Abstract
Chez les plantes et les algues vertes, de la lumière est captée par les complexes collecteurs de lumière (SLL), une famille de protéines membranaires intégrales qui coordonnent les chlorophylles et caroténoïdes. In vivo, ces protéines sont repliées avec des pigments pour former des complexes qui sont insérées dans la membrane des thylakoïdes du chloroplaste. La grande similitude des propriétés chimiques et physiques des membres de la famille, ainsi que le fait qu'ils peuvent facilement perdre pigments lors de l'isolement, rend leur purification à l'état natif difficile. Une autre approche pour obtenir des préparations homogènes de SLL a été développé par Plumley Schmidt en 1987 et 1, qui a montré qu'il était possible de reconstituer ces complexes in vitro à partir de pigments purifiés et des apoprotéines dépliées, résultant en des complexes avec des propriétés très similaires à celles du native complexes. Cela a ouvert la voie à l'utilisation de protéines recombinantes exprimées bactériennes pour in vitro (par exemple, les sites de liaison de pigment) ou domaine de protéine (par exemple, l'interaction protéine-protéine, pliage). Ce procédé a été optimisé dans plusieurs laboratoires et appliquée à la plupart des complexes collecteurs de lumière. Le protocole décrit ici en détail la méthode de reconstitution des complexes collecteurs de lumière in vitro utilisés actuellement dans notre laboratoire, et des exemples qui décrivent des applications du procédé sont fournis.
Introduction
L'appareil photosynthétique de plantes et d'algues comprennent des protéines membranaires intégrales qui se lient à la chlorophylle a (chl a), b (chl b) et les caroténoïdes (voiture). Ces complexes protéine pigment sont présentes dans l'énergie de lumière de la récolte et le transfert de l'énergie d'excitation dans les centres de réaction, où il est utilisé pour promouvoir la charge séparation 2. Ils sont également impliqués dans les mécanismes de rétroaction de réglementation qui protègent l'appareil photosynthétique des dommages de la lumière élevée 3,4. Les complexes lumière de récolte (SLL) sont constitués d'une grande famille de protéines apparentées à des plantes et des algues 5.
La purification homogène de chaque membre de la famille a été compliquée par les propriétés chimiques et physiques très semblables des complexes. En outre, les procédures de purification entraînent souvent la perte de pigments ou d'autres cofacteurs potentiels tels que les lipides. In vitro représen de reconstitutionts une méthode puissante pour surmonter ces problèmes. Le LHC associé à photosystème II (LHC-II) a été reconstitué premier in vitro par Plumley et Schmidt en 1987 1. Ces chercheurs ont extrait protéine délipidée et pigments séparément à partir de chloroplastes de plantes, et ensuite combiné la protéine dénaturée par la chaleur avec des pigments en présence de lithium dodécyl sulfate (SI), suivie de trois cycles de congélation et décongélation 1. Ils ont montré que les propriétés spectrales des complexes LHC reconstitués étaient très semblables à des complexes purifiés de plantes. La facilité de reconstituer complexes pigment-protéine LHC, probablement en raison d'une caractéristique inhérente à l'auto-assemblage, ainsi que la difficulté d'isoler des complexes purifiés à partir d'organismes, a conduit à l'adoption rapide de la méthode par d'autres chercheurs. La reconstitution de protéines photosynthétiques surexprimé chez Escherichia coli (E. coli) a été obtenue par Paulsen et ses collègues en 1990 6. E. Danscoli, les protéines membranaires surexprimés sont généralement contenues dans des corps d'inclusion, qui leur installations de purification. La reconstitution est réalisée par dénaturation thermique des corps d'inclusion contenant la protéine recombinante en présence de LDS, suivie par l'addition de pigments qui initie le repliement des protéines. Pliage du complexe LHCII est un processus en deux étapes: d'abord, la chlorophylle a est lié en moins de 1 min; deuxième, la chlorophylle b est lié et stabilisé pendant plusieurs minutes 7.
En plus de fournir un aperçu de la dynamique de pliage, lors de la reconstitution in vitro combinée à une mutagenèse dirigée a permis d'identifier des acides aminés spécifiques importants pour la stabilité (par exemple, 8,9) ou de coordination d'un pigment (par exemple, 10). Manipulation des conditions en réglant les paramètres tels que la composition de pigment ou de détergents repliement ont également identifié des éléments critical pour le pliage proprement dit, tel que l'exigence de xanthophylles pour la LHCII complexe (par exemple, 1,11). En outre, l'investigation des propriétés de pigments individuels liés à des complexes a été possible en utilisant des complexes reconstitués in vivo (par exemple, 10).
