Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.
Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi kullanılarak örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için bir yöntemdir. Redi etiketleme her bir serbest amin için iki metil grubu eklemek için düzenli olarak (ışık) veya formaldehid ve sodyum siyanoborohidrid döteryumlanmış (ağır) formları kullanılarak gerçekleştirilir. Burada Redi etiketleme ve kompleks protein karışımları kantitatif karşılaştırılması için sağlam bir protokol göstermektedir. Karşılaştırma için Protein örnekleri hafif ya da ağır metil etiketler, karıştırılmış ve LC-MS/MS ile ko-analiz ya da taşımak için etiketli peptidler içine sindirilir. Bağıl protein bolluğu tam MS spektrumları elde oluşturucu peptidin ağır ve hafif olarak işaretlenmiş versiyonlarının iyon kromatogram tepe alanlarının karşılaştırılması ile nicelendirilir. Burada tarif edilen yöntem örnek ters-fazlı, katı faz ekstraksiyonu ile hazırlama, peptidlerin üzerinde kolon Redi etiketleme, bazik pH rev tarafından peptid içerir fraksiyonasyonersed faz (BPRP) kromatografi ve StageTip peptid saflaştırma. Biz kararlı izotop birleşme için diğer yöntemlere göre Redi etiketleme avantajları ve sınırlamaları tartışmak. Biz örnek hemen hemen her tür protein zengindi karşılaştırmak için, hızlı, ucuz ve doğru yöntem olarak Redi etiketleme kullanarak yeni uygulamalarını vurgulayın.
Karmaşık numuneler arasında birçok proteinin konsantrasyonu farklılıklarını ölçme proteomikteki merkezi bir sorundur. Giderek, bu farklı izotopik etiketler, her numune proteinlerin etiketleme örnekleri birleştirilmesi ve konsantrasyon farkları ölçmek için kütle spektrometresi kullanılarak yapılmaktadır. Çeşitli yöntemler, protein ve peptid kararlı izotopik etiketleme için vardır. ICAT 3, 4 iTRAQ ve indirgeme dimetilasyonu 5 protein ekstraksiyonu ve sindirim sonra izotop etiketleri ekleme ise 15 N etiketleme 1 ve SILAC 2, in vivo olarak metabolik izotopik etiketler tanıtmak. Bu yöntemler arasında, indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) numune hemen hemen her tür protein konsantrasyonu farklılıkları ölçmek için ucuz, tekrarlanabilir bir yöntem olarak popülerlik kazanıyor.
Redi etiketleme düşürülür bir Schiff bazı oluşturmak üzere formaldehit ile reaksiyona sokulmasını içerir peptidlerisiyanoborohidrit. Bu reaksiyon, N-termini ve lisin yan zincirleri ve monomethylates N-terminal prolinler on serbest amino grupları dimethylates. Burada açıklanan protokol döteryumlu formaldehit ve siyanoborohidrit (Şekil 1) kullanılarak bir "ağır" etiketli doğal izotopik dağıtım ve örnek 2 hidrojen atomuna sahip reaktifler kullanılarak bir "ışık" etiketi ile örnek 1 'de peptidler metile. Işık ve bir kütle spektrometresi kullanılarak, iki form arasında ayırt etmek için kullanılır ağır biçimleri arasında, 6,0377 Da'lık bir kütle farkı, bir peptit sonuçlarına her dimetile amino grubudur. Özel olarak, nispi bolluk peptid ışığın MS1 ekstre iyon kromatogram alanlarında oranında (MS1 alan doruk olan oranı) ve her bir peptit iyon çifti için ağır bir versiyonu olarak nicelendirilir. Bir proteinin nispi bolluk, proteinin tüm peptidler arasında orta MS1 tepe alanı oranı olarak hesaplanır. Bu yazıda, davranış için sağlam bir protokol açıklarters-faz peptid katı faz ekstraksiyonu, kolon Redi etiketleme, peptid fraksiyonasyon bazik pH fazı (BPRP) kromatografi tersine ve StageTips kullanarak peptid karışımları saflaştırılmasını (Şekil 2) içerir LC-MS/MS ile Redi etiketleme deneyleri ing . Biz kantitatif Proteomikte için Redi etiketleme kullanmanın avantajları ve sınırlamaları tartışmak.
Yüksek ucuz etiketleme reaktifleri (reaktif numune başına 1 dolardan daha az maliyeti), hızlı reaksiyon hızı (~ 10 dk), yan ürünlerin yokluğu: Birkaç puan nicel Proteomikte için cazip bir yöntem indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) kullanılarak peptidlerin kararlı izotop etiketleme yapmak tekrarlanabilirliği (Şekil 3, 4), sabit reaksiyon ürünleri, bir proteaz kullanma yeteneği ve işaretli peptidlerin yüksek iyonlaşma verim. Bir sentetik ortam üzerinde spesifik amino asit o…
The authors have nothing to disclose.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d’excellence to ACT.
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |