通过半脾注射技术建立的肝转移瘤的临床前小鼠模型。
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摘要
摘要
已开发出多种小鼠模型用于研究人类癌症，并推动对癌症治疗和发病机制的理解。本文描述了一种临床前小鼠胰腺肿瘤肝转移模型，该模型通过将同源小鼠胰腺肿瘤细胞注射至半脾脏，从而建立肝转移。该模型模拟了肝转移性疾病患者中的多种临床状况。小鼠可稳定地在肝脏中形成转移灶，可用于转移过程的研究、实验性治疗的测试以及肿瘤免疫学的研究。
引言
胰腺导管腺癌（PDA）是美国癌症相关死亡的第四大原因1。转移性PDA患者的五年生存率为2-12%1。尽管目前胰腺癌的辅助化疗和新辅助化疗比以往更加有效，但仍迫切需要开发新的治疗方法。
新型治疗手段的开发需要可靠的临床前动物模型。尽管皮下肿瘤模型使用简便，但其缺点包括肿瘤无法转移，且不能模拟人类癌症中的肿瘤进展过程及微环境。基因工程小鼠模型，例如携带Kras和p53基因致癌性敲入突变的小鼠模型（KPC模型）2，以及带有YFP谱系示踪标记的KPC模型（PKCY模型）3，可在免疫功能健全的小鼠中研究自然发生的肿瘤。此外，该模型中的肿瘤微环境未被人为改变，更接近人类肿瘤的进展过程。然而，这些模型中肿瘤发生的时间具有变异性，使得实验性治疗的研究变得困难。此外，这些小鼠的回交过程需要耗费大量时间和资金，这在实际操作中并不总是可行。最后，移植型人源性胰腺导管腺癌（PDA）小鼠模型需要使用免疫缺陷小鼠，而这类小鼠的肿瘤微环境存在异常或缺失。因此，在这些临床前模型中显示出疗效的实验性治疗手段，往往在人类临床试验中无法重现其效果4。
该半脾切除小鼠模型利用Panc02肿瘤细胞，这是一种高度致瘤性的甲基胆蒽诱导的胰腺肿瘤细胞系，源自C57BL/6小鼠5,6。此外，也可使用源自KPC小鼠的其他小鼠PDA细胞系进行该模型实验。Schulick 等此前已开发出一种半脾切除技术，并建立了同基因小鼠结肠癌转移模型7。该半脾切除模型（图1）可在免疫功能健全的小鼠中实现稳定且均一的肿瘤接种，适用于新型治疗药物的研究7-10。
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方案
所有动物实验均遵循约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指导方针，动物饲养管理符合实验室动物护理评估与认证协会（AAALAC）的规范。 手术在符合无菌条件的手术室内进行，该手术室每小时至少进行十五次空气交换。所有器械在手术前均经高压灭菌处理，并在每只小鼠操作间隙使用70%乙醇再次消毒。所有预计无法存活至手术结束的小鼠，均在CO2环境中安乐死3分钟 ，随后在仍处于麻醉状态下进行颈椎脱位处死。
1. 细胞制备
- 将培养的 Panc02 细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，浓度为 2×107 个细胞/ml，并置于冰上保存。
2. 小鼠准备
- 将氯胺酮（100 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）混合后，分次对8-12周龄的C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射。
- 通过检查趾夹回缩反射是否消失，确认小鼠已完全麻醉。
- 根据需要追加注射氯胺酮（100 mg/kg）与赛拉嗪（10 mg/kg）的混合剂，以确保小鼠持续处于完全麻醉状态。
- 在小鼠眼部涂抹Puralube Vet眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
- 剃除手术区域的毛发，以避免伤口污染。
- 用70%乙醇对左侧肋下切口区域进行消毒，随后使用碘液处理。
- 在腹部周围放置手术巾，以维持无菌环境。
3. 开腹手术
- 使用手术刀沿左侧耳缘线在皮肤和腹膜上做左肋下切口。
- 通过在切口的头侧和尾侧同时施加手指压力，将脾脏从切口处挤出。
- 在脾脏下端定位脾血管。
- 将两个Horizon中号结扎夹置于脾脏中央，将脾脏离断，注意避免损伤脾极处的脾血管。
- 将脾脏上极放回腹腔内，以避免污染。
4. 肿瘤细胞注射
- 用26 G x 5/8”注射器吸取150 μl磷酸盐缓冲液。
- 将Panc02细胞（2 × 106）100 μl 吸入同一注射器中，在注射过程中始终保持注射器处于直立位置。
- 将针头浸入70%乙醇溶液中。 针头浸入70%乙醇是为了确保无菌。
- 缓慢将细胞注入暴露的半侧脾脏，注射过程中始终维持注射器直立。应通过脾包膜持续观察注射器斜面，以避免将细胞注入脾脏下方。注射时应观察到脾脏及血管出现发白现象。
- 抬起脾脏，并在脾脏下方放置一个中号Horizon夹，以阻断脾脏血管。
- 在胰腺和脾脏血管最远端放置一个小号Horizon夹。
- 在Horizon夹上方切断并结扎来自半侧脾脏的胰腺和脾脏血管。
- 将小鼠侧放，用蒸馏水冲洗切口。
5. 腹部关闭及麻醉后恢复
- 用4-0连续缝合线缝合腹膜。
- 使用两到三个皮肤夹闭合皮肤切口。
- 皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡或5-10 mg/kg的卡洛芬，以缓解术后疼痛。
- 将小鼠置于加热垫上恢复，直至其能够活动并表现出规律的呼吸模式。动物只有在完全从手术中恢复后才可放回与其他动物同居的环境中。
6. 尸体解剖检查及肝脏采集
- 术后30至60天内，小鼠将开始出现转移的临床症状，需实施安乐死。提示转移性疾病并需实施人道安乐死的体征包括腹部膨大和腹水形成。通过吸入CO₂对小鼠实施安乐死。2.