La méthode décrite ici commence avec isolement de pigments (chlorophylles et caroténoïdes) de l'épinard et l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii. L'expression et la purification d'une protéine de E. LHC coli sous forme de corps d'inclusion est alors détaillée, suivie par la reconstitution de LHC et purification subséquente par colonne d'affinité de Ni. Dans la dernière étape, les complexes reconstitués sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de saccharose à éliminer les pigments libres et apoprotéine déplié. Cette procédure constitue un protocole optimisé comportant plusieurs modifications qui ont été introduites par différents laboratoires surtemps 1,6,10,12 -14.
Protocol
1. Total Pigment Extraction de Epinards
- Homogénéiser une poignée de feuilles d'épinards (~ 20 g) dans 100 ml de tampon de broyage à froid (voir tableau 1) en utilisant un mélangeur pendant 20 secondes.
- Filtrer la solution à travers deux couches d'un tissu en nylon avec un diamètre de pores de 20 um et centrifuger le filtrat à 1500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Reprendre le culot contenant les chloroplastes avec un pinceau doux artistes dans 1 ml de tampon de lavage à froid (voir tableau 1). Une fois le culot est remis en suspension, ajouter 50 ml de tampon de lavage et centrifuger la solution à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant et remettre le culot en douceur (thylakoïdes) dans 50 ml de tampon de lavage (voir Tableau 1).
- Centrifuger la solution à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant complètement. À ce stade, effectuer les étapes suivantes dans l'obscurité, pour éviter l'oxydation des pigments. Ajouter ~ 20 ml d'acétone à 80% tamponné avec du Na 2 CO 3 (voir tableau 1) pour extraire les pigments. Laissez la solution sur de la glace pendant 10 min, vortex de temps en temps.
- Pellet les composants cellulaires par centrifugation à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
NOTE: Si les pigments sont pas complètement extractibles, le culot aura une couleur verte et l'étape 1.6 doit être répété. - Récupérer le surnageant dans une ampoule à décanter. Ajouter 0,4 volumes de diéthyléther, agiter vigoureusement et ouvrir le robinet pour évacuer le gaz.
- Ajouter 0,8 volume de 0,33 M de NaCl et mélanger vigoureusement. Autoriser ~ 10 min pour les couches se séparer. La phase éther sur le dessus contient les pigments extraits. Retirer la phase inférieure claire.
REMARQUE: Si la séparation n'est pas claire, geler et dégeler la solution pour améliorer la séparation de phase. - Enlever l'éther en le versant du haut de l'entonnoir de séparation dans un récipient en verre approprié. Sec en ajoutant une cuillerée de grandu sulfate de sodium anhydre parti-. Agiter la solution et de permettre ~ 5 min pour le déshydratant pour absorber l'eau de l'éther.
REMARQUE: Répétez cette étape si le sulfate de sodium apparaît complètement agglutinées; il devrait y avoir quelques cristaux flottants lorsque l'éther est suffisamment séché. Si la formation d'une couche d'eau, retirer ce avec une pipette Pasteur supplémentaire avant l'addition de sulfate de sodium anhydre. - Décanter l'éther à un nouveau récipient en verre, en laissant le sulfate de sodium solide derrière.
- Evaporer l'éther dans un speedvac rotatif ou sous un courant de N2.
- Dissoudre les pigments complètement dans 10 ml d'acétone à 100%.
- Diluer une petite quantité (~ 3 ul) dans 1 ml d'acétone à 80% et à mesurer les spectres d'absorption et de déterminer la chlorophylle a / b rapport de la concentration de Chl et avec la méthode décrite par Porra et al. (1989) 15.
- Aliquote et sécher les pigments dans un speedvac rotatif ou sous N 2 jusqu'à ce que le flux de l'acétone estcomplètement évaporée. Conserver les pigments secs à -80 ° C.
2 Extraction des caroténoïdes de épinards
- Suivez les étapes 1.1 à 1.5. À ce stade, effectuer les étapes suivantes dans l'obscurité, pour éviter l'oxydation des pigments.
- Reprendre le culot dans thylacoïdes ~ 50 ml d'éthanol à 96% tamponné avec du Na 2 CO 3 (voir tableau 1) pour extraire les pigments. Laissez la solution sur de la glace pendant 5 min.
- Pellet les composants cellulaires par centrifugation à 12 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
NOTE: Si les pigments sont pas complètement extractibles, le culot aura une couleur verte et l'étape 2.2 doit être répété. - Récupérer le surnageant et ajouter 0,1 volume de 80% de KOH (p / v) pour initier la saponification.
- Laisser la solution à 4 ° CO / N, fermé hermétiquement et à l'abri de la lumière.
- Recueillir la solution dans une ampoule à décanter. Ajouter 1 volume d'éther diéthylique et mélanger doucement.
