypoxi som mössen återhämta sig innan de återvände till sina hem burar och skyddar experimenter från någon anestetikum exponering.
- Tillval: om antalet djur eller antalet anestesi koncentrationer är begränsade på grund av bristande resurser eller tid, de kurva-fit parameterskattningar-särskilt Hill lutning-kan ha underskattad, falskt låga feluppskattning. I sådana fall kan det vara nödvändigt att upprepa narkos känslighet mätningar som beskrivs i steg 6,1 till 6,6 på ytterligare upp till två experimentella dagar till fullo få den sanna Hill lutning parameter och dess motsvarande feluppskattning.
7. Bedöma Kortfristiga Förändringar i Anesthetic Känslighet med tid till uppkomst
- Placera varje djur i enskilda kammare med 100% syrgas flödar.
- Ställ isofluran koncentration till 1,2%, vilket motsvarar den induktion ED 99 för vildtyp C57BL/6J-möss 20. Behåll under 30-60 min beroende på den förväntade varaktigheten av verkan av den akuta ingripanden.
- Bekräfta LORR ialla djur genom att försiktigt rulla varje kammare tills möss placeras på ryggen.
- Stäng av isofluran och flöde 100% syre. Mät tiden till varje djur återfår sin rätande reflex. Detta definieras av placeringen av alla fyra tassar på golvet av kammaren och bekräftades genom närvaron av tre på varandra följande tester med en intakt rätande reflex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar användbarheten av stegvis LORR-analys för att fastställa långsiktiga effekter av farmakologisk intervention. Ibotensyra (IBA) är en agonist av glutamaterg N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorn, som ofta används som ett excitotoxin att orsaka permanenta neuronala lesioner. Här vi injicerade 10 nl av 1% IBA bilateralt i ventrolaterala preoptiska området (VLPO) i C57BL/6J-möss en vecka före testning. Majoriteten av nervceller i denna kärna uppvisar låga bränning under vakenhet och specifikt öka sin aktivitet under icke-rapid eye movement sleep, snabba ögonrörelser sömn, och med exponering för hypnotiska doser av narkosmedel 23,27-29. Framgångsrika lesioner i VLPO skulle orsaka resistens mot isofluran-inducerad hypnos. Vid varje ökande nivå av isofluran, var andelen av möss som hade förlorat den rätande reflex plottas mot bedövningsmedel koncentration på en stock 10 skala. Dataför varje grupp av möss (vehikel-injicerade och IBA-injicerade) tillsattes sedan i form med en sigmoidal dos-responskurva. Eftersom denna analys börjar alltid med alla djur upprätt och slutar alltid med alla djur som har förlorat righting reflex, botten-och toppkonstant begränsades till 0 och 1, respektive. De återstående fria parametrar hos kurvorna är EG-50, eller den koncentration av anestetikum, vid vilken 50% av mössen har förlorat sin rätande reflex, och Hill lutning, som återspeglar populationsvariansen under sin hypnotiska tillståndsövergång. Ett F-test används för att fråga om en enda induktionskurva med delad EC50 och Hill lutningsparametrar bäst passar både fordon och IBA grupper eller om separata induktionskurvor med olika parametrar bättre passar data. De frihetsgrader i detta test härrör från rådatapunkter som ligger bakom kurvan passform och därmed beroende av antalet anestesi testade koncentrationer och antalet parametrar att fit-EC50 och Hill lutning i det här fallet. Stegvis uppkomst data analyserades och modelleras identiskt med data för induktion. Observera att EC50 för uppkomsten är nästan alltid lägre än den för induktion pga anestetikum hysteres även känd som neural tröghet 30. I motsats till förväntade resultat, djur som fick IBA i VLPO visade inga signifikanta skillnader i EC50 eller Hill lutning för induktion eller uppkomst jämfört med fordons-injicerade kontroller (F 2,80 = 1,73 och p = 0,184 för induktion, F 2, 88 = 2.89 och p = 0,061 för uppkomst). Detta indikerar att mus VLPO neuroner är resistenta mot lesion med en% IBA, vilket bekräftas med obduktion histologi (ej visad). Lu et al. har tidigare visat att en dos av 10% IBA krävs för att Skada råttan VLPO 31, men histologisk undersökning av mus VLPO efter injektion av 10% IBA visade också ingen betycant cellförlust (icke visad). Råttan VLPO är känd för att uttrycka NMDA-receptorer 32. Eftersom 10% IBA kan utöva en akut effekt på bedövningsmedel känslighet när injiceras i VLPO (se figur 2, diskussion nedan), hävdar det att musen VLPO också måste ha NMDA-receptorer som behövs för IBA: s handlingar. Sålunda skälet till diskrepansen mellan arter är fortfarande oklart. Framgångsrika mus VLPO lesioner har uppnåtts med hjälp av en riktad galanin-saporin 23.
