Introduction
細菌ボツリヌス菌はボツリヌス神経毒、男1に知られている最も強力な生物毒素の1を生成します。 7明確なのBoNT血清型（のBoNT / AG）があります。のBoNT / A-ガルによりSNARE複雑なタンパク質分解2,3に神経筋接合部で麻痺を誘発する。 SNAREタンパク質分解は、神経伝達物質小胞の膜融合を防止し、したがって、ブロックはエキソサイトーシス4神経伝達物質。特定のSNAREターゲットは中毒過程に関与する特定のBoNT血清型に依存します。のBoNT / AおよびBoNT / E切断するSNAP-25のBoNT / Cを切断SNAP-25およびシンタキシン5両方のに対し。また、小胞関連膜タンパク質（VAMP）と呼ばれる残りの血清型クリーブシナプトブレビンは（。BoNT / Aには、それが天然に存在するボツリヌス中毒の割合が高いために責任があるとして、アッセイ開発のために選択された小分子の作用6。開発の最長持続時間を有した。 BoNT / A型に対する治療薬はのための主要な目標である創薬プログラムと活性部位のタンパク質分解阻害剤7、8-10を識別するために、従来のターゲットベースの方法を利用している。しかし、複数の血清型と、露光後の有効性に対する広域スペクトル活性を有する活性部位阻害剤の作成が困難な可能性が高いであろう。
したがって、我々は、のBoNT媒介運動ニューロン中毒をブロックすることができる小分子を同定するための機能的なエンドポイントとしてのBoNT SNAP-25の切断を使用して、革新的な、表現型の創薬アプローチを実施しています。 SNAP-25の分解はin vivoでの麻痺や致死性の予測となるようにSNAP-25は、神経伝達物質放出のために必要とされる。例えば、細胞ベースのスクリーニングは、毒素の不活化または標的細胞内部で毒素経路の阻害に関与する細胞因子の新たな調節因子の発見につながる可能性があります。表現型アッセイの開発における重要な因子は、生理学的に関連する生物学的モデルを選択することである。 WEなどは、SNAP-25 11- 13の発現を含む一次運動ニューロンの免疫学的性質を再現するマウス胚性幹（ES）細胞由来の運動ニューロンを、説明してきた。重要なことに、これらのセルラーシステムは、BoNT / A中毒に非常に敏感であり、毒素11,12の濃度を増加さに応じて、SNAP-25の用量依存的切断を実証している。分化した運動ニューロンはまた、ハイスループットプレートベースの分析のために十分であり、細胞アッセイのアレイの設計を可能にした量で産生される。
表現型のアッセイは、BoNT /マウスの運動ニューロン培養物の中毒の間内因的に発現完全長SNAP-25の切断を定量化するために二つの別個の抗体を利用する免疫蛍光法である。唯一の完全長SNAP-25を認識し、カルボキシル末端のBoNT / A切断感受性（BACS）抗体は、BoNT / Aの評価は、SNAP-25のタンパク質分解を仲介できますマウスの運動ニューロンにおける発現10。 HCIアッセイの概略図を図1に示されている。
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Protocol
プレート2万差別化マウスES細胞（MES）/ 96ウェルポリ-D-リジンコーティングしたプレートに5〜7日間運動ニューロン分化培地中で維持する。
のBoNT / A 1.化合物投与と中毒
CDC / NIHガイドラインの遵守を維持するために、BSL2エンクロージャに以下のすべての作業を実行します。
- ポリプロピレン製96ウェルプレートに100％DMSO中の各ライブラリー化合物の10mMストック溶液を調製する。所望のスクリーニング濃度よりも10倍大きい中間希釈プレートを調製するために10mMのストックを使用する。 96ウェルプレートに10 mMストックを分配することによって100μMの中間板を準備し、培養培地を使用して、100μMのに希釈する。セル11上のメディアの90μlの上の化合物の10μlを分注する。 10μMの最終濃度で化合物を試験し、DMSOの最終的な割合が、0.5％を超えないように保証する。
- すべてのスタッドを実行バイオセーフティーレベル2の条件で、生細胞と活性毒素を利用IES。 12チャネルのマニュアルピペットを用いて、新鮮な最終分化培地を80μlの96ウェルプレートで古いメディアを交換してください。吸引を行い、外気にメディアを使用せず細胞の曝露を避けるために、行単位でのステップを分注する。
- 吸引（2回）によって混合した12チャンネルピペットを使用してソースプレートからの10倍の化合物10μlを添加することにより、従来の毒素の適用化合物で細胞を前処理する。各96ウェルプレートの場合は、のような高信号と低信号のコントロールを提供するために培地で希釈し、10倍のDMSOで6ウエルの2つの列を扱う。のBoNT処理なしの列は、完全長SNAP-25（高信号制御）の最高レベルを示す。低信号制御などの（任意の化合物を含まない）を単独のBoNTを持つ他の列を扱います。 SNAP-25およびBACS抗体とその検出（ 図2ののBoNT切断の効率を観察するために低コントロールを使用して、）。
- 細胞培養インキュベーター中で37℃で30分間、化合物および6％CO 2で細胞をインキュベートする。
- リン酸中1mg / mlの市販の供給源からのボツリヌス神経毒Aを調製ターミナル分化培地で希釈して、最終的な10倍ワーキングストックに緩衝食塩水（PBS）。
- マルチチャンネルピ ペット（ 図2）を用いた治療と低信号のコントロールのために指定ウェルに10倍のBoNT /株式10μlのを追加して中毒を開始します。培地単独で高いコントロールとして指定された井戸を扱う。
- 少なくとも20分間、水中の0.825パーセントの次亜塩素酸溶液中に浸漬することにより、研究中のBoNT / Aと接触するすべてのプラスチックの構造および他の消耗品を除染。バイオセーフティキャビネット内のすべてのプロシージャを実行し、そのようなマイクロケム液として5％の洗剤除菌洗浄剤を用いた実験の前と後の両方の作業領域を除染。
- 毒素の使用とincubを示すためにはっきりとプレートにラベルを付ける細胞培養インキュベーター中でCO 2、37℃で4時間および6％を1nM / LのBoNT / Aで処理されたプレートを食べた。毒素は、実験室で使用されていることを同僚に知らせるために、適切な看板を表示する。
- ストップBONT /メタノール固定によるタンパク質分解切断。マルチチャンネルピペットで各ウェルから毒素および化合物を含む培地を取り出し、10％の漂白剤溶液中に捨てる。各ウェルに直接氷冷メタノール（100μl）を追加します。
- 固定が起こることを可能にするために室温（RT）で15分間、プレートをインキュベートする。
- 固定後、無事に1プロトコルバイオセーフティーレベル（中和考えられる）廃棄された試薬を処理し、それに応じて捨てる。
- メタノールを捨て、細胞を洗浄し、免疫染色前にそれらを再水和するために100μlのPBSを使用しています。二つの追加PBS洗浄を行います。
- 最終洗浄後、分析まで4℃でマイクロプレート接着フィルムや店舗を有するウェル、シールプレート内のPBSを残す。 4℃FOで保存プレート数日rを。
2.免疫染色
免疫染色手順は、反復的な試薬の分注/吸引サイクルと重要な内陸地震と変動の潜在的な導入につながる可能性が大規模なプレート洗浄を含む労働集約型、多段階の操作です。半自動化されたアプローチは、実験者の時間を節約するアッセイのスループットを増加させ、免疫染色のばらつきを最小限にするために適用される。
- このプロトコルのモジュラーデッキ上の異なる場所（材料および機器を参照）に実験器具を移動するために、ロボットグリッパアームで最大250μLまでと一体化ボリュームを転送できる96ウェルヘッドを備えた自動化されたワークステーションを使用してください。
- モジュラーデッキは実験器具の異なるタイプをホストするように設計されており、一度に最大11項目をサポートすることができる。自動マイクロプレートハンドラーは保持するために、デュアルマガジンマイクロプレートスタッカーを備えているとサイクル当たり50プレートまで操作する。
- 自動化されたワークステーションは、無菌性と安全性を提供するために、実験室の自動化機器用に設計されたクラスIIバイオセーフティキャビネットの内側に位置しています。自動免疫染色のために、デッキは、 図3に示すように、必要に応じて試薬のアクセスを可能にするために配置され、人間の介入なしている。
- 液体取扱い業務のために必要に応じてデッキにプレート雑誌や転送に固定された細胞を含む予圧プレート。ダウン10μlに井戸からPBSを吸引する250μlの先端装備96ピペットヘッドを使用してください。透過化緩衝液（0.1％のTriton-X 100）を用いて細胞内標的に結合する抗体を容易にするために、細胞膜を透過性にする。室温（RT）で15分間のインキュベーションのためにマイクロプレートスタッカーの第保管マガジンにプレートを返す前に、各ウェルに透過化緩衝液（100μl）を分配する。