- Ajouter 0,8 volumes de 0,33 M de NaCl et mélanger doucement. Autoriser ~ 10 min pour les couches se séparer. La phase éther d'orange sur le dessus contient les caroténoïdes saponifiés. Retirer la phase inférieure vert par drainage à travers le robinet d'arrêt de l'entonnoir.
- Ajouter 3 volumes d'eau et mélanger doucement pour enlever l'hydroxyde de potassium. Laisser les couches se séparer. REMARQUE: Si la phase supérieure est trouble, ajouter une petite quantité de NaCl (par exemple, 3 g de NaCl dans 200 ml de solution) et agiter doucement pour dissoudre.
- Retirer la phase inférieure par égouttage à travers le robinet d'arrêt de l'entonnoir.
- Suivez les étapes 1.10 à 1.13.
- Diluer une petite quantité (~ 3 ul) dans 1 ml d'acétone à 80% et à mesurer le spectre d'absorption à 440 nm de 80% d'acétone. Pour déterminer la concentration, utiliser l'extinction de coefficient moyen pour les caroténoïdes (ε = 440 255) 16 dans la formule suivante: Voiture [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (trajet optique) = 1 cm.
- Aliquote et sécher le carotenoids dans un speedvac ou sous courant de N2 jusqu'à ce que tout le diéthyléther a été évaporé. Conserver les pigments secs à -80 ° C.
3. total Pigment et caroténoïdes Extraction de Chlamydomonas reinhardtii
- Cultivez C. reinhardtii sur milieu TAP solide 17 dans une boîte de Pétri en étalant une petite quantité de culture liquide sur la surface. Croître sous continu flux d'illumination de 20 pmol de photos PSA m -2 s -1 jusqu'à une couche verte de cellules est visible.
- En utilisant une boucle d'inoculation stérile, récolter une petite quantité de C reinhardtii à partir du milieu solide de TAP et de mettre les cellules dans 500 ml de milieu TAP 17 dans une fiole de 1 L. Cultiver la culture à 25 ° C avec 170 tours agitation sous un flux d'illumination continue de 20 pmol de photos PSA m -2 s -1.
- Après 5-6 jours, la culture doit atteindre la fin de la phase logarithmique (6 x 10 6 cellules / mlou 2-2,5 densité optique à 750 nm). Centrifuger la culture à 4000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Pour l'extraction totale en pigments, suivez les étapes 1.6 à 1.15.
- Le rendement de l'extrait total de pigment à partir de 500 ml de culture de pleine croissance de C. reinhardtii est d'environ 5 ml de solution à une concentration de 0,5 mg chl a + b / ml.
- Pour l'extraction des caroténoïdes, suivez les étapes 2.2 à 2.12.
4. Purification de corps d'inclusion
- Clonage de la séquence codante de la protéine d'intérêt LHC dans un vecteur d'expression qui se traduit par un C-terminal His fusionnés à l'aide de procédures standards de biologie moléculaire. Transformez cette construction dans E. coli souche hôte telle que BL21 (DE3).
- Préparer le tampon de lyse, tampon détergent, Triton tampon TE (tableau 1), M 1-isopropyl β-D 1-thiogalactopyranoside (IPTG) et du milieu LB 18 avec les antibiotiques appropriés.
- Choisissez un single E. colonie coli contenant le clone d'expression à partir d'une plaque fraîchement striée ~ dans 5 ml de milieu LB avec les antibiotiques appropriés à l'aide des procédures standard 6. Croître à 37 ° C avec 220 tours agitation pendant au moins 16 heures.
- Ajouter 2,5 ml de l'O / N culture dans une fiole d'Erlenmeyer de 1 litre avec 250 ml de LB supplémenté avec l'antibiotique approprié.
- Cultiver les cellules pendant 2-3 heures (ou jusqu'à ce que la DO 600 est ~ 0,6) à 37 ° C à 220 rpm.
- Ajouter de l'IPTG à une concentration finale de 1 mM. Continuer à cultiver les cellules à 37 ° C avec 220 tours 3-4 h.
- Centrifuger la culture pendant 10 min à 5000 x g à 4 ° C dans un tube préalablement pesé centrifugeuse. Jeter le surnageant soigneusement et déterminer le poids de la pastille en pesant de nouveau et en soustrayant le poids du tube de centrifugation.
- Remettre en suspension le E. coli culot cellulaire dans 0,8 ml / g de tampon de lyse par vortex vigoureuse.
NOTE: En variante, le culot de cellules peut être congelé à -80 ° CC pour une utilisation ultérieure. Si à partir d'un culot congelé, décongeler totalement à permettre, avant l'ajout du tampon de lyse. - Ajouter 2 mg de lysozyme par gramme de cellules et incuber sur de la glace avec des vortex de temps en temps pendant 30 min.
