Abstract
Роман поиска биомаркеров играет решающую роль в обеспечении более чувствительным и специфичным обнаружению болезни. К сожалению, многие низкой численности биомаркеров, которые существуют в биологических жидкостях, не могут быть легко обнаружены с масс-спектрометрией или иммунологических, потому что они присутствуют в очень низкой концентрации, лабильны, и часто замаскированных высокой численности белки, такие как альбумин или иммуноглобулин. Приманка, содержащий поли (N-изопропилакриламид) (NIPAm) наночастицы на основе способны преодолеть эти физиологические барьеры. В одном шаге они способны захватить, сосредоточиться и сохранить биомаркеров из жидкостей организма. Низкомолекулярные анализируемые вес введите ядро наночастицы и захвачены различных органических химических красителей, которые действуют как высокоаффинные белковых приманок. Наночастицы способны концентрировать белки интересов на несколько порядков. Этот коэффициент концентрации достаточно, чтобы повысить уровень белка таким образом, что белки находятся в пределахПредел обнаружения текущих масс-спектрометров, вестерн-блоттинга и иммунологических. Наночастицы могут быть инкубировали с множеством биологических жидкостях, и они способны значительно обогатить концентрацию белков и пептидов с низкой молекулярной массой, исключая альбумин и другие белки с высоким молекулярным весом. Наши данные показывают, что 10000 раз усиление в концентрации конкретного анализируемого вещества может быть достигнуто, позволяя масс-спектрометрии и иммунологические анализы для обнаружения ранее неопределяемый биомаркеров.
Introduction
Несмотря на завершение в ДНК генома человека, значительный прогресс не был достигнут в идентификации биомаркеров, прогнозирования ранних стадиях заболевания, или, что коррелирует с терапевтического результата, или прогноза 1. Одной из причин такого отсутствия прогресса в том, что многие потенциально значительные биомаркеры существуют в концентрации ниже предела обнаружения обычной масс-спектрометрии и других платформ поиска биомаркеров. Масс-спектрометрия (МС) и множественный Мониторинг реакции (МРМ) имеют чувствительность обнаружения обычно больше, чем 50 нг / мл, а большинство анализируемых веществ измеряется с помощью иммуноанализа в клинической лаборатории падения в пределах от 50 пг / мл и 10 нг / мл . Это означает, что многие биомаркеры, особенно в начальной стадии болезни, не могут быть обнаружены с помощью обычного МС и MRM 2. Кроме того наличие высокого обилия белков, таких как альбумин и иммуноглобулин в сложных биологических жидкостей часто маскируют путем млрд раза отлESS низкой численности, низкомолекулярные белки и пептиды 3, 4. По этой причине несколько образцов подготовительные шаги необходимо перед масс-спектрометрии секвенирования и идентификации. Одним из таких подготовительным шагом использует истощение высокого обилия белков с коммерчески доступных истощения столбцов 5-8. К сожалению, этот шаг приводит к снижению выхода кандидатов биомаркеров, потому что они часто не ковалентно связаны с белками-носителями, которые удаляются. Еще одна проблема представлена стабильности кандидатов биомаркеров экс-Vivo после того, как образцы собираются. Белки подвержены деградации эндогенных или экзогенных протеаз 9. Гидрогелевые наночастицы могут преодолеть эти критические проблемы путем амплификации предполагаемого концентрацию биомаркеров до уровня в интервале анализа, при одновременной защите от деградации белка 10-13.
Важно отметить йна LMW белков в крови представляют собой смесь мелких интактных белков, а также фрагменты больших белков. Тканевые происхождения белки больше, чем 60 кДа слишком велики, чтобы пассивно проникать в кровеносную систему через базальную мембрану сосудов, но они могут быть представлены в кровь в виде пептидов или белковых фрагментов 14. Наша цель заключается в измерении новых циркулирующих биомаркеров, которые могут быть кандидатами для раннего выявления заболевания, стратификации пациентов для терапии, и мониторинга ответа на терапию. Наши наночастицы создаются, чтобы выборочно исключить высокое содержание иммуноглобулины и альбумин, в то же время захвата меньшие белки и пептиды, и их концентрации до 100-кратного в зависимости от исходного объема.
Наша группа определила набор небольших органических красителей, которые могут успешно действовать как высокоаффинные молекулярные приманки для белков и пептидов. Белок-краситель связывания, как полагают, обусловлено сочетанием гидрофобных и электростатическим взаимодействиемс. Ароматические кольца на красителе чередовать с белками через гидрофобных карманов на поверхности белка 11.
Приманки, в зависимости от их химии, показывают особое сродство для выбранных классов веществ. Приманки конкурировать с белками-носителями, такими как альбумин, для белков или пептидов. В низкомолекулярные белки / пептиды в ловушку частицы. С высокой молекулярной массой белки, такие как альбумин и иммуноглобулина предотвратить попадание частицы в связи с возможностью просеивания в связи с ограничительной поры гидрогеля 11 (рисунок 1).
Гидрогелевые наночастицы синтезируют полимеризацией, инициированной осадков персульфата аммония 11. N-изопропилакриламид (NIPAm), со-мономеров акриловой кислоты (AAC) и аллиламина (АА) и сшивающего агента N, N'-метиленбисакриламид (BIS) подвергают взаимодействию при 70 ° С в течение 6 ч в разбавленных условиях 11, 13. Связывание с высоким содержанием белка сродство поли (N-изопропилакриламид-CO-акриловой кислоты) (поли (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis достигнуто путем ковалентного включающий аминокислоты, содержащие красители (т.е.., Sulfonatedanthraquinonetriazine красители) в наночастицах с помощью амидирование реакцию проводят в водных или органических растворителей в зависимости от гидрофильных / гидрофобных характеристик красителей 11, 13. нуклеофильного замещения аминогрупп в наночастицы с атомом хлорида из anthraquinonetriazine красителя используется для создания красителей, содержащих поли (NIPAm оо-Аллиламин) (AA) наночастиц 11, 12. процесс двухступенчатый полимеризации используется для создания гидрогеля наночастицы, содержащие внешнюю оболочку винилсульфокислота (VSA) 11, 13.
Гидрогелевые наночастицы могут быть применены в различных биологических жидкостей, в том числе цельной крови, плазмы, сыворотки, цереброспинальной жидкости, пота, мочи и. В один шаг, в растворе, нanoparticles выполнить быстрое (в течение минут) улавливание и концентрации с низкой молекулярной массой аналиты 10, 11, 13, 15-18. Белки затем элюируют из наночастиц, и обнаружить с помощью Вестерн-блоттинга 19-21, масс-спектрометрии 10, 11, 13, 15, 18, 22, 23, иммунологические / ELISA, 10, 11, 15, 18, или с обращенной фазой белок микрочипов 16, 24 анализы. Наночастицы функционализирован химической приманки, и представления основной или архитектуру ядра оболочки, захват и сосредоточиться белки, основанные на свойствах физико приманки / оболочка. Поэтому различные красители, использовавшиеся для наночастиц будет фиксировать различные подмножества белков с различной эффективностью на основе близости красителя, рН раствора, и наличие / отсутствие конкурирующих высокие-изобилии белки 13. Кроме того, количество наночастиц по отношению к объему раствора влияет на выход белка из наночастиц. Эти аспектыГидрогель заготовки наночастиц продемонстрированы с использованием трех различных приманок наночастиц для уборки белков из образцов плазмы, которые содержат большое количество белка, и от образцов мочи, которые обычно не содержат большое количество белка. В этом протоколе мы продемонстрировать сбор и концентрации фактора некроза опухолей альфа (ФНО) из образцов плазмы с использованием поли (NIPAm-CO-AAC), поли (NIPAm / краситель), и наночастицы core- оболочки (поли (NIPAm-CO-VSA)) . Поли (NIPAm / краситель) наночастицы показано сосредоточиться Mycobacterium видовой антиген, который был добавлен в образцах мочи человека, чтобы имитировать микобактерий туберкулеза инфицированных людей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Плазма человека и мочу собирали здоровых доноров-добровольцев, с письменного информированного согласия, следующие Университет Джорджа Мейсона Экспертный совет утвердил протоколы. Доноры были поровну распределены между кавказскими мужчинами и женщинами в возрасте от 25 и 42-образцы были проанализированы по отдельности, а не были объединены.
1 наночастиц Обработка сыворотки или плазмы
Потенциальные низкие обильные биомаркеров в плазме захвачены, в растворе, с наночастицами гидрогеля. Частицы добавляют к плазме, инкубируют, отделяют центрифугированием, промывают и захваченного белки элюируют. Элюированные белки сушили в потоке азота на выходе масс-спектрометрии и идентификации последовательности.
- Развести 500 мкл сыворотки 1: 2 50 мМ Трис HCl рН 7 (500 мкл сыворотки + 500 мкл TrisHCl) в микроцентрифужных трубки.
- Добавить 500 мкл поли (NIPAm / AAC) основной nanopстатьи. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Спин образца при 16100 х г, 25 ° С в течение 10 мин в центрифуге, снабженной фиксированным углом ротора. Снимите и выбросьте супернатант.
- Добавить 500 мкл тиоцианат натрия (25 мм) к осадку. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз.
- Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и выбросьте супернатант.
- Добавить 500 мкл воды MilliQ в наночастиц гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз.
- Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и выбросьте супернатант.
- Подготовка свежего буфера элюции: Добавить 700 мкл ацетонитрила до 300 мкл гидроксида аммония в чистую пробирку. Внимание: гидроксид аммония вызывает коррозию. Используйте с соответствующим вентиляции. Примечание: Буфер для элюирования должны быть подготовительныеAred непосредственно перед использованием. Не храните буфер элюирования.
- Добавить 300 мкл буфера для элюции с наночастицами гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Спин образца при 16100 х г, 25 ° C в течение 10 мин в центрифуге с ротором с фиксированным углом. Снимите и сохраните элюата в чистом, с надписью микроцентрифужных трубки.
- Повторите шаги 1,9 - 1,10. Объедините две элюаты в одну пробирку микроцентрифуги.
- Сушат элюата в токе азота в азот испарителя коллектора на 42,1 ° С, с потоком воздуха, установленным в 8 (рис 2F).
- Храните сушеные элюата при комнатной температуре в течение O / N хранения, или при -20 ° С в течение длительного хранения, до масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга, или ИФА (по желанию).
2 наночастиц Обработка проб мочи
Нормальная моча содержит менее 30 мг / дл и белокменьше 1 + крови. Тем не менее, многие болезни / условия могут изменить нормальные уровни белка в моче и крови. Для помощи в определении оптимального объема наночастиц для добавления в образце мочи, анализ мочи выполняется до наночастиц уборки. Моча биомаркеры могут существовать в чрезвычайно низких концентрациях, что может потребовать оптимизации соотношение количества наночастиц в объеме мочи. Эта процедура описывает наночастиц сбор образцов мочи для последующего Вестерн-блоттинга.
- Сбор образцов мочи в чистую, сухую пластиковую чашку. 22 мл Минимальный объем требуется. Магазин мочи не образцы при -80 ° С до готовности проанализировать.
- Разморозить замороженные мочи при комнатной температуре или при температуре 4 ° CO / N. Кратко Смешайте на вортексе. Налейте по крайней мере, 22 мл мочи в 50 мл коническую полипропиленовую пробирку нижней.
- Спин мочу в центрифуге с поворотно-откидной ротор в 3700 мкг в течение 15 мин. Слейте мочу, не нарушая гранул, в чистую 50 мл коническим днищем polypropylene трубки. Откажитесь от осадка.
- Выполните анализ мочи с помощью мульти-аналита "анализ мочи" Реагент полосу с. Примечание: хранить индикаторных полосок в плотно закрытом контейнере, вдали от прямых солнечных лучей и влаги 17, 18.
- Положите реагент полосы, лицевой стороной вверх, на чистой, сухой бумажной салфеткой.
- С помощью одноразового пипетки для аспирации 1 мл мочи, полученного на стадии 2.3.
- Установите таймер на 2 мин, но не запускайте его. Быстро обойтись 1 - 2 капли мочи на каждой тестовой площадки полосы реагента. Сразу запустить таймер. Примечание: Не погружайте полоску реагента непосредственно в контейнере мочи. Краситель / химические показатели в полосе реагента может потенциально вымываться из полосы с реагентом в контейнер мочи.