Även IBA inte har en långsiktig effekt på isofluran känslighet när injiceras i VLPO, förväntas den akuta excitatoriska karaktären av denna drog för att stimulera VLPO nervceller och tillfälligt öka narkos känslighet. I figur 2 har vi använt tiden till uppkomst prov för att uppvisa en stor spetsig förskjutning i isofluran känslighet omedelbart efter bilateral IBA mikroinjektion i VLPO vilket framgår av påtagligt förlängdhypnos efter avslutad bedövningsmedel leverans (p <0,001). Omvänt, mikroinjektion av IBA i närliggande mediala septum orsakade ingen förändring i tiden till uppkomst jämfört med fordons-injicerade kontroller (p> 0,05). Detta fynd ger en intressant aspekt på tidigare arbete som visar att inaktivering av denna kärna förlänger tiden till uppkomst 33,34. Data för försöksgrupp och kontrollgrupp i tid till uppkomsten test medelvärde och jämfördes med en envägs ANOVA.
| Tid | Isofluran (% atm) | Musen # 1 | Musen # 2 | Musen # 3 | ... |
| 0,4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0,45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0,5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0,55 | - | X | X | |
| ... | 0,6 | - | X | X | X |
. Tabell 1 Exempel på Log blad för Långsiktig Bedövning Känslighet Bedömning: Varje 15 min bedövnings dosen höjdes med 0,05% och upprätningsreflex bedömdes för varje djur. "X" betecknar djur som hade förlorat sin rätande reflex för en given tidpunkt och "-" betecknar de som bibehållit sin rätande reflex.
Figur 1. Bedömning av upprätningsreflex En vecka efter ibotensyra Injektion i ventrolaterala preoptiska Nuc avLEU: er: Den långsiktiga bedövningsmedel känslighetsanalys utfördes på möss med antingen bil eller ibotensyra (IBA) sprutas in i ventrolaterala preoptiska området (VLPO) en vecka före testning. Induktion och uppkomst data för varje grupp anpassades med en sigmoidal dos-responskurva (induktion med heldragna linjer, växten med streckade linjer) tillsammans med 95% konfidensintervall gaff en trendkurvor (skuggade staplar). Anestetiska koncentrationen plottades på en stock 10 skala. Överlappande 95% konfidensintervall visas i lila. Den sigmoidal dos-repsonse passar för både fordon och IBA grupperna föreslår inga bevis för olika bäst-fit kurvor baserade på EC50 och Hill lutning. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Tid till Emergence Efter Lokala Mikroinjektion av ibotensyra: Omedelbart före bedömning, fick mössen en mikroinjektion av den N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptoragonist ibotensyra (IBA) i ventrolaterala preoptiska kärnan (VLPO). Detta område är känt för att vara aktiverad under isofluran-inducerad hypnos. IBA injektion ledde till en akut ökning av den tid för att återvända på rätande reflex jämfört med fordons-injicerade kontroller (p <0,001). Tiden till uppkomst av djur med IBA injiceras i mediala septum skilde sig inte från kontroll (p> 0,05). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om bedömningen av LORR i en enda mus är en till synes enkel uppgift, är det ändå viktigt att bibehålla identiska fysiologiska förhållanden mellan individer i syfte att samla in tillförlitliga uppgifter från en grupp djur. Den hårt reglerad, hög kapacitet apparat LORR presenteras här erbjuder ett sätt att standardisera experiment och maximera effektiviteten. Genom att följa de grundläggande principerna för värmereglering och lika flödesfördelning, kan systemet lätt återskapas och anpassas för att passa individuella praktiker behov. Kammarstorleken kan skalas för andra arter, exempelvis råttor, och ytterligare kammare kan tillgodoses genom att fästa fler förgreningar till inflödet och vakuum. Alla ämnen är väl synlig genom den klara akrylkammare, vilket gör det möjligt att videorekordförsök för sekundär post-hoc bekräfta resultat. Akryl är även kompatibel med radiofrekvens telemetrisystem, som kan användas för att övervaka temperatur, blodtryck och biopotentialer.
Vi presenterar två olika metoder för att bedöma narkos känslighet efter en farmakologisk intervention. Både tid till uppkomsten och de steginduktions tester kräver försöksledaren att göra mål på närvaron eller frånvaron av den rätande reflex. Även med en uttrycklig definition av LORR, som "inte kan placera alla fyra tassar på kammargolvet inom två minuter efter att rullas på ryggen", kan bedömningen vara subjektiva. Det är bäst att ha samma behandling-förblindade individuella poäng varje djur under hela experimentet för att säkerställa enhetlighet. När du väljer vilket test som ska användas för narkos känslighet bedömning, bör den förväntade längden av effekten av farmakologisk behandling vara den avgörande faktorn. Många läkemedel har en kort verkningstid, där den akuta tiden till uppkomst paradigm kan ge användbar information om bedövningsmedel känslighet under en begränsad tidtid. Dock kan ett läkemedel företrädesvis påverkar ett djurs känslighet för induktion av hypnos i stället uppkomst, förändringar i tid till induktions är ofta svåra att upptäcka eftersom induktion sker snabbt och kräver därför fortlöpande bedömning. Den längre stegvis test för EC 50 av induktion och uppkomst kan ge information om både ingång till och utgång från hypnos. Den totala längden av experimentet kommer att bero på storleken på ökningen av vilken narkos koncentration förändras vid varje steg, med typiska induktion + uppkomsten tester som pågår ca 8 tim. Minskning av anestetikum stegstorlek runt den förväntade EG 50 och ökning av antalet djur i varje grupp kommer att ge en bättre inpassade dosresponskurva men skulle också förlänga den tid som krävs för att fullborda analysen.