- Ajouter 20 ug / ml de DNAse, 10 mM de MgCl2, 1 mM de NaCl, 20 ug / ml de RNAse. Vortex et de mettre sur la glace pendant 30 min.
- Ajouter 2 ml de tampon froid de détergent par gramme de cellules. Bien mélanger et garder la température ambiante pendant 5 min.
- Transfert à 2 ml tubes de centrifugation (divisé en deux tubes si nécessaire). Centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d'inclusion.
- Ajouter 1 ml de Triton froid tampon et remettre complètement la pastille par sonication (3 impulsions x 5 sec x puissance de 50% avec 20 secondes d'intervalle). NOTE: Avoir le tube dans un petit bécher entourée par l'eau glacée pour le garder froid pendant le traitement aux ultrasons. Dans le cas de plusieurs tubes, mélanger les corps d'inclusion remises en suspension dans un tube après remise en suspension.
- Centrifuger pendant 10 min à 12 000xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d'inclusion.
- Répétez l'étape 4.13 et 4.14 deux fois.
- Remettre en suspension les corps d'inclusion dans 1 ml de TE avec sonication froid pour un lavage final à retirer le tampon Triton. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C pour sédimenter les corps d'inclusion.
- Reprendre le culot dans 1 ml de TE froid par sonification.
- Évaluer la concentration de la protéine par des procédés classiques tels que le dosage de Bradford 19. aliquotes de magasins des corps d'inclusion à -20 ° C.
5. Reconstitution
Ce protocole donne généralement de 1 à 2 ml de protéine reconstitué avec un diamètre extérieur de 4 lorsque l'absorbance est mesurée dans la région Qy (600-750 nm). Quantité peut être ajusté comme on le souhaite, bien que des précautions doivent être prises pour maintenir les rapports appropriés au cours de la procédure.
- Préparer les solutions suivantes telles que décrites dans le Tableau 1: 2x Reconstitution Buffer, 20% OG, 2 M de KCl, TE. Effectuer le s suivanteteps en faible lumière.
- Remettre en suspension 800 mg de corps d'inclusion du LHC dans un total de 400 pi de TE dans un tube de centrifugeuse de 2 ml. Ajouter 400 ul de la tampon de reconstitution 2x et brièvement de vortex.
- Ajouter 0,6 ul de β-mercaptoéthanol (actions 14,8 M) pour avoir une concentration finale de 10 mM. Chauffer la protéine pendant 1 min à 98 ° C. brièvement Vortex et le lieu à température ambiante pendant 3 min.
- Remettre en suspension 500 mg du total des pigments de chlorophylle séchées plus 80 ug pigments caroténoïdes dans 30 ul EtOH à 100% par vortex vigoureusement pendant 1 min ou dans un bain sonique pendant 1-2 min.
- Spin le mélange de pigments ~ 30 sec à 15 800 g à 4 ° C et confirmer qu'il n'y a pas de culot. S'il existe une pastille, répéter tourbillonnement et / ou la sonification. IMPORTANT: Après la remise en suspension et de spin, ajouter immédiatement pigment à la protéine, ou il peut agréger et devront être remises en suspension à nouveau.
- Lentement, ajouter le mélange de pigment à la protéine refroidi tout en vortex. Continuer à vortex 5-10 sec et placer le tube sur de la glace. Veillez à ne pas vortex trop vigoureusement que la protéine peut déborder la partie supérieure du tube.
- Ajouter 94 ul de 20% octyl β-D-glucopyranoside (OG) (concentration finale de 2%), brièvement vortex et garder sur la glace 10 min.
- Ajouter 90 ul de KCl 2 M (concentration finale 150-200 mM), vortex brièvement et garder sur la glace 20 min. REMARQUE: Préparation de la colonne (section 6) peuvent être lancées à cette époque.
- Spin pendant 10 min à 15 800 g à 4 ° C. Eliminer le surnageant sans perturber le culot (précipité LDS) à un tube de 10 ml. Réserver au froid et à l'abri de la lumière.
Colonne 6 Nickel Purification
- Préparer les solutions suivantes de la manière décrite dans le tableau 1: tampon de OG, OG tampon de rinçage, un tampon d'élution.
- Connectez une colonne Ni-Sepharose (1 ml) ou l'équivalent d'une pompe péristaltique assurant que l'air ne pénètre à l'intérieur de la colonne au cours de cette étape et les étapes suivantes.
- Réglez la vitesse de til Pompe à 1 ml / min et rincer la colonne avec 5 à 10 ml d'eau pour éliminer la solution de stockage.
- Équilibrer la colonne avec 3-4 ml de tampon OG.