- 吸入麻醉后，实施颈椎脱位处死。
- 在确认动物无反应后，使用剪刀剪开腹膜以暴露腹腔。
- 使用镊子和剪刀，小心地将肝脏从腹腔中剪下。
- 将肝脏置于OCT包埋剂中，使用液氮速冻。在-80°C下保存肝脏。或者，可在室温下用16%中性缓冲甲醛固定肝脏 24 小时，石蜡 嵌入的
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结果
将Panc02肿瘤细胞注射至半侧脾脏（图1）后，100%的小鼠会形成肝转移灶，而若操作正确，则不会观察到肺部或腹膜转移。该技术已使用Panc02细胞在多个独立实验中对超过一百只小鼠进行操作，结果具有一致性：所有未经治疗的小鼠均在半脾切除术后30至60天内因肝转移而死亡（图2）。为了在未治疗组与治疗组之间获得统计学显著性差异，每组需要十只小鼠。然而，所需动物数量会因所使用的细胞系和治疗方案的不同而有所变化。在此模型中使用Panc02细胞时，可在尸检时观察到多个肝转移灶（图3）。
KPC 肿瘤细胞是一种来源于转基因小鼠的同源性胰腺肿瘤细胞系，这些小鼠具有组织特异性的 Kras 和 p53 基因敲入突变11，也可用于本模型。使用这些细胞可产生类似的肝转移灶（图4）。然而，在采用不同细胞系评估肝转移形成时，应逐步优化注射细胞数量，直至所有未处理小鼠均出现肝转移。Panc02 细胞可作为阳性对照，以确认手术操作正确无误。重要的是，尽管肝...
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讨论
通过脾血注射技术建立的这种胰腺癌肝转移小鼠临床前模型，是首个能够模拟肝转移性疾病患者多种临床和免疫学特征的模型。该模型相较于其他小鼠模型具有多项优势。首先，与转基因胰腺癌模型相比，本模型可实现100%小鼠在相同时间点稳定发生肝转移，而传统转基因模型仅有30%的小鼠出现肝转移，且转移发生时间差异较大，因此本模型使研究人员能够在高度可重复的条件下研究转移性疾病。此外，该模型保留了未受干预的脾脏，从而可在可重复的体系中进行外周血免疫分析。再者，在不使用抗肿瘤治疗的情况下，小鼠会因肿瘤进展而在相对一致的时间点死亡，且不同实验间的生存曲线高度一致。最后，该模型具有多种应用价值，包括肝转移研究13、肿瘤免疫学研究10以及实验性治疗测试9。
该技术的关键步骤包括细胞悬液制备、肿瘤细胞注射、Horizon止血夹的放置以及皮肤夹的放置。为确保手术成功并避免结果出现潜在偏差，可能需要对这些关键步骤进行如下改进。首先，在细胞悬液制备过程中，必须获得单细胞悬液并将其注射至半侧脾脏中。肿瘤细胞轻微聚集会阻塞脾脏血管，导致手术过程中动物过早死亡...
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披露
作者无相关利益冲突需要披露。
致谢
KF 和 KO 与 KS 并列共同第一作者
本工作部分由 AHPBA 奖学金（K.S.）、NIH K23 CA148964-01（L.Z.）、约翰斯·霍普金斯医学院临床科学家奖（L.Z.）、Viragh 基金会和约翰斯·霍普金斯大学 Skip Viragh 胰腺癌中心（E.M.J. 和 L.Z.）、国家胰腺基金会（L.Z.）、Lefkofsky 家族基金会（L.Z.）、NCI 胃肠肿瘤 SPORE 项目 P50 CA062924（E.M.J.、L.Z.）、Lustgarten 基金会（L.Z.）以及 Sol Goldman 胰腺癌研究中心资助（K.S.、B.H.E.、L.Z.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养基及组分 | 根据细胞系不同而有所差异 | ||
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline） | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml 离心管 | Corning | 430052 | |
| 弯头手术剪 | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| 显微解剖 Graefe 镊 | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| 持针器（普通） | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 或 4-0 缝合线 | 由约翰斯·霍普金斯大学外科系提供 | ||
| Weck Horizon 开放式结扎夹施加器，小型，成角 | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon 开放式结扎夹施加器，中型，成角 | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon 中型结扎夹 | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon 小型结扎夹 | Teleflex | 001200 | |
| 注射器，1 cc，结核菌素注射器，3/8"滑动接头 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 注射器，1 cc，结核菌素注射器，5/8"滑动接头 | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm 自动结扎夹施加器 | Mikron | 427630 | |
| 9 mm 自动结扎夹 | Becton Dickinson | 427631 | |
| 加热垫 | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% 乙醇 | 由多家供应商提供 | ||
| 盐酸氯胺酮 | Hospira | 22395DD | |
| 盐酸赛拉嗪 | Sigma | X1251 |
参考文献
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
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- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
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