Abstract
In planten en groene algen, wordt licht opgevangen door de light-harvesting complexen (LHCs), een familie van integrale membraaneiwitten die chlorofyl en carotenoïden te coördineren. In vivo, worden deze eiwitten gevouwen met pigmenten om complexen die in de thylakoidmembraan worden ingevoegd vormen van de chloroplast. De hoge gelijkenis in de chemische en fysische eigenschappen van de leden van de familie, en het feit dat zij gemakkelijk pigmenten kunnen verliezen tijdens isolatie, maakt hun zuivering in een natieve toestand uitdagend. Een alternatieve benadering homogene preparaten van LHCs verkrijgen werd ontwikkeld door Plumley en Schmidt in 1987 1, die aantoonde dat het mogelijk was om deze complexen in vitro uitgaande van gezuiverde pigmenten en ongevouwen apoproteins reconstitueren, waardoor complexen met eigenschappen vergelijkbaar met die van natuurlijk complexen. Dit maakte de weg vrij voor het gebruik van bacteriële expressie gebrachte recombinante eiwitten in vitro (bijvoorbeeld pigment bindingsplaatsen) of eiwit domein (bijvoorbeeld eiwit-eiwit interactie, vouwen). Deze werkwijze is geoptimaliseerd in verschillende laboratoria en toegepast op het meeste licht-harvesting complexen. De hier beschreven protocol beschrijft de methode voor de reconstructie light-harvesting complexen in vitro momenteel gebruikt in ons laboratorium, en voorbeelden beschrijven toepassingen van de werkwijze voorzien.
Introduction
De fotosynthese-apparaat van planten en algen bevatten integrale membraaneiwitten die chlorofyl a binden (chl a), b (chl b) en carotenoïden (auto). De pigment-eiwitcomplexen zijn actief in oogsten lichtenergie en overdracht die excitatie energie aan het reactiemengsel centra, waar het wordt gebruikt om ladingsscheiding 2 promoten. Ze zijn ook betrokken bij regulerende feedback mechanismen die de fotosynthese-apparaat van hoge lichte schade 3,4 beschermen. The light harvesting complexen (LHCs) bestaan uit een grote familie van verwante eiwitten in planten en algen 5.
De homogene zuivering van elk lid van de familie wordt bemoeilijkt door de zeer vergelijkbare chemische en fysische eigenschappen van de complexen. Bovendien zuiveringswerkwijzen vaak tot verlies van pigmenten of andere potentiële cofactoren zoals lipiden. In vitro reconstitutie vertegents een krachtige methode om deze problemen te overwinnen. De LHC verbonden fotosysteem II (LHC-II) werd eerst gereconstitueerd in vitro door Plumley en Schmidt in 1987 1. De onderzoekers geëxtraheerd ontvette eiwitten en pigmenten afzonderlijk van planten chloroplasten, en vervolgens gecombineerd warmte gedenatureerd eiwit met pigmenten in aanwezigheid van lithium Dodecyl Sulfate (LDS), gevolgd door drie cycli van invriezen en ontdooien 1. Zij toonden aan dat de spectrale eigenschappen van de gereconstitueerde LHC complexen waren zeer vergelijkbaar met complexen gezuiverd uit planten. Het gemak reconstitueren LHC pigment-eiwitcomplexen, waarschijnlijk vanwege een aantal inherente zelfassemblage functie, samen met de moeilijkheid om gezuiverde complexen uit organismen, tot de snelle vaststelling van de werkwijze door andere onderzoekers. De reconstitutie van fotosynthetische proteïnen overexpressie in Escherichia coli (E. coli) bereikt door Paulsen en collega's in 1990 6. In E.coli, overexpressie membraaneiwitten worden meestal verpakt in inclusielichamen, welke voorzieningen de zuivering. Reconstitutie wordt bereikt door hitte denaturatie van de inclusielichamen bevattende recombinant eiwit in aanwezigheid van LDS, gevolgd door de toevoeging van pigmenten die de eiwitvouwing initieert. Vouwen van de LHCII complex is een proces in twee stappen: eerst wordt chlorofyl een gebonden in minder dan 1 minuut; tweede, is chlorofyl b gebonden en gestabiliseerd gedurende enkele minuten 7.
Naast het verschaffen van inzicht in de vouwen dynamiek, in vitro reconstitutie gecombineerd met plaatsgerichte mutagenese heeft het mogelijk gemaakt specifieke aminozuren belangrijk voor stabiliteit (bijvoorbeeld 8,9) of pigment coördinatie (bijvoorbeeld 10). Manipulatie van het opnieuw vouwen voorwaarden door het aanpassen van parameters zoals pigmentsamenstelling of reinigingsmiddelen zijn ook geïdentificeerd elementen critical voor juiste vouwing, zoals het vereiste van xanthofyllen de LHCII complex (bijvoorbeeld 1,11). Bovendien is onderzoek naar de eigenschappen van afzonderlijke pigmenten gebonden aan de complexen onmogelijk geweest met complexen gereconstitueerd in vivo (bijvoorbeeld 10).
De hier beschreven methode begint met isolatie van pigmenten (chlorofylen en carotenoïden) uit spinazie en de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. De expressie en zuivering van een LHC eiwit van E. coli in de vorm van inclusielichamen wordt vervolgens beschreven, gevolgd door de reconstructie van LHC en daaropvolgende zuivering met Ni affiniteitskolom. In de laatste stap worden de bereide complexen verder gezuiverd door sucrose gradiënt centrifugatie om pigmenten en ongevouwen apoproteïne verwijderen. Dit protocol vormt een geoptimaliseerde procedure waarin verscheidene wijzigingen die door verschillende laboratoria dan hebben ingevoerdtijd 1,6,10,12 -14.
Protocol
1 Totaal pigmentextractie van spinazie bladeren
- Meng een handvol spinazie (~ 20 g) in 100 ml koude maalbuffer (zie tabel 1) met een menger gedurende 20 sec.