- В то время, указанному на упаковке реагента полосы, записывать качественные результаты для различных аналитов на полосе реагента путем сравнения цвета отдельных полос реагентов с соответствующим цветовым кодированием Индикаров на контейнер реагента. Типичные нормальные результаты мочи: (нормальный или отрицательный) для крови, белка, лейкоцитов, нитрита, глюкозы и кетонов, билирубина, и уробилиногена; РН мочи (5,5 - 7,0); удельный вес (1,001 - 1,020). Примечание: Высокие уровни белка в образце мочи может конкурировать с представляющим интерес белком за сайты связывания на наночастицах. Чтобы максимизировать сбор белка с наночастицами, объем наночастиц / соотношение объем мочи может быть настроен на любой предельной конкуренции со стороны высоких белков численности или могут быть оптимизированы для сбора белки, которые существуют в очень низких концентрациях. Если значение белка в моче является 1+ или больше, добавить 2x объемы наночастиц в шаге 2.5 ниже. Если интерес аналита является очень низким распространенный белок, может быть необходимо увеличить объем наночастиц до 2 мл (фигура 3).
- Передача 20 мл осветленной мочи, полученного на стадии 2.3 в чистую 50 мл коническую полипропиленовую пробирку нижней. Ненарушить любой мусор / осадок, который может быть в нижней части трубки мочи. Добавить 200 мкл наночастиц в образце 20 мл мочи. Кратко Смешайте на вортексе. Примечание: Если значение белка в моче является 1 + или выше, добавляют 400 мкл наночастиц в 20 мл мочи.
- Инкубируйте мочи / наночастиц смесь в течение 30 мин при комнатной температуре, без раскачивания / перемешивания.
- Крутить мочи / суспензии наночастиц в центрифуге, снабженной колебательного ротора на 3700 мкг в течение 10 мин. Примечание: Если гранулы не видно После центрифугирования вращаться образцы в течение дополнительных 2 - 7 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант. Добавить 500 мкл MilliQ воды в осадке наночастиц.
- Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Перенесите раствор наночастиц в чистую 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Спин наночастиц в центрифуге, снабженной фиксированным углом ротора при 16100 х г в течение 10 мин. Примечание: Если осадок не видно Фольмычание центрифугирования, спина образцы для дополнительного 2 - 7 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант.
- Повторите шаги 2.8 и 2.11 (в два раза) с 200 мкл 18 MilliQ воды, чтобы вымыть наночастиц.
- Подготовка свежего буфера элюции: Добавить 970 мкл ацетонитрила до 30 мкл гидроксида аммония в чистую пробирку. Внимание: гидроксид аммония вызывает коррозию. Используйте с соответствующим вентиляции. Примечание: элюирующий буфер должен быть подготовлен непосредственно перед использованием. Не храните буфер элюирования.
- Добавить 20 мкл буфера для элюции с наночастицами гранул. Ресуспендируют наночастиц путем интенсивного пипетированием вверх и вниз несколько раз. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Вращайте образцы наночастиц на 16100 мкг в течение 10 мин. Снимите и сохраните супернатант в чистую, 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Не нарушить наночастиц осадок. Откажитесь от осадка в биологической мусор.
- Поместите образцы в стойку в химическом вытяжном шкафу. Откройте крышки и вклUbate при комнатной температуре в течение 30 мин. С другой стороны, не размещать образцы в токе азота при 40 ° С до сухого (1 - 2 часа).
- Добавить 15 мкл Трис-глицин SDS буфера для образцов (2x) к образцам. Тепло в 100 не ° С в сухом тепла блока в течение 5 мин с открытыми крышками или пока объем левой в трубке не более 20 мкл. Примечание: не используйте кипящей водяной бане. Влажность из водяной бани предотвращает испарение буфера.
- Поместите крышку на трубах. Удалить труб из теплового блока. Образец можно хранить при -80 ° С или использовать непосредственно для последующего Вестерн-блот-анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гидрогель наночастиц Размер и Единообразие
Поли (NIPAm-AAC) частицы были произведены с чрезвычайно высоким выходом и воспроизводимости между странами и внутри партий. Частицы имеют очень хорошую коллоидную стабильность при комнатной температуре в течение времени, необходимого для захвата, хранения и элюирования белков (по крайней мере, 48 ч), и наночастиц осадков не наблюдалось (рисунок 1) 11. Коллоидной стабильности может быть очень важным для быстрого поглощения белка / пептида наночастицами.
Потенциальные низкой численности биомаркеры Собранные из плазмы
Включение приманки красителя приводит в действие поглощение молекул в растворе, и гарантирует, что захваченные молекулы сохранили от деградации 13, 15, 18, 25. По этой причине ингибиторы протеазы не требуется во время выборки предварительной обработки. Этот атрибут из наночастиц делает их SUITable как технология сохранения для сбора проб в поле и для отгрузки биологических жидкостей при комнатной температуре.