- Ajouter 3-4 ml de tampon OG à l'échantillon de protéine et de la charge de la colonne. REMARQUE: si la protéine a été assis sur la glace pendant plus de 10 minutes après le retrait de LDS, tourner à nouveau à 15 800 g à 4 ° C pendant 1 min pour éliminer toute précipitation LDS supplémentaires.
- Rincer la colonne avec 5 ml de tampon OG.
- Rincer la colonne avec 2 ml de tampon de rinçage OG.
- On élue la protéine liée avec 3 ml de tampon d'élution. Recueillir l'éluat vert qui contient la protéine reconstituée. REMARQUE: Il s'agit généralement d'environ 1 ml au total.
7. gradient de saccharose centrifugation
- Préparer les solutions suivantes de la manière décrite dans le tableau 1: solution de saccharose, 0,06% de β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6.
- Remplir des tubes d'ultracentrifugation avec la solution de saccharose et congeler à -20 ° CO / N or à -80 ° C pendant au moins 1 heure.
- Retirer le tube du congélateur et laisser décongeler tranquillement à 4 ° C. REMARQUE: le processus de congélation / décongélation crée un gradient de 0,1 à 1 M de saccharose. Un tube de 15 ml dégèle typiquement en environ 3 heures.
- Retirez délicatement par le haut le même volume que la fraction verte élue de la colonne de Sepharose nickel à l'étape 6.8. Ensuite, charger l'échantillon reconstitué sur le dessus lentement pour éviter de perturber le gradient.
- tubes de l'équilibre et de spin à 200 000 xg à 4 ° C en ultracentrifugation l'aide d'un seau rotor SW-41 ou SW-60 oscillant pendant 18 heures, mis à ralentir l'accélération et l'arrêt sans freins.
- Sortez soigneusement le gradient de support de tube avec une pince. Utiliser une seringue avec une aiguille longue qui présente une ouverture brutale de recueillir la fraction de la partie supérieure. NOTE: En variante, recueillir des fractions à partir du fond du tube par perçage avec une aiguille et en recueillant les gouttes.
Representative Results
Ce protocole décrit en détail une méthode pour reconstituer les protéines de liaison chorophyll a / b in vitro. Cette technique permet le pliage de ces complexes pigment-protéine in vitro à partir de l'apoprotéine, qui peut être obtenu par surexpression dans un système hétérologue et des pigments extraits de plantes ou d'algues. Après reconstitution, le complexe pigment-protéine repliée est purifié de l'excès de pigments et l'apoprotéine plié en deux étapes. La première étape (figure 1 AB) est basée sur la présence d'un marqueur His à l'extrémité C-terminale de la protéine, ce qui permet l'élimination d'une grande partie des pigments non liés. La deuxième étape de purification utilise la centrifugation en gradient de densité de saccharose, (figure 2) où la protéine dépliée migre généralement plus lente que la bande verte contenant la protéine reconstituée. Le but de la reconstitution in vitro est d'obtenir des complexes avec le même bonliens que les natifs. Pour illustrer ce résultat, les propriétés spectroscopiques d'un complexe in vivo lumière récolte est comparé avec le même complexe LHC reconstitué in vitro 13,20,21. Le spectre d'absorption de la SLL dans le domaine visible (350 nm et 750 nm) dépend de la composition de pigment de complexe, ainsi que sur l'environnement du pigment (qui comprend la protéine) et il est par conséquent un outil sensible pour contrôler la qualité de la reconstitution. Sur la figure 3, le spectre d'absorption de CP24, une chlorophylle a / b protéine d'Arabidopsis thaliana, reconstitué in vitro de liaison, est comparé avec le spectre de la même complexe purifié à partir de 21 Arabidopsis thylakoïdes. Dans les spectres, il est possible de reconnaître la Qy et la transition de Soret (Chl a des pics à 671/439 nm) et b (Chl pics à 649/466 nm). Les complexes natifs et reconstituées montrent identique absoLes spectres de rption, indiquant une composition de pigment pratiquement identique et leur organisation. La spectroscopie de fluorescence peut être utilisée pour évaluer la qualité du complexe reconstitué. Les spectres d'émission de fluorescence est mesurée lors de l'excitation à différentes longueurs d'onde, qui excitent préférentiellement différents pigments: Chl a à 440 nm, Chl b à 475 nm, et Xanthophylles à 500 nm. Dans un complexe protéine-de pigment correctement repliée, Chl b et xanthophylles transfèrent leur énergie d'excitation principalement de Chl un espace de quelques picosecondes, et la fluorescence provenant d'un système en équilibre thermique résultant en un pic unique avec la même forme et les maxima de tous les trois excitation les longueurs d'onde (figure 4A-B). La présence de Chl b non coordonné à la protéine peut être reconnu par un pic ou épaulement supplémentaire autour de 650 nm à 475 nm d'excitation (Figure 4C). La présence de libre Chl mène une placeà l'émission supplémentaire autour de 675 nm, ce qui est principalement présente sur 440 nm excitation. Les spectres d'émission de fluorescence à 475 nm d'excitation à la fois reconstitué et les complexes CP24 natifs (figure 4D) correspond à un seul pic à 681 nm, ce qui indique que complexe reconstitué est correctement repliée. Une confirmation supplémentaire que le complexe pigment-protéine est correctement reconstitué vient de dichroïsme circulaire (CD) des mesures. Le signal de CD dans la région visible dépend des interactions excitoniques entre pigments et il est donc très sensible à même de petits changements dans l'organisation des chromophores 22. Figure 5 montre les spectres CD reconstituée et natif CP24, avec les pics typiques d'empreintes digitales au 681 nm, 650 nm et 481 nm. En conclusion, la grande similitude entre les propriétés spectroscopiques de maternelle et le CP24 reconstitué confirme que complexes, les rendements de la procédure de reconstitution de type natif suita Blé pour l'étude in vitro des protéines collecteurs de lumière.