- 透過化バッファとPEを削除PBS（2回）とrformプレート洗浄は、先にステップ1.13に記載されて。
- 最後の洗浄工程の後、PBS緩衝液を除去し、すべてにPBS中1％ウマ血清および0.1％Tween 20を含むブロッキング緩衝液100μlを分注RTで1時間インキュベートし、プレートマガジンに戻す前に、マイクロプレート。
- （材料および機器を参照）神経細胞の検出のための完全長SNAP-25マウスモノクローナル抗IIIチューブリン抗体の検出のために、ウサギポリクローナル抗マウスBACS抗体：免疫染色のための2つの一次抗体を使用する。インキュベーションの60分後、ブロッキングバッファー削除し、すべてのプレートにブロッキングバッファー中BACS抗体の4ug / mlの50μlの及びIIIチューブリン0.5μgの/ mlに分注する。
- RTで1時間インキュベートした一次抗体を除去し、0.05％のTween（PBST）を含むPBS100μlで3回洗浄する。
- アレクサFでタグ-IIIチューブリンおよび抗ウサギIgGを可視化するアレクサフルオロ647標識抗マウスIgGを使用BACS抗体を可視化するluor 568。ブロッキング緩衝液中2μg/ mlの希釈として両方の抗体を調製し、各ウェルに混合液50μlを分注する。
NOTE：免疫染色のために選択された二次抗体は、ハイコンテントイメージャの検出器内の異なるチャネルを使用して異なる波長で、その発せられた蛍光の検出を可能にするために、異なる蛍光体で標識されている。 - 室温で1時間インキュベートする。二次抗体を吸引し、PBST100μlで3回洗浄する。
- 最終洗浄後、核を検出するためのDNAを染色するためにHoechst色素（32μM）を含む100μlのPBSを追加。
- 光退色から蛍光団を保護するために、光透過性フィルムでプレートをシール。プレートを4で保存することができる 信号の有意な損失なしに数週間のために、Cを°。
3.イメージング
注：ハイコンテントイメージングのSysを使用して画像取得を実行TEM（材料および装置を参照してください）。
- ハイコンテントイメージャ定義の仕様：
- セレクトプレートタイプ、レイアウト、フィールドの数、目的：グライナーU澄んだ、20X水をそれぞれ96ウェルフォーマット、16、。
- セレクトチャンネル：核励起EX：チャンネル4としては405nm。細胞質EX：チャネル2と644 nmの。抗原特異的抗体チャンネルEX：561チャンネル3としてnmおよび各レーザのセットアップ励起パワー、2エクスポージャーとしてセットアップ実験、644 nmで1励起、405 nmおよび561 nmにおける2励起による露光2の露光1。ビン2としてビニングを選択します。
- SNAP-25チャネルおよび最小強度のための低対照ウェルのような最大強度の露出を最適化するために、高いコントロールウェルを使用する。
- 各チャネルの強度が飽和レベル（2,000〜2,500相対単位）の約半分になるように、露出を調整する。
- デルタ補正スクリプトを使用して、細胞マスクチャネルに最適なZ平面を識別する。 Fiを提供して参照してください。免疫染色およびイメージング後の結果のためのグレ5。画像解析ソフトが常駐しているサーバへデータをエクスポートします。
4.画像解析（図6）
注：次の手順は、コロンバスソフトウェアアルゴリズムの適用を説明します。
- プライマリ·オブジェクト（核）セグメントに適切なアルゴリズムを選択します。必要に応じて、背景閾値及びコントラストパラメータを調整する。コロンブス·ソフトウェアは、4核検出法を提供する。視覚的に（Mが選択されているF igure 6aの方法で）セグメント化された核を検査することによって、正確にメソッドそのセグメント核を選択します。
- 必要に応じて、セグメントに神経突起を神経突起アルゴリズム（CSIRO神経突起分析2）を選択して背景を削除するには、バックグラウンドのしきい値とコントラストのパラメータを調整する。神経突起を検出するために使用されるパラメータについて、図6bを参照してください。
- 神経突起領域（神経突起セグメント）浅を識別マスク（ 図6c）として、β-IIIチューブリンチャネル（アレクサ小麦粉640）の-3画素拡張を使用して、セカンダリ·オブジェクト（神経突起）に編。
- 神経突起領域およびβ-IIIチューブリンチャネル（ 図6d＆6E）用の信号チャネル（SNAP-25、（アレクサ小麦粉568）の強度を計算します。