Молекула приманки могут быть включены в гидрогеле частицы путем сополимеризации или ковалентного связывания с функциональными группами, присутствующими в наночастицы. В качестве примера, поли (NIPAm-CO-AAC) наночастицы были построены с аминокислотами, содержащий красителей через нулевую длину реакций сшивания амидирования, в то время как наночастицы с внешней оболочкой, содержащей кислоту (VSA) сополимер винилсульфоновой были созданы с помощью второй реакции полимеризации 10-13. Различные типы наночастиц могут быть получены путем включения различный химический краситель в наночастицы, и, таким образом, повысить извлечение конкретных классов белков. Важной концепцией нашей технологии является то, что различные приманки могут показать преимущественное сродство к различных белков, так как взаимодействие красителя белка зависит в основном от комбинации гидрофобных взаимодействий, 3-D Interacния, и электростатические силы. Мы заметили, что некоторые анализируемые могут быть захвачены с высоким сродством по химически различных красителей из-за сложности сил связи. Смотреть Tamburro др. Для широкого объяснения и примеры этого принципа 13. Например, четыре различных типа захвата приманки (наночастиц) были использованы для сбора ФНО из плазмы с использованием 200 мкл частиц и 200 мкл плазмы для каждого типа наночастицы. Во всех случаях после обработки наночастиц, TNF не было обнаружено в надосадочной жидкости с помощью SDS-PAGE с окрашиванием серебром, в то время как ФНО был обнаружен в виде наночастиц элюата (рисунок 1С). (Полоса 1 = рекомбинантный ФНО (МВт 17000 Да), Дорожки 2 и 3, 4 и 5, 6 и 7 и 8 и 9 представляют результаты для четырех различных типов наночастиц приманок соответственно; С = контроль, S = супернатант, Р = наночастиц элюат).
Доза-ответ для рааренду Виды N anoparticles
Для того чтобы выполнить калибровочной кривой, и, таким образом, оценить выход и точность, эксперименты должны быть выполнены с шипами-белками с известной концентрацией. Опубликованные результаты для различных жидкостей и анализируемых продемонстрировать, как наночастицы предварительной обработки сохраняет линейность анализа и устанавливает калибровочной кривой при обеспечении большей эффективной предел обнаружения 10, 16, 26. Мы также опубликовали исследования между-лаборатории точностью используя наночастицы провести мульти-реакцию мониторинга масс-спектрометрии с повышенной чувствительностью 27.
Для сравнения IL-17 эффективность уборки с помощью различных типов наночастиц, рекомбинантный ИЛ-17 (17,5 кДа) был добавлен в образцах плазмы, в которой либо поли (NIPAm-CO-AAC) или поли (NIPAm-CO-VSA) наночастицы были затем добавлены . Два комплекта из четырех последовательных разведений 100 нг рекомбинантного IL-17 были подготовлены в 10081; л плазмы (100 нг / 100 мкл, 50 нг / 100 мкл, 25 нг / 100 мкл и 12,5 нг / 100 мкл). поли (NIPAm-CO-AAC) или поли (NIPAm-CO-VSA) частицы были добавлены в соответствующих образцах плазмы в соотношении 1: (объем / объем) 1 частиц: соотношение плазмы. Спектрофотометрический анализ общего белка проводили на образцах надосадочной жидкости. Вестерн-блоттинга с анти-кролик поликлональных IL-17 был выполнен на 20 мкг плазмы супернатанта (S) после сбора урожая наночастиц и наночастиц элюатов (P) (рисунок 4). Оба типа наночастиц надлежащим образом собирают и концентрируют IL-17 в каждом разведении. Дополнительные полосы на вестерн-блот представляют человеческий сывороточный альбумин и иммуноглобулин, которые перекрестно реагируют с вторичным антителом. (AAC частицы: дорожки 1 и 2 = 1 нг / мкл IL-17, переулки 3 и 4 = 0,50 нг / мкл, дорожки 5 и 6 = 0,25 нг / мкл, Дорожки 7 & 8 = 0,125 нг / мкл, Lane 9 = Ил-17; VSA частицы: Дорожки 1 и 2 = 1 нг / мкл IL-17, полосы 3 и 4 = 0,50 нг / мкл,Дорожки 5 и 6 = 0,25 нг / мкл, Дорожки 7 & 8 = 0,125 нг / мкл).