Figure 1: Représentation de la purification des protéines LHC recombinantes avec un marqueur His en utilisant une colonne de nickel. (A) Au cours de la purification, marquée par His protéines, composé de deux complexes reconstitués (hexagonaux vert) et les protéines non reconstitué / agrégé (orange hexagone) sont liés à la surface de la Ni-Sepharose (point bleu), tandis que les pigments non liés (petites taches de couleur) traversent. (B) Lorsque la colonne est lavée avec le tampon d'élution contenant de l'imidazole, les protéines reconstituées et un-reconstituée sont collectées dans le flux à travers.
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Figure 2 gradient de saccharose de LHCII reconstitué après purification par colonne de nickel. Reconstitués Les complexes sont séparés du pigment libre par le gradient de densité. La bande vert foncé représente LHCII reconstitué et le fond vert pâle est composée de pigments libres.
Figure 3 Spectres d'absorption de protéines reconstitué CP24 (rCP24, ligne rouge) et celui d'origine (nCP24, ligne noire) isolé d'Arabidopsis thaliana. Dans les deux spectres, il est possible de reconnaître la Qy et la transition Soret de Chl a (pointes à 671/439 nm) et Chl b (pics à 649/466 nm). Ce chiffre a été modifié depuis Passarini et al. 2014 21.
Figure 4 de spectres d'émission de fluorescence. L'spectres d'émission de fluorescence du complexe reconstitué CP24 de type sauvage (A) et normalisées par rapport à la valeur maximale (B) indiquant un transfert d'énergie efficace de Chl et b Xanthophyls à un CHL. (C) Fluorescence spectres d'émission de CP24 reconstitué (rCP24) et le complexe natif (nCP24) isolé d'Arabidopsis thaliana. Les spectres sont normalisés au maximum du pic (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 dichroïsme circulaire Spectra. Reconstitué CP24 (rCP24, ligne rouge) et le natif complexe (nCP24, ligne noire) isolé d'Arabidopsis thaliana montre spectres très semblables.
Figure 6 Spectres d'absorption de CP29 type sauvage (CP29_WT) et muté CP29 (CP29_A2). La ligne verte montre les différences entre les deux parcelles.
| Tous les tampons peuvent être stockés à 4 ° C. | ||||||
| Composants | Concentration finale | Notes complémentaires | ||||
| Rectification tampon | Sorbitol | 0,4 M | ||||
| Tricine | 0,1 M | pH 7,8 | ||||
| NaCl | 10 mM | |||||
| MgCl2 | 5 mM | |||||
| Poudre de lait | 0,5% p / v | |||||
| Le tampon de lavage | Sorbitol | 50 mM | ||||
| 5 mM | pH 7,8 | |||||
| EDTA | 10 mM | pH 8 | ||||
| Lysis Buffer | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| Saccharose | 2,5% p / v | |||||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| tampon de détergent | NaCl | 200 mM de NaCl | ||||
| L'acide désoxycholique | 1% p / v | |||||
| 1% p / v | ||||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| EDTA | 2 mM | pH 8 | ||||
| bêta-mercaptoéthanol | 10 mM | |||||
| Triton tampon | Triton X-100 | 0,5% p / v | ||||
| Tris | 20 mM | pH 7,5 | ||||
| bêta-mercaptoéthanol | 1 mM | |||||
| Tampon TE | Tris | 50 mM | pH 8 | |||
| EDTA | 1 mM | pH 8 | ||||
| Reconstitution Buffer | HEPES | 200 mM | ||||
| Saccharose | 5% p / v | |||||
| Lithiumdodecylsulfate (LDS) | 4% p / v | |||||
| Benzamidine | 2 mM | |||||
| Aminocaproïque | 10 mM | |||||
| OG tampon | Octylglucoside | 1% p / v | ||||
| 12,5% en poids / volume | ||||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| HEPES | 20 mM | |||||
| Imidazole | 10 mM | |||||
| OG Rincer tampon | n-dodécyl-bêta-D-maltoside (DM-β) | 0,06% p / v | ||||
| HEPES | 40 mM | pH 7,5-9 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Tampon d'élution | Imidazole | 0,5 M | ||||
| 0,06% p / v | ||||||
| HEPES | 40 mM | pH 8 | ||||
| NaCl | 0,2 M | |||||
| Solution de saccharose | Saccharose | 20% p / v | ||||
| n-dodécyl-bêta-D-maltoside (DM-β) | 0,06% p / v | |||||
| HEPES | 0,01 M | pH 7,6 | ||||
| Acétone 80% tamponné avec du carbonate de sodium | Acétone | 80% v / v | Carbonate de sodium | 1 M | ||
| Ethanol 96% tamponné avec du carbonate de sodium | L'éthanol | 96% v / v | ||||
| Carbonate de sodium | 1 M | |||||
Tableau 1 Liste des tampons et des solutions utilisées dans ce protocole.
