通过半脾注射技术建立的肝转移瘤的临床前小鼠模型。
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摘要
摘要
已开发出多种小鼠模型用于研究人类癌症，并推动对癌症治疗和发病机制的理解。本文描述了一种临床前小鼠胰腺肿瘤肝转移模型，该模型通过将同源小鼠胰腺肿瘤细胞注射至半脾脏，从而建立肝转移。该模型模拟了肝转移性疾病患者中的多种临床状况。小鼠可稳定地在肝脏中形成转移灶，可用于转移过程的研究、实验性治疗的测试以及肿瘤免疫学的研究。
引言
胰腺导管腺癌（PDA）是美国癌症相关死亡的第四大原因1。转移性PDA患者的五年生存率为2-12%1。尽管目前胰腺癌的辅助化疗和新辅助化疗比以往更加有效，但仍迫切需要开发新的治疗方法。
新型治疗手段的开发需要可靠的临床前动物模型。尽管皮下肿瘤模型使用简便，但其缺点包括肿瘤无法转移，且不能模拟人类癌症中的肿瘤进展过程及微环境。基因工程小鼠模型，例如携带Kras和p53基因致癌性敲入突变的小鼠模型（KPC模型）2，以及带有YFP谱系示踪标记的KPC模型（PKCY模型）3，可在免疫功能健全的小鼠中研究自然发生的肿瘤。此外，该模型中的肿瘤微环境未被人为改变，更接近人类肿瘤的进展过程。然而，这些模型中肿瘤发生的时间具有变异性，使得实验性治疗的研究变得困难。此外，这些小鼠的回交过程需要耗费大量时间和资金，这在实际操作中并不总是可行。最后，移植型人源性胰腺导管腺癌（PDA）小鼠模型需要使用免疫缺陷小鼠，而这类小鼠的肿瘤微环境存在异常或缺失。因此，在这些临床前模型中显示出疗效的实验性治疗手段，往往在人类临床试验中无法重现其效果4。
该半脾切除小鼠模型利用Panc02肿瘤细胞，这是一种高度致瘤性的甲基胆蒽诱导的胰腺肿瘤细胞系，源自C57BL/6小鼠5,6。此外，也可使....
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方案
所有动物实验均遵循约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指导方针，动物饲养管理符合实验室动物护理评估与认证协会（AAALAC）的规范。 手术在符合无菌条件的手术室内进行，该手术室每小时至少进行十五次空气交换。所有器械在手术前均经高压灭菌处理，并在每只小鼠操作间隙使用70%乙醇再次消毒。所有预计无法存活至手术结束的小鼠，均在CO2环境中安乐死3分钟 ，随后在仍处于麻醉状态下进行颈椎脱位处死。
1. 细胞制备
- 将培养的 Panc02 细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，浓度为 2×107 个细胞/ml，并置于冰上保存。
2. 小鼠准备
- 将氯胺酮（100 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）混合后，分次对8-12周龄的C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射。
- 通过检查趾夹回缩反射是否消失，确认小鼠已完全麻醉。
- 根据需要追加注射氯胺酮（100 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）的混合剂，以确保小鼠持续处于完全麻醉状态。
- 在小鼠眼部涂抹Puralube Vet眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
- 剃除手术区域的毛发，以避免伤口污染。
- 用70%乙醇对左侧肋下切口区域进行消毒，随后使用碘液处理。
- 在腹....