Обнаружение потенциально Диагностические белков в моче
Образцы мочи человека, полученные от здоровых доноров-добровольцев с письменного информированного согласия, вносили рекомбинантным антигеном Mycobacterium видов начале Секреторные Целевая микобактерий туберкулеза белок (ESAT-6), чтобы имитировать микобактерий туберкулеза инфицированных. 1 мкг каждого из ESAT-6 (15 кДа) и IL-2 (15,5 кДа) были добавлены к 1 мл аликвоты мочи человека, полученных от здоровых доноров-добровольцев. Общий анализ мочи проводили на образцах с полосой мочи реагента для определения оптимального соотношения наночастиц в моче, который был основан на наличии / отсутствии мочевых белков. Поли (NIPAm / краситель) наночастицы были использованы для сбора белки из обработанных и необработанных образцов мочи. Электрофорез Одномерный гель из наночастиц элюата осуществляли Followed окрашиванием серебром. Образцы в U4 и U6 полос представляют наночастиц элюаты от ESAT-6 и IL-2, обработанных образцов мочи, ясно показывая, видные полосы при 15 кДа (рисунок 5). Масс-спектрометрия элюатах выявленных ESAT-6 (UniProt вступление POA567, 84,0 покрытия, 9 пептиды) и IL-2 (UniProt вступления P60568, 38.56 покрытия, 3 пептиды). Моча без наночастиц уборки показано в переулке с надписью "Raw".
Рисунок урожай 1. Наночастицы и сконцентрироваться низкие белки изобилия из сложных биологических жидкостей. () Workflow для белков уборки. Общее время обработки составляет примерно 1,5 часа. Белки в растворе сконцентрированы из крови, сыворотки, плазмы, мочи, пота, слюны или других жидкостей организма (1000-кратную концентрацию изображен). (В)Пакетный к сравнению пакетном показывающий однородный размер наночастиц. Атомно-силовая микроскопия на слюде показывает однородность размера (диаметр 0,7 мкм) и отсутствие слипания в две партии наночастиц. Гель-электрофорез (С) 1-Г, с последующим окрашиванием серебром, фактора некроза опухоли альфа (TNF-alpha) поглощенных из плазмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 наночастиц процедура заготовки из плазмы / сыворотки для нисходящего масс-спектрометрического анализа. (A) Наночастицы по-прежнему суспендируют в растворе (поли (NIPAm / краситель) показаны). (B) Наночастицы будут добавлены в разбавленного образца плазмы. (С) наночастиц в плазме подвеска яы центрифугировали в центрифуге для отделения наночастиц из супернатанта. (D) Сообщение центрифугирование, наночастицы образуют отчетливую осадок в нижней части трубы. (Е) После промывки наночастицы, элюат, содержащий собранные белки удаляется и сохраняется . ниже по течению анализа (F) Элюат сушат в токе азота в испарителе при 42,1 ° C, расход воздуха 8, для 1 -. 2 часа до масс-спектрометрии Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Общий анализ мочи с помощью нескольких анализируемых реагентов полоски для контроля качества образцов. (А) Каждая площадка на полосе реагента пропитывают химические вещества, ферменты и / или индикаторных красителей, которые реагируют с отличаютсяENT аналита мочи (например,., глюкоза, билирубин, кетоны, удельный вес, кровь, рН, белок, уробилиноген, нитрит и / или лейкоцитарной эстеразы). Моча осветляли центрифугированием. Капля мочи добавляется к каждому площадку на полосе реагента. (B) Цвет каждой площадки сравнивается визуально на цветных блоков на контейнер, в указанное время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Уборочная Ил-17 из плазмы с помощью ядра (AAC) или ядро-оболочка (VSA) наночастиц. Гель-электрофорез 1-D и вестерн-блоттинга с анти-IL-17 демонстрирует способность акриловой кислоты (AAC) и VSA наночастиц ядро оболочки на заготовку различные Concentrations ИЛ-17 от плазмы. (S = супернатант после наночастиц уборки, P = наночастиц элюат AAC частицы:. Полос 1 и 2 = 1 нг / мкл IL-17, полосы 3 и 4 = 0,50 нг / мкл, дорожки 5 и 6 = 0.25ng / мкл, переулки 7 и 8 = 0,125 нг / мкл, Lane 9 = Ил-17; VSA частицы: Дорожки 1 и 2 = 1 нг / мкл IL-17, полосы 3 и 4 = 0,50 нг / мкл, дорожки 5 и 6 = 0,25 нг / мкл, Дорожки 7 & 8 = 0,125 нг / мкл) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Восстановление микобактерии туберкулеза антигена и цитокинов IL-2 из мочи с использованием гидрогеля наночастиц. Окрашивание серебром следующие 1-D гэль электрофорез образцов мочи. Образцы в полосах U4 и U6 представляют элюаты из образцов мочи, содержащих рекомбинантный ESAT-6 и ИЛ-2, ясно показывая, известные полосы при 15 кДа. Масс-спектрометрия элюатах выявленных ESAT-6 (UniProt вступление POA567, 84,0 покрытия, 9 пептиды) и IL-2 (UniProt вступления P60568, 38.56 покрытия, 3 пептиды). (RAW = мочи без наночастиц уборки; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = мочи хватает рекомбинантного ESAT-6 и IL-2 следующий сбор наночастиц). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Имя Белок | Число белок Г.И. | Концентрация в сыворотке / плазме [нг / мл] | Ссылка |
| ABL-Interactor 1 изоформы | 61743942 | Неизвестный | |
| AMP-активированной протеинкиназы gamma2 субъединицы изоформы | 33186925 | Неизвестный | |
| Cas-Br-М (мышиный) экотропного ретровирусная преобразование последовательности | 52426745 | Неизвестный | |
| хемокинового (CC мотив) лиганда 18 (легочная и активации регулированием) | 4506831 | 30 | 34 |
| хемокинового (CC мотив) лиганд 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Неизвестный | |
| хромосома 16 открытых рамки считывания 80 | 8392875 | Неизвестный | |
| Consortin | 213021160 | Неизвестный | |
| дефензин, альфа-4-, corticostatin | 4503303 | Неизвестный | |
| 20149675 | Неизвестный | ||
| гликопротеин Ib (тромбоцитов), бета-полипептидная | 4504073 | Неизвестный | |
| гуанин нуклеотид связывающий белок (G белка), д полипептид | 40254462 | Неизвестный | |
| Гепараназы | 148746204 | Неизвестный | |
| инсулиноподобный фактор роста 2 (соматомедин) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Неизвестный | |
| лейкоцитов клеток, полученных chemotaxin 2 | 59806345 | 200000 | 33 |
| lipocalin 2 (онкоген 24p3) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglyceride липаза, изоформы CRA_b | 6005786 | Неизвестный | |
| N-этилмалеимид чувствительных белков привязанность фактором, Альф | 47933379 | Неизвестный | |
| один разрез гомеобокс 2 | 119220564 | Неизвестный | |
| Внешний плотным слоем спермы хвосты 4 | 171184433 | Неизвестный | |
| Вкус, легких и носовой эпителий связано | 18765705 | Неизвестный | |
| пептидогликан белок признание 2 | 156616294 | Неизвестный | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Белок CASC3 | 15721939 | Неизвестный | |
| RAB27B, академик РАН онкоген семью | 5729997 | Неизвестный | |
| Рас ассоциации (RalGDS / AF-6) семейные домена 6 изоформы | 29789443 | Неизвестный | |
| РАН, связанных с ГТФ-связывающего белка RAB10 | 33695095 Неизвестный | ||
| безымянный палец белка 166 | 30520320 | Неизвестный | |
| ответ сыворотки лишение (фосфатидилсерин связывающий белок) | 4759082 | Неизвестный | |
| растворенного вещества семья носитель 33 (ацетил-КоА транспортер), член 1 | 4757708 | Неизвестный | |
| ST6 бета-galactosamide альфа-2,6-sialyltranferase 1 изоформы | 27765091 | 15 | 32 |
| тимозиновый-как 3 | 34013530 | Неизвестный | |
| трансдуцин-как усилитель раскола 3 (E (sp135) гомолог Drosophila) | 157384982 | Неизвестный | |
| трансглутаминаза 1 | 4507475 | Неизвестный | |
| WD повторите домена 1 | 9257257 | Неизвестный | |
| WD повторите домена 91 | 222080092 | PX; "> Unknown||
| синь актин-связывающие повторения, содержащий 2 | 119372317 | Неизвестный |
Таблица 1 Пример низкой численности белки собирают наночастицами из сыворотки / плазмы. (PeptideAtlas peptidome масс-спектрометрии) 28-34 Адаптированный со ссылкой permissionfrom 13 (Tamburro, Д. и соавт Многофункциональные наночастицы ядро-оболочка:... Открытие ранее невидимых биомаркеров J Am Chem Soc, 133, 19178-19188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клиническое значение
Сыворотки или плазмы, как полагают, содержат низким изобилие циркулирующей белки и пептиды, которые могут обеспечить богатый источник информации о состоянии организма в целом. Несмотря на обещание сыворотки протеомики, существуют три основных и серьезных физиологические барьеры сорвать открытие биомаркеров и перевод в клинической пользы 10, 11, 16, 25.