- Filtreer de oplossing door twee lagen nylon doek met een poriediameter van 20 pm en gecentrifugeerd filtraat bij 1500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet met de chloroplasten met een zachte artiesten kwast in 1 ml koude wasbuffer (zie tabel 1). Nadat de pellet wordt geresuspendeerd, voeg 50 ml wasbuffer en centrifugeer de oplossing bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig (thylakoiden) in 50 ml wasbuffer (zie tabel 1).
- Centrifugeer de oplossing bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en volledig verwijderen van het supernatant. Op dit punt, het uitvoeren van de volgende stappen in het donker, om pigment oxidatie te voorkomen. Voeg ~ 20 ml 80% aceton gebufferd met Na 2 CO 3 (zie Tabel 1) om het pigment te extraheren. Laat de oplossing op ijs gedurende 10 minuten, vortexen af en toe.
- Pellet de cellulaire componenten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
OPMERKING: Als de pigmenten niet helemaal uitgepakt, zal de pellet een groene kleur hebben en stap 1.6 moet worden herhaald. - Verzamel de bovenstaande vloeistof in een scheitrechter. Voeg 0,4 volumes diethylether, schud krachtig en open de klep om het gas te ontluchten.
- Voeg 0,8 volumes van 0,33 M NaCl en meng krachtig. Laat ~ 10 min voor de lagen te scheiden. De etherfase bovenaan bevat de geëxtraheerde pigmenten. Verwijder de transparante onderste fase.
Opmerking: Als de scheiding niet duidelijk, bevriezen en ontdooien de oplossing fasescheiding verbeteren. - Verwijder de ether door gieten van de top van de scheitrechter in een geschikte glazen container. Droog door het toevoegen van een lepel granheid op watervrij natriumsulfaat. Schud de oplossing en laat ~ 5 min voor het droogmiddel water absorberen uit de ether.
OPMERKING: Herhaal deze stap als de natriumsulfaat volledig samen geklonterd lijkt; Er moet een vrij zwevende kristallen wanneer de ether voldoende gedroogd. Als een waterlaag vormen verwijdert dit met een Pasteur pipet voor het toevoegen van extra watervrij natriumsulfaat. - Schenk de ether in nieuw glazen container, waardoor de natriumsulfaat vaste stof achter.
- Damp de ether in een roterende speedvac of onder een stroom N2.
- Los het pigment volledig in 10 ml 100% aceton.
- Verdun een kleine hoeveelheid (~ 3 ui) in 1 ml van 80% aceton en meet de absorptiespectra en bepaal de Chl a / b-verhouding en de Chl concentratie met de door Porra e.a. methode. (1989) 15.
- Aliquot en droog de pigmenten in een roterende speedvac of onder N2 stroom totdat de acetonvolledig afgedampt. Bewaar de gedroogde pigmenten bij -80 ° C.
2 Winning van carotenoïden uit Spinazie
- Volg de stappen 1,1 tot 1,5. Op dit punt, het uitvoeren van de volgende stappen in het donker, om pigment oxidatie te voorkomen.
- Resuspendeer de pellet in thylakoid ~ 50 ml 96% ethanol gebufferd met Na 2 CO 3 (zie Tabel 1) om het pigment te extraheren. Laat de oplossing op ijs gedurende 5 minuten.
- Pellet de cellulaire componenten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
OPMERKING: Als de pigmenten niet helemaal uitgepakt, zal de pellet een groene kleur hebben en stap 2.2 moet worden herhaald. - Verzamel de bovenstaande vloeistof verwijderd en 0,1 volume 80% KOH (w / v) verzeping initiëren.
- Laat de oplossing bij 4 ° CO / N, goed afgesloten en beschermd tegen het licht.
- Verzamel de oplossing in een scheidtrechter. Voeg 1 volume diethylether en meng voorzichtig.
- Voeg 0,8 voloproepsignaal van 0,33 M NaCl en meng voorzichtig. Laat ~ 10 min voor de lagen te scheiden. De oranje etherfase bovenaan bevat verzeepte carotenoïden. Verwijder de groene onderste fase door aftappen door de plugkraan van de trechter.
- Voeg 3 delen water toe en meng het kaliumhydroxide verwijderen. Wacht tot de lagen te scheiden. OPMERKING: Als de bovenste fase troebel, voeg een kleine hoeveelheid NaCl (bv 3 g NaCl in 200 ml oplossing) en schud zachtjes op te lossen.
- Verwijder de onderste fase door aftappen door de plugkraan van de trechter.
- Volg stap 1,10-1,13.
- Verdun een kleine hoeveelheid (~ 3 ui) in 1 ml van 80% aceton en meet de absorptie spectra bij 440 nm in 80% aceton. Om de concentratie te bepalen, gebruikt de gemiddelde extinctie coëfficiënt van de carotenoïden (ε = 440 255) 16 de volgende formule: Car [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (optische weglengte) = 1 cm.
- Aliquot en droog de carotenoids in een speedvac of onder N2 stroom totdat alle diethylether werd verdampt. Bewaar de gedroogde pigmenten bij -80 ° C.
3 Totaal Pigment en Carotenoïde Winning Chlamydomonas reinhardtii
- Groeien C. reinhardtii op vast TAP medium 17 in een petrischaal door het verspreiden van een kleine hoeveelheid vloeibare kweek op het oppervlak. Groeien onder continue belichting flux van 20 umol's PSA m -2 s -1 tot er een groene laag van cellen zichtbaar.
- Met behulp van een steriele entnaald, oogst een kleine hoeveelheid C. reinhardtii van de vaste TAP medium en zet de cellen in 500 ml TAP medium 17 in een 1 L kolf. Groeien de cultuur bij 25 ° C met 170 rpm agitatie onder een continue belichting flux van 20 umol's PSA m -2 sec -1.
- Na 5-6 dagen, dient de kweek het einde van de logaritmische fase bereikt (6 x 10 6 cellen / mlof 2-2.5 optische dichtheid bij 750 nm). Centrifugeer de kweek bij 4000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Voor de totale pigmentextractie, volgt u stappen 1,6-1,15.
- De opbrengst van de totale pigment extract vanaf 500 ml volle groei cultuur van C. reinhardtii is ongeveer 5 ml oplossing met een concentratie van 0,5 mg chl a + b / ml.
- Voor carotenoïden extractie, volgt u stappen 2,2-2,12.
4 Zuivering van Inclusion Bodies
- Kloon de coderende sequentie van de LHC eiwit van interesse in een expressievector die resulteert in een gefuseerd C-eindstandige His-tag onder toepassing van standaard moleculair biologische werkwijzen. Transformeer deze construct in E. coli gastheerstam zoals BL21 (DE3).
- Bereid Lysis buffer, Detergent buffer, Triton buffer, TE (tabel 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en LB medium 18 met de geschikte antibiotica.
- Kies een enke E. coli kolonie die de expressie kloon van een vers uitgestreken plaat in ~ 5 ml LB medium met geschikte antibiotica middels standaardprocedures 6. Groeien bij 37 ° C met 220 rpm agitatie gedurende tenminste 16 uur.
- Voeg 2,5 ml van de O / N kweek in een 1 L erlenmeyer met 250 ml LB aangevuld met de juiste antibiotica.
- Kweek de cellen gedurende 2-3 uur (of totdat de OD 600 is ~ 0,6) bij 37 ° C bij 220 rpm.
- Voeg IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Blijf de cellen groeien bij 37 ° C met 220 rpm 3-4 uur.
- Centrifugeer de kweek gedurende 10 minuten bij 5000 xg bij 4 ° C in een vooraf gewogen centrifugebuis. Verwijder het supernatant zorgvuldig en bepaal het gewicht van de pellet door opnieuw wegen en aftrekken van de centrifugebuis gewicht.
- Resuspendeer de E. coli cel pellet in 0,8 ml / g lysisbuffer door krachtig vortexen.
OPMERKING: U kunt de cel pellet bij -80 worden bevrorenC voor later gebruik. Als u met een bevroren pellet, volledig laten ontdooien voor het toevoegen van de lysis buffer. - Voeg 2 mg lysozym per gram cellen en incubeer op nat ijs met af vortexen gedurende 30 minuten.
- Voeg 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCl, 20 ug / ml RNAse. Vortex en zet op ijs gedurende 30 minuten.
- Voeg 2 ml koude buffer Detergent per gram cellen. Meng goed en houden kamertemperatuur 5 minuten.
- Transfer naar 2 ml centrifugebuis (in twee buizen indien nodig). Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren.
- Voeg 1 ml koud Triton buffer en een volledige resuspensie van de pellet door behandeling met ultrageluid (3 pulsen x 5 sec x 50% vermogen met 20 sec interval). OPMERKING: Laat de buis in een klein bekerglas omringd door ijswater om het tijdens de behandeling met ultrageluid koud te houden. In het geval van meerdere buizen combineren geresuspendeerd inclusielichamen in een buis na resuspensie.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren.
- Herhaal stap 4.13 en 4.14 twee keer.
- Resuspendeer de inclusielichamen in 1 ml koude TE met sonificatie een laatste wassing voor het Triton buffer te verwijderen. Centrifugeer 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C om de insluitingslichamen te pelleteren.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml koude TE door sonificatie.
- Beoordeel de eiwitconcentratie met standaardmethoden zoals de Bradford assay 19. WINKEL aliquots van de inclusielichamen bij -20 ° C.
5 Reconstructie
Dit protocol levert gewoonlijk 1-2 ml gereconstitueerde eiwit met een buitendiameter van 4 bij absorptie wordt gemeten in de regio Qy (600-750 nm). Afname kan naar wens worden ingesteld, maar er moet worden om de juiste verhoudingen te behouden tijdens de procedure.
- Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: 2x Reconstitution Buffer, 20% OG, 2 M KCl, TE. Voer de volgende sTEP's bij weinig licht.
- Resuspendeer 800 ug LHC inclusielichamen in totaal 400 pi TE in een 2 ml microcentrifugebuis. Voeg 400 ul van de 2x reconstitutiebuffer en vortex kort.
- Voeg 0,6 ul van β-Mercaptoethanol (stock 14.8 M) tot een eindconcentratie van 10 mM heeft. Verwarm het eiwit gedurende 1 min bij 98 ° C. Vortex kort plaats bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer 500 ug totaal gedroogd chlorofylpigmenten plus 80 ug carotenoïde pigmenten in 30 ul 100% EtOH door krachtig vortexen gedurende 1 min of plaats in een badsonicator gedurende 1-2 minuten.
- Draai de pigmentmix ~ 30 seconden bij 15.800 xg bij 4 ° C en controleer of er geen pellet. Als er een pellet, herhaal vortexen en / of sonificatie. BELANGRIJK: Na de resuspensie en de spin meteen pigment toe te voegen aan het eiwit, of het kan aggregeren en zal opnieuw moeten worden gesuspendeerd.
- Voeg langzaam het pigment mix om het afgekoelde eiwit terwijl vortexen. Blijven vortex 5-10 sec en plaats buis op nat ijs. Pas te krachtig niet vortex als het eiwit de bovenkant van de buis kan overstromen.
- Voeg 94 ul van 20% octyl-β-D-glucopyranoside (OG) (eindconcentratie van 2%), vortex kort houden op ijs 10 min.
- Voeg 90 ul van KCl 2 M (uiteindelijke concentratie 150-200 mM), vortex kort en blijf op ijs 20 min. OPMERKING: column voorbereiding (hoofdstuk 6) kan op dit moment worden gestart.
- Spin gedurende 10 min bij 15.800 xg bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet (neergeslagen LDS) een 10 ml buis. Houd koude en beschermd tegen licht.
6 Nickel Column Zuivering
- Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: OG buffer, OG spoelbuffer, Elution buffer.
- Sluit een Ni-Sepharose-kolom (1 ml) of equivalent aan een peristaltische pomp zodat er geen lucht in het inwendige van de kolom tijdens deze stap en de volgende stappen.