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结果
将Panc02肿瘤细胞注射至半侧脾脏（图1）后，100%的小鼠会形成肝转移灶，而若操作正确，则不会观察到肺部或腹膜转移。该技术已使用Panc02细胞在多个独立实验中对超过一百只小鼠进行操作，结果具有一致性：所有未经治疗的小鼠均在半脾切除术后30至60天内因肝转移而死亡（图2）。为了在未治疗组与治疗组之间获得统计学显著性差异，每组需要十只小鼠。然而，所需动物数量会因所使用的细胞系和治疗方案的不同而有所变化。在此模型中使用Panc02细胞时，可在尸检时观察到多个肝转移灶（图3）。
KPC 肿瘤细胞是一种来源于转基因小鼠的同源性胰腺肿瘤细胞系，这些小鼠具有组织特异性的 Kras 和 p53 基因敲入突变11，也可用于本模型。使用这些细胞可产生类似的肝转移灶（图4）。然而，在采用不同细胞系评估肝转移形成时，应逐步优化注射细胞数量，直至所有未处理小鼠均出现肝转移。Panc02 细胞可作为阳性对照，以确认手术操作正确无误。重要的是，尽管肝.......
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讨论
通过脾血注射技术建立的这种胰腺癌肝转移小鼠临床前模型，是首个能够模拟肝转移性疾病患者多种临床和免疫学特征的模型。该模型相较于其他小鼠模型具有多项优势。首先，与转基因胰腺癌模型相比，本模型可实现100%小鼠在相同时间点稳定发生肝转移，而传统转基因模型仅有30%的小鼠出现肝转移，且转移发生时间差异较大，因此本模型使研究人员能够在高度可重复的条件下研究转移性疾病。此外，该模型保留了未受干预的脾脏，从而可在可重复的体系中进行外周血免疫分析。再者，在不使用抗肿瘤治疗的情况下，小鼠会因肿瘤进展而在相对一致的时间点死亡，且不同实验间的生存曲线高度一致。最后，该模型具有多种应用价值，包括肝转移研究13、肿瘤免疫学研究10以及实验性治疗测试9。
该技术的关键步骤包括细胞悬液制备、肿瘤细胞注射、Horizon止血夹的放置以及皮肤夹的放置。为确保手术成功并避免结果出现潜在偏差，可能需要对这些关键步骤进行如下改进。首先，在细胞悬液制备过程中，必须获得单细胞悬液并将其注射至半侧脾脏中。肿瘤细胞轻微聚集会阻塞脾脏血管，导致手术过程中动物过早死亡.......
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披露
作者无相关利益冲突需要披露。
致谢
KF 和 KO 与 KS 并列共同第一作者
本工作部分由 AHPBA 奖学金（K.S.）、NIH K23 CA148964-01（L.Z.）、约翰斯·霍普金斯医学院临床科学家奖（L.Z.）、Viragh 基金会和约翰斯·霍普金斯大学 Skip Viragh 胰腺癌中心（E.M.J. 和 L.Z.）、国家胰腺基金会（L.Z.）、Lefkofsky 家族基金会（L.Z.）、NCI 胃肠肿瘤 SPORE 项目 P50 CA062924（E.M.J.、L.Z.）、Lustgarten 基金会（L.Z.）以及 Sol Goldman 胰腺癌研究中心资助（K.S.、B.H.E.、L.Z.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养基及组分 | 根据细胞系不同而有所差异 | ||
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline） | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml 离心管 | Corning | 430052 | |
| 弯头手术剪 | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| 显微解剖 Graefe 镊 | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| 持针器（普通） | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 或 4-0 缝合线 | 由约翰斯·霍普金斯大学外科系提供 | ||
| Weck Horizon 开放式结扎夹施加器，小型，成角 | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon 开放式结扎夹施加器，中型，成角 | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon 中型结扎夹 | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon 小型结扎夹 | Teleflex | 001200 | |
| 注射器，1 cc，结核菌素注射器，3/8"滑动接头 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 注射器，1 cc，结核菌素注射器，5/8"滑动接头 | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm 自动结扎夹施加器 | Mikron | 427630 | |
| 9 mm 自动结扎夹 | Becton Dickinson | 427631 | |
| 加热垫 | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% 乙醇 | 由多家供应商提供 | ||
| 盐酸氯胺酮 | Hospira | 22395DD | |
| 盐酸赛拉嗪 | Sigma | X1251 |
参考文献
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. ....
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重印与许可