1. важных диагностических биомаркеров могут существовать в чрезвычайно низких избытке (концентрации) в крови. Ранняя стадия пораженная ткань, например, предварительно метастатических поражений раком, может составлять меньше нескольких миллиметров 3. Биологические маркеры навес в обращении с таким малым объемом ткани станут сильно разбавленной во всем объеме крови. Соответствующие анализируемые может существовать ниже пределов обнаружения масс-спектрометрии и обычных иммунологических.
2. низкой численности биомаркеры /белки маскируется присутствии высоких обильных белков, таких как альбумин и иммуноглобулин, которые представляют до 90% от плазменной протеом 14.
3. Белки и пептиды чувствительны к деградации эндогенных и экзогенных протеиназ следующие вены и образца транспортировке / хранении. Деградации белка может привести к ложным положительным или ложных отрицательных результатов 35.
Наночастицы гидрогеля были разработаны как пористые, плавучие, полимеры, содержащие anthraquinonetriazine красители и / или оболочек винилсульфокислота для белка и пептида уборки и сохранения в теле жидкостей 11, 13. Наша группа синтезированы и испытаны гидрогелевые наночастицы функциональными с множеством органических красителей (т.е.. , сульфированные и не sulfonatedanthraquinonetriazine красители) и показал льготные сродство к нескольким белка аналиты 11, 13. Мы также разработали протоколы для поиска биомаркеров, которые используютгидрогелевые наночастицы с лимфой, слюны, спинномозговой жидкости, пота, мочи, плазмы, крови, сыворотке или образцов 11, 13, 23, 24, 26.
Оптимизация параметров наночастиц уборки До белков уборочных из драгоценных клиническая / исследовательских образцов необходимо для идеальных результатов. Количество белка в образцах должны быть количественно определить оптимальное соотношение наночастиц к объему образца. Для аналитов неизвестной концентрации, кривую доза-реакция, используя рекомбинантные белки содержатся сведения, касающиеся пределов обнаружения. Если имеется достаточно образца, различные типы наночастиц могут быть использованы для определения оптимального наночастиц для анализируемого вещества и образца.
Общий анализ мочи до наночастиц уборки обеспечивает проверку контроля качества образцов мочи. Сродство приманки наночастиц красителя зависит от изоэлектрической точки белка, представляющего интерес, и рН окружающей среды. РН мочи бытьтвин 5.5 и 7.0 является оптимальным для уборки белка с поли (NIPAm / окраска) наночастиц. Наличие гемолизированных или интактных эритроцитов (1 + в крови на полоску с реагентом) не мешает наночастиц уборки.
В этом протоколе мы сосредоточились на применении наночастиц гидрогеля чтобы собрать белки из плазме и моче. Будущие приложения могут содержать другие жидкости организма, такие как стекловидное тело глаза, или синовиальной жидкости. Потенциал в естественных условиях применения можно представить на будущее, в котором наночастицы вводятся в пораженной ткани для сбора биомолекулы. Будущая работа будет также сосредоточена на разработке новых устройств для захвата и сохранения биомаркеров, таких как наночастицы на основе кожного пластыря для анализа транссудата кожи протеома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Майкл Генри, Dublin City University, любезно помогал с сбора и анализа данных, показанной на рисунке 5. Эта работа была частично поддержана (1) Университет Джорджа Мейсона, (2) итальянская IstitutoSuperiore ди Санита »в рамках Италия / США Соглашение о сотрудничестве между Министерством здравоохранения и социальных служб, Университете Джорджа Мэйсона, и итальянским министерством здравоохранения, (3) NIH, IMAT программы грантов 1R21CA137706-01 и 1R33CA173359-01 в LAL, и (4) Ceres нанонаукам, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M.
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