- Stel de snelheid van tHij pomp tot 1 ml / min en spoel de kolom met 5-10 ml water om de opslagoplossing verwijderen.
- Equilibreer de kolom met 3-4 ml OG buffer.
- Voeg 3-4 ml OG buffer om het eiwit monster en belasting van de kolom. OPMERKING: als het eiwit is zittend op het ijs langer dan 10 minuten na het verwijderen van de LDS, draai weer bij 15.800 xg bij 4 ° C gedurende 1 minuut om extra LDS neerslag te verwijderen.
- Spoel de kolom met 5 ml OG buffer.
- Was de kolom met 2 ml OG spoelbuffer.
- Elueren het gebonden eiwit met 3 ml elutiebuffer. Verzamel de groene elueren die het opgeloste eiwit bevat. Opmerking: Dit is meestal ongeveer 1 ml in totaal.
7 Sucrose gradiëntcentrifugatie
- Bereid de volgende oplossingen zoals beschreven in Tabel 1: Sucrose-oplossing, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.
- Vul ultracentrifugebuizen met de sucrose-oplossing en bevriezen bij -20 ° CO / N or -80 ° C gedurende tenminste 1 uur.
- Haal de buis uit vriezer en laat het ongestoorde ontdooien bij 4 ° C. OPMERKING: De vries / dooi proces creëert een gradiënt van 0,1 tot 1 M sucrose. Een 15 ml buisje dooi kenmerkend in ongeveer 3 uur.
- Verwijder voorzichtig van boven hetzelfde volume als de groene fractie geëlueerd uit nikkel Sepharose kolom in stap 6.8. Laad daarna de gereconstitueerde monster bovenop langzaam om te voorkomen dat het verstoren van het verloop.
- Balance buizen en centrifugeren op 200.000 xg bij 4 ° C in een ultracentrifuge met een SW-41 of SW-60 swinging bucket rotor gedurende 18 uur, op acceleratie en stoppen zonder remmen vertragen.
- Verwijder voorzichtig het verloop van de buis houder met een pincet. Gebruik een spuit met een lange naald die een stompe opening naar de fractie van boven Collect. OPMERKING: Anders, verzamel fracties uit de bodem van de buis doorboren met een naald en verzamelen druppels.
Representative Results
Dit protocol Gegevens een werkwijze chorophyll a / b bindende eiwitten in vitro reconstitueren. Deze techniek maakt het vouwen van deze pigment-eiwitcomplexen in vitro uitgaande van het apo-eiwit, dat kan worden verkregen door overexpressie in een heteroloog systeem en pigmenten geëxtraheerd uit planten of algen. Na bereiding wordt het opnieuw gevouwen pigment-eiwit complex van de overmaat aan pigmenten en ongevouwen apoproteïne in twee stappen gezuiverd. De eerste stap (figuur 1 AB) is gebaseerd op de aanwezigheid van His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit, die de verwijdering van een groot deel van de ongebonden pigmenten toestaat. De tweede zuiveringsstap gebruikt sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 2) wanneer het ongevouwen eiwit migreert gewoonlijk langzamer dan de groene band met het gereconstitueerde eiwit. Het doel van de reconstitutie in vitro te vormen stabiele dezelfde juistebanden als de broncode zijn. Om dit resultaat te illustreren, de spectroscopische eigenschappen van het in vivo licht-harvesting complex wordt vergeleken met dezelfde LHC complex gereconstitueerd in vitro 13,20,21. Het absorptiespectrum van de LHCs in het zichtbare gebied (350 nm en 750 nm) afhankelijk van de pigment samenstelling van het complex, en op het pigment milieu (dat het eiwit bevat) en het is dus een gevoelig middel om de kwaliteit te controleren van de reconstructie. In figuur 3, het absorptiespectrum van CP24, chlorofyl a / b bindende eiwit van Arabidopsis thaliana, gereconstitueerd in vitro, vergeleken met het spectrum van hetzelfde complex gezuiverd uit Arabidopsis thylakoiden 21. In de spectra is het mogelijk om de Qy en Soret overgang van Chl bis (pieken bij 671/439 nm) en Chl b (pieken bij 649/466 nm) herkennen. De autochtone en gereconstitueerde complexen identieke absorption spectra, wat wijst op een vrijwel identieke pigment samenstelling en de organisatie. Fluorescentie spectroscopie kan worden toegepast om de kwaliteit van het bereide complex beoordelen. De fluorescentie-emissie-spectra gemeten bij excitatie bij verschillende golflengten, die bij voorkeur wekken verschillende pigmenten: Chl a bij 440 nm, Chl b 475 nm, en xanthofyllen bij 500 nm. In een correct gevouwen eiwit-complex pigment, Chl b en xanthofyllen dragen hun excitatie energie voornamelijk Chl een binnen enkele picoseconden, en de fluorescentie afkomstig is van een thermisch geëquilibreerd systeem resulteert in een enkele piek met dezelfde vorm en maxima bij alle drie excitatie golflengten (Figuur 4A-B). De aanwezigheid van Chl b niet gecoördineerd aan het eiwit kan worden herkend door een extra piek of schouder rond 650 nm bij 475 nm excitatie (Figuur 4C). De aanwezigheid van vrij Chl een plaats leidtextra emissie rond 675 nm, die voornamelijk aanwezig bij 440 nm excitatie. De fluorescentie-emissie-spectra bij 475 nm excitatie van zowel gereconstitueerd en natieve CP24 complexen (figuur 4D) tonen een enkele piek bij 681 nm, wat aangeeft dat het opgeloste complex correct gevouwen. Een extra bevestiging dat de pigment-eiwitcomplex kunnen gereconstitueerd afkomstig van circulair dichroïsme (CD) metingen. De CD-signaal in het zichtbare gebied is afhankelijk van de aangeslagen interacties tussen pigmenten en het is derhalve zeer gevoelig voor zelfs kleine veranderingen in de organisatie van de chromoforen 22. Figuur 5 toont CD spectra van natief gereconstitueerd en CP24, met de typische vingerafdruk pieken bij 681 nm, 650 nm en 481 nm. Kortom, de hoge gelijkenis tussen de spectroscopische eigenschappen van de inheemse en de gereconstitueerde CP24 bevestigt dat de oplosprocedure opbrengsten native-achtige complexen suita woordelijk voor in-vitro-onderzoek van light-harvesting eiwitten.