| Chla a / b mélange | Chla | Chl a | Chl b | Neo | Alto | Luth | Chl tot | Chl / Car | | |
| nCP26 | - | 2,2 ± 0,05 | 6.2 | 2.8 | 0,61 | 0,38 | 1.02 | 9 | 4,5 ± 0,1 |
| rCP26 | 8 | 2,71 ± 0,05 | 6,57 | 2.43 | 0,72 | 0,32 | 0,97 | "> 93,9 ± 0,04 | |
| rCP26 | 5.5 | 2,25 ± 0,05 | 6.23 | 2,77 | 0,77 | 0,3 | 0,96 | 9 | 4,0 ± 0,1 |
| rCP26 | 3 | 2,08 ± 0,04 | 6,08 | 2,92 | 0,76 | 0,3 | 1,04 | 9 | 4,1 ± 0,1 |
| rCP26 | 1 | 1,7 ± 0,05 | 5.7 | 3.3 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4,3 ± 0,05 |
| rCP26 | 0,3 | 1,11 ± 0,04 | 4.7 | 4.28 | 0,7 | 0,3 | 0,9 | 9 | 4,2 ± 0,2 |
| 0,05 | 0,23 ± 0,01 | 1.4 | 5.6 | 0,58 | 0,24 | 1.11 | 7 | 3,1 ± 0,06 | |
| rCP26 | <0,01 | 0,11 ± 0,01 | 0,7 | 0,64 | 0,3 | 1,08 | 7 | 3,06 ± 0,06 |
Tableau 2 teneur en pigment de CP26 natif complexe par rapport à reconstituées complexes protéine-pigment avec différents Chl a / b Ratios 39.
Discussion
Les protéines membranaires ne sont pas si faciles à étudier. Isolement des protéines de la membrane d'origine est compliquée par la nécessité de solubiliser la bicouche lipidique avec des détergents, ce qui peut endommager la protéine et éliminer cofacteurs essentiels. Ces protéines peuvent également être présentes à de faibles niveaux dans les membranes biologiques, ou être mélangés avec des protéines étroitement apparentées, comme dans le cas des complexes collecteurs de lumière, qui permet la purification des complexes simples difficiles. Expression de la protéine hétérologue dans E. coli et dans la reconstitution in vitro offre la possibilité d'éviter ces problèmes. reconstitution in vitro et la purification de protéines repliées résultats dans des complexes possédant des caractéristiques très semblables à celles des complexes natifs 20,21,23 et donc peut être utilisé pour étudier des complexes qui ne peuvent être purifiés jusqu'à homogénéité 24 - 27.
Cette méthode utilise les épinards, qui est facilement attainable long de l'année, en tant que source pour les pigments caroténoïdes totaux et préparations. Pour certaines reconstitutions de protéines natives pour les algues, l'utilisation de pigments purifiés à partir d'algues est préféré en raison de compositions de pigments différents. La Chl a / b et rapport Chl rapport qualité / voiture reste la même indépendamment de la source de pigment.
Il est important de réaliser que l'efficacité de la reconstitution est généralement autour de 35% 28. Ainsi, il est nécessaire d'enlever les pigments non-liés et l'apoprotéine dépliée à partir de la solution après la reconstitution. Un protocole de purification en deux étapes est présenté dans ce protocole (voir aussi des résultats). Cependant, il convient de noter que l'étape de gradient de saccharose ne permet pas la séparation complète de apo et holo-protéine. Pour la plupart des analyses, ce n'est pas un problème, comme l'apoprotéine ne contient pas de pigments et ainsi n'interfère pas avec les mesures fonctionnelles. Toutefois, dans le cas où il est nécessaire de supprimer complètement l'apoprotéine de la frune action contenant le complexe reconstitué (par exemple, pour calculer le pigment de protéine stoechiométrie), une colonne d'échange anionique peut être utilisé (voir Passarini 2009 29 pour plus de détails et al.).