- そのような神経突起の長さが、SNAP-25の平均強度は、β-IIIチューブリン、核数、神経突起セグメント番号等 （ 図6F）などの輸出用必要なパラメータを選択します。
- 画像取得のためのハイコンテントイメージャへのロボットとロードを使用して、プレートスタッカからの転送プレート。
5.データ分析：
設計されたアッセイの頑健性を評価するために、プレートベースの実験から、以下のパラメータを計算する。
- バックグラウンド信号（B）から（S）：S / B = Hの信号制御の平均強度）/ロー信号制御の強度を意味する <液体ハンドリングの変動を決定するために、CV =（標準偏差（SD）のサンプル/平均値）×100（％）：LI>シグナルとバックグラウンドの変動係数（CV）は、（特定の信号の均一性を測定する）試薬など
- ノイズに対する信号：Sは、= - 低コントロールの/ SDを（信号の強さを意味する低い信号制御の強度を意味する）
- 1 96ウェルプレートの半分、残りの半分のモック中毒の中毒とのZ '係数を計算。 Z '= 1 - 3 *（低信号制御の高信号制御+ SDのSD）/（高信号制御の平均 - 低信号制御の平均を）。スクリーニングデータの更なる分析のために、プレート間および実験の異なる日の間の比較を可能にするためにプレート毎に主原料いくつかのパラメータを正規化する。
- ％胸の谷間= 100％*（MEA：全長SNAP-25特異的抗体によって検出された（BACS）に関連する信号の減少を反映して切断のパーセント、高い信号制御のn個の強度 - 試料の強度）/高い信号制御の強度を意味する。
- 切断の阻害のパーセント：％阻害= 100％*（サンプルの強度 - 低信号制御の平均強度）/（高信号制御の強度を意味する - 低信号制御の強度を意味する）。
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Representative Results
ハイとローのコントロールからのデータは、3標準偏差（図7A）を超える2中央値の差が2の異なる集団を作成しました。スクリーニングプロセスの目標は、サンプル集団（ 図7B（i））を内正規分布を仮定し、近い正の対照集団に対する値とサンプル集団内の化合物を見出すことである。平均の3標準偏差を超えているデータ点は、ノイズ統計的に異なると考えられ、アクティブな「ヒット」（ 図7（b）（ii）は 、赤のボックス）として分類される。 「ヒット」として分類される化合物は、今後の研究でさらに確認試験に供される。 図7（b）（ii）は、遮蔽板の代表的なサブセットからのサンプルの集団における陽性ヒットの検出を示す。より低い値を有していた全ての4点（中央値のサンプル - 3 *サンプルのSD）はに属していた4つの異なるスクリーニングプレート内の異なる位置にスポットした同じ阻害剤。 図5に示すように、この阻害剤は、のBoNT / Aに対してロバストSNAP-25の保護を示した。
図1：BoNT / A型HCIアッセイにおける化合物スクリーニングのためのワークフロー。
図2：HCIアッセイのため、96ウェルプレートマップ高対照ウェル（ピンク）のみの対照とは1nMのBoNT / Aおよび0.5％DMSOで処理した低対照ウェル（青）として0.5％DMSOで処理した。試料ウェル（緑）は1nMの毒素および0.5％DMSO中の化合物10μMで処理した。外側の列と行（灰色）が最適化されたプレートのために互換性がないため使用されなかったマットと画像エッジウェルに20X水浸対物レンズの無能。
図3：免疫染色アッセイのための自動化ワークステーションのデッキの設計ブロッキングバッファー、一次抗体、二次抗体及び細胞染色は、デッドボリューム試薬の損失を低減するために、96ウェルポリプロピレンプレートに分配した。 PBSを300mlを保持可能なトレイに分注した。液体廃棄物の吸引に使用されるマニホールドは、挿入画像に表示されている。
図4：セットアップハイコンテントイメージャ実験のスクリーンショット。
図6：画像解析パイプラインにおける様々なステップを示すスクリーンショット。