Figuur 1 Vertegenwoordiging van de zuivering van recombinant LHC proteïnen met een His-tag met een nikkel-kolom. (A) tijdens de zuivering, His-gelabeld eiwit, bestaande uit zowel gereconstitueerde complexen (groen hexagon) en niet-gereconstitueerde / geaggregeerde proteïne (Oranje zeshoek) worden gebonden aan het oppervlak van de Ni-Sepharose (blauwe vlek), terwijl ongebonden pigmenten (kleine gekleurde spots) doorstromen. (B) Als de kolom wordt gewassen met de elutie buffer met imidazool, worden de opgeloste en niet-opgeloste eiwitten verzameld in de doorstroming.
hres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2 sucrosegradiënt gereconstitueerde LHCII na zuivering door nikkelkolom. Het bereide complexen worden gescheiden van het vrije pigment door de dichtheidsgradiënt. De donkergroene band vertegenwoordigt gereconstitueerde LHCII en de lichtgroene achtergrond bestaat uit pigmenten.
Figuur 3 Absorptiespectra gereconstitueerd eiwit CP24 (rCP24, rode lijn) en de naturalness (nCP24, zwarte lijn) geïsoleerd uit Arabidopsis thaliana. In beide spectra is het mogelijk om de Qy en Soret overgang van Chl bis (pieken herkennen bij 671/439 nm) en Chl b (piekt bij 649/466 nm). Dit cijfer is gewijzigd van Passarini et al. 2014 21.
Figuur 4 Fluorescentie-emissiespectra. De fluorescentie emissiespectra van gereconstitueerde CP24 wildtype complex (A) en genormaliseerd naar de maximum (B) weergegeven efficiënte energieoverdracht van Chl b en Xanthophyls een Chl. (C) fluorescentie-emissie spectra van gereconstitueerde CP24 (rCP24) en de inheemse complex (nCP24) geïsoleerd van Arabidopsis thaliana. De spectra zijn genormaliseerd om het maximum van de piek (D). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Circulaire dichroïsmespectra. Geregenereerd CP24 (rCP24, rode lijn) en de inheemse complex (nCP24, zwarte lijn) geïsoleerd uit Arabidopsis thaliana toont zeer vergelijkbaar spectra.
Figuur 6 Absorptiespectra van CP29 wildtype (CP29_WT) en gemuteerde CP29 (CP29_A2). De groene lijn toont de verschillen tussen de twee percelen.
| Alle buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. | ||||||
| Onderdelen | Uiteindelijke concentratie | Aanvullende opmerkingen | ||||
| Maalbuffer | Sorbitol | 0.4 M | ||||
| Tricine | 0.1 M | pH 7,8 | ||||
| NaCl | 10 mM | |||||
| MgCl2 | 5 mM | |||||
| Melkpoeder | 0,5% w / v | |||||
| Wash Buffer | Sorbitol | 50 mM | ||||
| 5 mM | pH 7,8 | |||||
| EDTA | 10 mM | pH 8 | ||||
| Lysis Buffer | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| Sucrose | 2,5% w / v | |||||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| Wasmiddel buffer | NaCl | 200 mM NaCl | ||||
| Deoxycholinezuur | 1% g / v | |||||
| 1% g / v | ||||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| EDTA | 2 mM | pH 8 | ||||
| beta-mercaptoethanol | 10 mM | |||||
| Triton Buffer | Triton X-100 | 0,5% w / v | ||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| beta-mercaptoethanol | 1 mM | |||||
| Buffer TE | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| Reconstitutiebuffer | HEPES | 200 mM | ||||
| Sucrose | 5% w / v | |||||
| Lithiumdodecylsulfate (LDS) | 4% w / v | |||||
| Benzamidine | 2 mM | |||||
| Aminocapronzuur | 10 mM | |||||
| OG Buffer | Octylglucoside | 1% g / v | ||||
| 12,5% w / v | ||||||
| NaCl | 0.2 M | |||||
| HEPES | 20 mM | |||||
| Imidazool | 10 mM | |||||
| OG Rinse Buffer | n-dodecyl-beta-D-maltoside (β-DM) | 0,06% w / v | ||||
| HEPES | 40 mM | pH 7,5-9 | ||||
| NaCl | 0.2 M | |||||
| Elutiebuffer | Imidazool | 0.5 M | ||||
| 0,06% w / v | ||||||
| HEPES | 40 mM | pH 8 | ||||
| NaCl | 0.2 M | |||||
| Sucrose-oplossing | Sucrose | 20% w / v | ||||
| n-dodecyl-beta-D-maltoside (β-DM) | 0,06% w / v | |||||
| HEPES | 0.01 M | pH 7,6 | ||||
| Aceton 80% gebufferd met natriumcarbonaat | Aceton | 80% v / v | Natriumcarbonaat | 1 M | ||
| Ethanol 96% gebufferd met natriumcarbonaat | Ethanol | 96% v / v | ||||
| Natriumcarbonaat | 1 M | |||||
Tabel 1: Lijst van de buffers en de oplossingen die in dit protocol.