Vissa farmakologiska interventioner kan differentiellt förändra minut ventilation av försöksdjur jämfört med sina kontroller. Than kan leda en grupp för att andas den flyktiga bedövningsmedel i tid till uppkomsten prov snabbare än den andra, vilket confounding resultaten. Solt et al. beskriva ett bra alternativ metod för att testa narkos känslighet i detta scenario 35. I deras experiment, är systemisk metylfenidat levereras under konstant isofluran exponering hos djur som redan har jämvikt med bedövningsmedel. Potentiella confounding effekter på minutventilation därmed undantagna under kontinuerlig narkos exponering som bedövningsmedel upptag och distribution under stationära förhållanden är exakt balanseras av metabolism och eliminering. Kamrarna vi beskriver lätt skulle kunna modifieras med en ytterligare gastäta porten för att tillåta passage av rör för intravenös eller intracerebral läkemedelstillförsel. Det bör också noteras att den beskrivna 15 min av jämviktsinställning till varje koncentration av anestetikum i den stegvisa analysen inte kan vara tillräcklig i vissa fall. Anesthetics med högre löslighet än isofluran, t.ex. halotan, tar längre tid att nå sin fulla koncentration i vävnaden. Större djur och djur som genomgår större steg i narkos koncentration kan också kräva mer tid för att uppnå jämvikt. För att avgöra om 15 min är verkligen tillräckligt för att uppnå jämvikt bör anestesivävnadsnivåer vid samma koncentration av narkosmedel på både stigande och fallande lemmar av exponering mätas.
I de fall där ett djurs förmåga att röra sig fysiskt eller farmakologiskt hindrade får LORR inte fungera som ett bra surrogat mått på hypnos. Den mest pålitliga och mest använda alternativet är kortikala elektroencefalografiska (EEG) inspelningar. Även EEG kan bli bättre på att plocka upp mer subtila förändringar i bedövningsmedel känslighet, är det betydligt dyrare att installera än apparaten vi beskriver. Implantation EEG-elektroder är en invasiv och tidskrävande procedur, och förmågan att obtain data från flera möss samtidigt begränsas ofta av utrustningens tillgänglighet. Dessutom är analysen av EEG-inspelningar konceptuellt mer abstrakt och svårtolkad än den enkla binära utgången på LORR bedömning. Av dessa skäl, beteendetester som de som beskrivs här är ofta mer genomförbara metoder för snabb screening narkos känslighet. Observera att EEG-mönster som tyder på upphetsning och hypnos inte kan korrelera väl med beteendet. LORR och EEG är distinkta slutpunkter som både sannolikt ger användbar information om narkos känslighet.
Förutom eventuella läkemedelsinducerade förändringar i minutventilation och rörlighet, finns det flera andra begränsningar i de metoder som beskrivs häri. Även LORR är en standard surrogat för hypnos över fältet, de kriterier och metoder som används för att mäta skiljer sig åt mellan laboratorierna. Vissa förespråkar att möss ska roteras med en konstant hastighet för att bedöma righting reflex. Kontinuerlig utvärdering logiskt smalnar den exakta tidpunkten som den rätande reflex försvinner och / eller avkastning, men kan handlingen att förvandlas liggande vara mer stimulerande än att bara kvar på rygg. Dessutom är stegvis LORR bedömning en tidskrävande analys som kan förlängas ytterligare om 15 minuter av jämvikt vid varje steg visar sig vara otillräckliga.
Trots dessa begränsningar, de potentiella tillämpningar för detta protokoll sträcker sig långt utöver de enskilda fall som vi har presenterat. Tydligt, farmakologiska interventioner är inte den enda metod som narkos känslighet kan ändras, riktade lesioner, anatomiska avvikelser, och genetiska mutationer kan alla testas med samma stegvis EC50 beslutsamhet. Den kontrollerade systemmiljö som presenteras här kan användas för att leverera någon form av inhalerat läkemedel, såsom kortikosteroider, antibiotika eller experimentell terapi. Förmågan att exponera många möss till samma amount av läkemedel på en gång gör denna inställning idealisk för toxikologiska studier. Dessutom kammare fungerar som ett ideal postoperativ återhämtning miljö med reglerad temperatur och frisk syrgasflöde. Denna apparat är användbart för alla fall där grundläggande djur vitala måste övervakas och kontrolleras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01 GM088156 och T32 HL007713-18. Vi vill tacka Bill Pennie och Michael Carman från University of Pennsylvania Research Instrumentation Handla för deras hjälp med att montera våra upprätningsreflex apparat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