La capacité de replier les protéines recombinantes lumière de récolte avec des pigments isolés in vitro donne l'occasion de «manipuler» les complexes en modifiant la reconstitution «environnement» de différentes façons, ce qui modifie les caractéristiques du complexe résultant. Par exemple, en changeant la composition de pigment pendant la reconstitution peut se traduire par un complexe avec la composition de pigment modifiée. Cette fonction peut être utilisée pour étudier l'influence de divers pigments ont sur la structure et la stabilité du complexe. Habituellement, la préparation de pigment obtenue à partir d'épinard a une Chl a / b rapport de 3: 1 et un rapport a / Chl voiture de 2,9: 1. Ce rapport donne typiquement une protéine reconstituée avec les mêmes propriétés que le nAtive un. Cependant, le réglage de la chlorophylle a / b rapport par l'addition d'un ou Chl b purifié peut influencer la liaison de différents pigments en raison de la sélectivité des sites de liaison différents au 30 - 33. Cela est possible parce que la plupart des sites de liaison de pigments ne sont pas totalement sélective pour Chl un ou Chl b, mais peut accueillir à la fois, mais avec des affinités différentes 10,30,34. De la même manière, les sites de liaison de caroténoïdes ont également été présentés pour être en mesure d'accueillir plus d'une espèce de xanthophylle 8,35 - 38. Différentes reconstitutions de CP26, un autre complexe pigment-protéine de plantes supérieures, en utilisant diverses compositions de pigments sont présentés dans le tableau 39 2. Ces reconstitutions ont été utilisés pour évaluer l'affinité des sites de liaison 39 particulier des pigments. Il est intéressant de noter que, pour obtenir un complexe avec le même pigment composition que celui d'origine, la Chl rapport a / b de pigment mélange doit être de 3: 1. Cela semble être le cas pour tous les complexes du LHC de plantes supérieures 20,40.
La combinaison de la biologie moléculaire de la technique permet de reconstitution les propriétés d'un complexe de liaison à la chlorophylle être étudiés plus en détail. L'importance des différents domaines protéiques sur la stabilité et le pliage des complexes, ou leur implication dans les interactions protéine-protéine, ont été déterminées en tronquant l'apoprotéine ou effectuer une mutagenèse aléatoire 8,41 - 44. Résidus importants pour la coordination des différents pigments seul acide aminé peuvent être modifiés par mutagenèse dirigée afin d'analyser les propriétés de différents pigments ou d'évaluer leur contribution à la fonction et la stabilité du complexe 10,28,29,45 - 52. Figure 6 montre reconstitués Lhcb4 (CP29) avecune mutation de l'histidine en position 216 53. Une comparaison de la composition de pigment de type sauvage et mutantes de complexes indique que la mutation provoque une perte de la Chl une molécule, ce qui indique que le site ciblé reçoit un Chl un complexe dans le WT. Les différences des spectres d'absorption de WT et mutant, à la normalisation de la teneur en pigment, montre aussi les propriétés d'absorption du pigment perdue. Dans ce cas, la différence peut être vu dans le pic principal à 680 nm, ce qui indique que la Chl a coordonné par His216 absorbe à cette longueur d'onde (pour plus de détails sur ce mutant et les propriétés spectroscopiques voir Mozzo et al., 2008 53). L'analyse des mutations peuvent également être utilisés pour déterminer l'effet de l'environnement sur les propriétés spectroscopiques des pigments 54.
En conclusion, les protéines de collecteurs de lumière peuvent facilement être reconstitués in vitro résultant en pigment-protein complexes avec des propriétés très similaires aux complexes indigènes. De cette façon, les difficultés de l'isolement des protéines natives sont éliminées, tout en offrant la préparation de protéine avec un rendement élevé et de pureté pour une étude plus approfondie. L'importance d'un rapport de 3: a / b de la chlorophylle dans une production d'un complexe authentique est souligné, et des exemples de type sauvage reconstitué et SLL mutantes sont fournies pour illustrer les applications de la technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Nylon cloth | 20 μm pores | ||
| Soft artists paint brush | |||
| NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
| Beta-DM | Sigma | D4641 | |
| DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
| Milk Powders | |||
| RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
| Sonicator | |||
| Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
| Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
| TAP medium | see reference 17 | ||
| LB medium | see reference 19 |
References
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