| ChLA a / b mix | ChLA | Chl a | Chl b | Neo | Viola | Lute | Chl tot | Chl / Car | |
| nCP26 | - | 2.2 ± 0.05 | 6.2 | 2.8 | 0.61 | 0,38 | 1.02 | 9 | 4.5 ± 0.1 |
| rCP26 | 8 | 2,71 ± 0,05 | 6.57 | 2.43 | 0,72 | 0.32 | 0,97 | "> 93.9 ± 0.04 | |
| rCP26 | 5.5 | 2.25 ± 0.05 | 6.23 | 2.77 | 0,77 | 0,3 | 0,96 | 9 | 4,0 ± 0,1 |
| rCP26 | 3 | 2.08 ± 0.04 | 6.08 | 2,92 | 0.76 | 0,3 | 1.04 | 9 | 4.1 ± 0.1 |
| rCP26 | 1 | 1.7 ± 0.05 | 5.7 | 3.3 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4.3 ± 0.05 |
| rCP26 | 0,3 | 1.11 ± 0.04 | 4.7 | 4.28 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4.2 ± 0.2 |
| 0.05 | 0.23 ± 0.01 | 1.4 | 5.6 | 0,58 | 0.24 | 1.11 | 7 | 3.1 ± 0.06 | |
| rCP26 | <0.01 | 0,11 ± 0,01 | 0,7 | 0,64 | 0,3 | 1.08 | 7 | 3.06 ± 0.06 |
Tabel 2 Pigment gehalte CP26 natieve complex opzichte gereconstitueerde eiwit-pigment complexen met verschillende Chl a / b Ratio 39.
Discussion
Membraaneiwitten zijn niet zo makkelijk om te studeren. Isolatie van natieve membraaneiwitten wordt gecompliceerd door de noodzaak de lipide bilaag oplosbaar met detergentia die het eiwit kan beschadigen en verwijderen essentiële cofactoren. Deze eiwitten kunnen ook bij lage niveaus in biologische membranen, of wordt gemengd met nauw verwante eiwitten, zoals bij het light harvesting complexen, die zuivering van afzonderlijke complexen bemoeilijkt. Heterologe eiwitexpressie in E. coli en in vitro reconstitutie biedt de mogelijkheid om deze problemen te vermijden. In vitro reconstitutie en zuivering van gevouwen eiwitten resulteert in complexen die kenmerken vergelijkbaar met die van de natieve complexen 20,21,23 is er wel kan worden gebruikt om complexen die niet kunnen worden gezuiverd tot homogeniteit 24 studeren - 27.
Deze methode maakt gebruik van spinazie, dat is gemakkelijk attainable jaar door, als een bron voor het totale pigment en carotenoïdenpreparaten. Voor sommige reconstructies van eiwitten afkomstig uit algen, is het gebruik van pigmenten gezuiverd uit algen voorkeur vanwege verschillende pigment samenstellingen. De Chl a / b-verhouding en Chl / auto verhouding hetzelfde blijft ongeacht pigment bron.
Het is belangrijk te realiseren dat de efficiëntie van de reconstitutie gewoonlijk ongeveer 35% 28. Zo is het noodzakelijk om de niet-gebonden pigmenten en uitgeklapte apoprotein van de oplossing na de reconstitutie verwijderen. Een twee-staps zuiveringsproces protocol wordt gepresenteerd in dit protocol (zie ook resulteert). Er moet echter worden opgemerkt dat de sucrose gradiënt stap de volledige scheiding van apo-en holo-eiwit niet toestaat. Voor de meeste analyses is dit geen probleem, aangezien de apoproteïne geen pigmenten en dus niet interfereert met de functionele metingen. Daarom, moet het apo-eiwit volledig te verwijderen van de fractie met het gereconstitueerde complex (bijvoorbeeld om het pigment eiwit stoichiometrie berekenen) kan een anionische uitwisselende kolom gebruikt (zie Passarini et al. 2009 29 voor details).
Het vermogen om recombinante light harvesting eiwitten te hervouwen met geïsoleerde pigmenten in vitro biedt de gelegenheid om "manipuleren" de complexen door aanpassing van de reconstitutie "omgeving" op verschillende manieren, waardoor de kenmerken van het verkregen complex veranderen. Bijvoorbeeld, de pigment samenstelling verandert tijdens reconstitutie kan resulteren in een complex met gewijzigde pigment compositie. Deze functie kan worden gebruikt om de invloed van verschillende pigmenten op de structuur en stabiliteit van het complex te bestuderen. Meestal pigment preparaat met spinazie een Chl a / b verhouding van 3: 1 en een Chl / auto-verhouding van 2,9: 1. Deze verhouding geeft gewoonlijk een gereconstitueerd eiwit met dezelfde eigenschappen als de ntieve een. Echter, kan aanpassing van de Chl a / b-verhouding door toevoeging van gezuiverde Chl a of b beïnvloeden de binding van verschillende pigmenten door variabele selectiviteit van de bindingsplaatsen 30-33. Dit is mogelijk omdat de meeste pigment bindingsplaatsen niet volledig selectief voor Chl a of b Chl, maar is geschikt voor beide, zij het met verschillende affiniteit 10,30,34. Op soortgelijke wijze werden de carotenoïde bindingsplaatsen ook aangetoond kunnen meerdere xanthofyl species 8,35 tegemoet - 38. Verschillende reconstructies van CP26, een pigment-eiwitcomplex van hogere planten, met verschillende pigment samenstellingen worden getoond in Tabel 2 39. Deze reconstructies werden gebruikt om de affiniteit van bindingsplaatsen voor bepaalde pigmenten 39 beoordelen. Het is interessant op te merken dat, om een complex met hetzelfde pigment c verkrijgenAMENSTELLING als naturalness moet de Chl a / b-verhouding van pigment mix 3: 1. Dit lijkt het geval voor alle LHC complexen van hogere planten 20,40 zijn.
De combinatie van moleculaire biologie met de reconstitutie techniek kan de eigenschappen van een Chl-bindende complex te bestuderen in meer detail. Het belang van de verschillende eiwit domeinen op de stabiliteit en het vouwen van de complexen, of hun betrokkenheid bij de eiwit-eiwit interacties, zijn bepaald door het afkappen van de apo-eiwit of het uitvoeren van willekeurige mutagenese 8,41 - 44. Single aminozuurresiduen rol in de coördinatie van verschillende pigmenten kunnen worden veranderd door plaatsgerichte mutagenese om de eigenschappen van de individuele pigmenten analyseren of evalueren hun bijdrage aan de functie en stabiliteit van het complex 10,28,29,45 - 52. Figuur 6 toont gereconstitueerde Lhcb4 (CP29) meteen mutatie van de histidine op positie 216 53. Een vergelijking van de pigment samenstelling van wildtype en mutante complexen toont aan dat de mutatie induceert het verlies van Chl een molecuul, wat aangeeft dat de doelplaats herbergt een Chl een in de WT complex. De verschillen van de absorptiespectra van WT en mutante, na normalisatie naar het pigmentgehalte, toont ook de absorptie eigenschappen van de verloren pigment. In dit geval kan het verschil te zien in de grote piek bij 680 nm, wat aangeeft dat de Chl een gecoördineerd door His216 absorbeert bij deze golflengte (voor meer informatie over deze mutant en de spectroscopische eigenschappen zie Mozzo et al. 2008 53). Mutatie analyse kan ook worden gebruikt om het effect van het milieu op de spectroscopische eigenschappen van de pigmenten 54 bepalen.
Concluderend kan licht oogsten eiwitten gemakkelijk worden opgelost in vitro resulteert in pigment-protein complexen met zeer vergelijkbare eigenschappen met inheemse complexen. Op deze wijze worden de problemen isoleren natieve eiwitten geëlimineerd, terwijl het ook eiwitpreparaat met hoge opbrengst en zuiverheid voor verdere studie. Het belang van een 3: 1 Chl a / b-verhouding in het produceren van een authentiek complex wordt benadrukt, en voorbeelden van gereconstitueerde wildtype en mutante LHCs worden aan toepassingen van de techniek illustreren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Nylon cloth | 20 μm pores | ||
| Soft artists paint brush | |||
| NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
| Beta-DM | Sigma | D4641 | |
| DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
| Milk Powders | |||
| RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
| Sonicator | |||
| Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
| Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
| TAP medium | see reference 17 | ||
| LB medium | see reference 19 |
References
- Plumley, F. G., Schmidt, G. W. Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting complexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 146-150 (1987).
- Croce, R., van Amerongen, H. Light-harvesting and structural organization of Photosystem II from individual complexes to thylakoid membrane. Journal of photochemistry and photobiology B Biology. 104 (1-2), 142-153 (2011).
- Li, Z., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and responding to excess light. Annual review of plant biology. 60, 239-260 (2009).
- De Bianchi, S., Ballottari, M., Dall’osto, L., Bassi, R. Regulation of plant light harvesting by thermal dissipation of excess energy. Biochemical Society transactions. 38 (2), 651-660 (2010).
- Neilson, J. A. D., Durnford, D. G. Structural and functional diversification of the light-harvesting complexes in photosynthetic eukaryotes. Photosynthesis research. 106 (1-2), 57-71 (2010).
- Paulsen, H., Rümler, U., Rüdiger, W. Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta. 181 (2), 204-211 (1990).
- Horn, R., Grundmann, G., Paulsen, H. Consecutive binding of chlorophylls a and b during the assembly in vitro of light-harvesting chlorophyll-a/b protein (LHCIIb). Journal of molecular biology. 366 (3), 1045-1054 (2007).
- Cammarata, K. V., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of a light-harvesting gene product: deletion mutagenesis and analyses of pigment binding. Biochemistry. 31 (10), 2779-2789 (1992).
- Paulsen, H., Hobe, S. Pigment-binding properties of mutant light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 205 (1), 71-76 (1992).
- Bassi, R., Croce, R., Cugini, D., Sandonà, D. Mutational analysis of a higher plant antenna protein provides identification of chromophores bound into multiple sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (18), 10056-10061 (1999).
- Paulsen, H., Finkenzeller, B., Kühlein, N. Pigments induce folding of light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 215 (3), 809-816 (1993).
- Caffarri, S., Croce, R., Cattivelli, L., Bassi, R. A look within LHCII differential analysis of the Lhcb1-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis. Biochemistry. 43 (29), 9467-9476 (2004).
- Giuffra, E., Cugini, D., Croce, R., Bassi, R. Reconstitution and pigment-binding properties of recombinant CP29. European journal of biochemistry / FEBS. 238 (1), 112-120 (1996).
- Rogl, H., Kosemund, K., Kühlbrandt, W., Collinson, I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBS letters. (1-2), 21-26 (1998).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
- Davies, B. H. Identification of carotenoids by their absorption characteristics. Biochem J. 103 (2), (1967).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wientjes, E., Croce, R. The light-harvesting complexes of higher-plant Photosystem I Lhca1/4 and Lhca2/3 form two red-emitting heterodimers. The Biochemical journal. 433 (3), 477-485 (2011).
- Passarini, F., Xu, P., Caffarri, S., Hille, J., Croce, R. Towards in vivo mutation analysis knock-out of specific chlorophylls bound to the light-harvesting complexes of Arabidopsis thaliana - the case of CP24 (Lhcb6). Biochimica et biophysica acta. , (2014).
- Georgakopoulou, S., van der Zwan, G., Bassi, R., van Grondelle, R., van Amerongen, H., Croce, R. Understanding the changes in the circular dichroism of light harvesting complex II upon varying its pigment composition and organization. Biochemistry. 46 (16), 4745-4754 (2007).
- Croce, R., Müller, M. G., Caffarri, S., Bassi, R., Holzwarth, A. R. Energy transfer pathways in the minor antenna complex CP29 of photosystem II a femtosecond study of carotenoid to chlorophyll transfer on mutant and WT complexes. Biophysical journal. 84 (4), 2517-2532 (2003).
- Schmid, V. H., Cammarata, K. V., Bruns, B. U., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730 heterodimerization is required for antenna pigment organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (14), 7667-7672 (1997).
- Castelletti, S., Morosinotto, T., Robert, B., Caffarri, S., Bassi, R., Croce, R. Recombinant Lhca2 and Lhca3 subunits of the photosystem I antenna system. Biochemistry. 42 (14), 4226-4234 (2003).
- Storf, S., Jansson, S., Schmid, V. H. R. Pigment binding, fluorescence properties, and oligomerization behavior of Lhca5, a novel light-harvesting protein. The Journal of biological chemistry. 280 (7), 5163-5168 (2005).
- Mozzo, M., Mantelli, M., Passarini, F., Caffarri, S., Croce, R., Bassi, R. Functional analysis of photosystem I light-harvesting complexes (Lhca) gene products of Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et biophysica acta. 1797 (2), 212-221 (2010).
- Remelli, R., Varotto, C., Sandonà, D., Croce, R., Bassi, R. Chlorophyll binding to monomeric light-harvesting complex. A mutation analysis of chromophore-binding residues. The Journal of biological chemistry. 274 (47), 33510-33521 (1999).
- Passarini, F., Wientjes, E., Hienerwadel, R., Croce, R. Molecular basis of light harvesting and photoprotection in CP24 unique features of the most recent antenna complex. The Journal of biological chemistry. 284 (43), 29536-29546 (2009).
- Giuffra, E., et al. Analysis of some optical properties of a native and reconstituted photosystem II antenna complex, CP29 pigment binding sites can be occupied by chlorophyll a or chlorophyll b and determine spectral forms. Biochemistry. 36 (42), 12984-12993 (1997).
- Pagano, A., Cinque, G., Bassi, R. In vitro reconstitution of the recombinant photosystem II light-harvesting complex CP24 and its spectroscopic characterization. The Journal of biological chemistry. 273 (27), 17154-17165 (1998).
- Kleima, F. J., et al. Decreasing the chlorophyll a/b ratio in reconstituted LHCII structural and functional consequences. Biochemistry. 38 (20), 6587-6596 (1999).
- Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et biophysica acta. 1556 (1), 29-40 (2002).
- Hobe, S., Trostmann, I., Raunser, S., Paulsen, H. Assembly of the major light-harvesting chlorophyll-a/b complex Thermodynamics and kinetics of neoxanthin binding. The Journal of biological chemistry. 281 (35), 25156-25166 (2006).
- Croce, R., Weiss, S., Bassi, R. Carotenoid-binding sites of the major light-harvesting complex II of higher plants. The Journal of biological chemistry. 274 (42), 29613-29623 (1999).
- Hobe, S., Niemeier, H., Bender, A., Paulsen, H. Carotenoid binding sites in LHCIIb. Relative affinities towards major xanthophylls of higher plants. European journal of biochemistry / FEBS. 267 (2), 616-624 (2000).
- Jahns, P., Depka, B., Trebst, A. Xanthophyll cycle mutants from Chlamydomonas reinhardtii indicate a role for zeaxanthin in the D1 protein turnover. Plant Physiology and Biochemistry. 38 (5), 371-376 (2000).
- Wehner, A., Grasses, T., Jahns, P. De-epoxidation of violaxanthin in the minor antenna proteins of photosystemII, LHCB4, LHCB5, and LHCB6. The Journal of biological chemistry. 281 (31), 21924-21933 (2006).
- Croce, R., Canino, G., Ros, F., Bassi, R. Chromophore organization in the higher-plant photosystem II antenna protein CP26. Biochemistry. 41 (23), 7334-7343 (2002).
- Caffarri, S., Passarini, F., Bassi, R., Croce, R. A specific binding site for neoxanthin in the monomeric antenna proteins CP26 and CP29 of Photosystem II. FEBS letters. 581 (24), 4704-4710 (2007).
- Hobe, S., Förster, R., Klingler, J., Paulsen, H. N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex. Biochemistry. 34 (32), 10224-10228 (1995).
- Kuttkat, A., Hartmann, A., Hobe, S., Paulsen, H. The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex. European journal of biochemistry / FEBS. 242 (2), 288-292 (1996).
- Rupprecht, J., Paulsen, H., Schmid, V. H. Protein domains required for formation of stable monomeric Lhca1- and Lhca4-complexes. Photosynthesis research. 63 (3), 217-224 (2000).
- Yang, C., et al. The negatively charged amino acids in the lumenal loop influence the pigment binding and conformation of the major light-harvesting chlorophyll a/b complex of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (11), 1463-1470 (2008).
- Rogl, H., Kühlbrandt, W. Mutant trimers of light-harvesting complex II exhibit altered pigment content and spectroscopic features. Biochemistry. 38 (49), 16214-16222 (1999).
- Yang, C., Kosemund, K., Cornet, C., Paulsen, H. Exchange of pigment-binding amino acids in light-harvesting chlorophyll a/b protein. Biochemistry. 38 (49), 16205-16213 (1999).
- Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. Mutation analysis of Lhca1 antenna complex. Low energy absorption forms originate from pigment-pigment interactions. The Journal of biological chemistry. 277 (39), 36253-36261 (2002).
- Morosinotto, T., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. The nature of a chlorophyll ligand in Lhca proteins determines the far red fluorescence emission typical of photosystem I. The Journal of biological chemistry. 278 (49), 49223-49229 (2003).
- Ballottari, M., Mozzo, M., Croce, R., Morosinotto, T., Bassi, R. Occupancy and functional architecture of the pigment binding sites of photosystem II antenna complex Lhcb5. The Journal of biological chemistry. 284 (12), 8103-8113 (2009).
- Croce, R., et al. Origin of the 701-nm fluorescence emission of the Lhca2 subunit of higher plant photosystem I. The Journal of biological chemistry. 279 (47), 48543-48549 (2004).
- Morosinotto, T., Mozzo, M., Bassi, R., Croce, R. Pigment-pigment interactions in Lhca4 antenna complex of higher plants photosystem I. The Journal of biological chemistry. 280 (21), 20612-20619 (2005).
- Mozzo, M., Morosinotto, T., Bassi, R., Croce, R. Probing the structure of Lhca3 by mutation analysis. Biochimica et biophysica acta. 1757 (12), 1607-1613 (2006).
- Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., Croce, R. Photoprotection in higher plants the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (10), 1263-1267 (2008).
- Wientjes, E., Roest, G., Croce, R. From red to blue to far-red in Lhca4 how does the protein modulate the spectral properties of the pigments. Biochimica et biophysica acta. 1817 (5), 711-717 (2012).