図7：HCI画面から生じるデータの統計視覚化。 （A）。対照ウェルから計算％切断の（i）のボックスプロット分析。それぞれSDた（n = 16）での中央値として示す。ピンク色は、高い信号制御（HSC）を表す。青色は、低い信号制御（LSC）を表す。 Z 'は、= 0.97（ii）は、（i）と同じ値のヒストグラム分布つの制御集団との間の距離を実証する。中央値およびSD 3は、対応するボックスプロットに関連付けられた統計値から算出した。（B）。 192化合物の分布が同じ実験からのサンプルを処理した。 （ⅰ）ボックスプロットは、対照と比較してのサンプルについて％の切断のための統計値だけでなく、統計的に有意な外れ値を示した。 （ii）および（iii）は、画面の全データの集団における同じ値のヒストグラム分布（緑色）。 （赤い四角で強調表示）ヒットは、％の切断はサンプル集団（<25.89パーセント開裂）の中央値から3SD未満の値を有する外れ値から選択した。 4安打は、選択時にハイライト表示（ⅲ）全てのデータ点のヒストグラム上の高信号制御に類似した値を持っていると、同じ化合物を表すSNAPをブロックテストのためのプレート、既知のBoNT / A阻害剤（トウセンダニン）にスパイク-25切断。
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Discussion
ボツリヌス神経毒とその兵器の相対的な容易さの高い効力は、米国疾病管理予防センターによるカテゴリーA（最優先）biothreat剤としてのそれらの分類をもたらした。残念ながら、FDAは毒素が運動ニューロンによって内在された後のBoNT中毒に対抗するための治療薬を承認していないがあります。のBoNT中毒から神経細胞の回復を促進する任意のドラッガブルメカニズムが、この生物学的脅威に対する武力サービスと公共の両方を保護するために潜在的な治療法の開発に向けてつながる可能性があります。この記事では、我々はそのようなBoNT / Aのような致死性の毒素の阻害剤をスクリーニングするための詳細なHCIアッセイプロトコールを提示する。このアッセイの珍しい側面は、実験室の安全性を確保する毒素や厳格なバイオセーフティプロトコルの実装の綿密なハンドリングである。活性毒素の使用中に細心の注意を払わなければならない。のBoNT /メタノール固定し、マイクロプレートを経由して不活性化decontaminati10％の漂白剤および5％の表面ワイプを持つにマイクロプレートはバイオセーフティーレベル2実験室環境での下流評価のためのバイオセーフティキャビネットから取り外すことができるように重要なステップである。
による遅い運動ニューロン膨張（セル番号）と結合化合物ライブラリーの拡大を続けるサイズに、神経毒アンタゴニストHCIアッセイは、数週間にわたって実行する傾向がある。これがプレート間と時間にわたる変動を排除または最小化されなければならないことを要求する。このプロトコルでは、アッセイの変動性を減少させるために免疫染色、画像収集及び分析のための自動化方法を提供する。更なる信頼性と一貫性は、細胞のメッキ、洗浄、および固定を含む、このプロトコルに関連する日常的な作業を自動化することによって達成することができる。当社グループは現在、近い将来に我々のプロトコルに組み込む目的でこれらの改善の影響を評価しています。
本稿では、SNAP-25を記述する運動ニューロンにおける無傷SNAP-25の相対蛍光を測定するために高含量イメージングを用いて切断アッセイ。このアッセイは、完全長SNAP-25およびβ-IIIチューブリンをそれぞれ11を検出するために、BACSとβ-IIIチューブリン抗体を使用しています。 β-IIIチューブリンは、具体的には神経細胞（ 図4）を識別するためのマーカーとして使用される。のBoNT / A SNAP-25を切断しながら、SNAP-25の信号を減少させ、このプロセスの任意の部分を阻害する小分子はイメージングアッセイにおいてSNAP-25シグナルを改善する。このアッセイは、多くの小さな神経突起に分散SNAP-25から発生した蛍光シグナルに依存するので、高品質の画像が絶対に必要である。したがって、高解像度の共焦点画像を生成する自動化された顕微鏡は、（ 図4）をお勧めします。 20X水浸対物レンズを使用しながら、私たちは日常的に96ウェルフォーマットで/ 6-16のフィールドをキャプチャします。フィールドの画像化された数がgeneratするのに必要な神経突起の全体的な数に依存している電子統計的に有意な結果。
モジュラー画像解析アルゴリズムは、マルチパラメータデータ（ 図6）を抽出するために利用された。コロンバスモジュラー画像解析アルゴリズムは、単純な分析シナリオのために生成することが比較的容易である。より複雑な分析や複雑な読み出しのための特定のパラメータの設計では、アカペラベースのスクリプトは、オペラ環境内だけでなく、コロンブスのコンテキスト内で使用することができます。 SNAP-25およびβ-IIIチューブリンのチャネルから得られた蛍光強度に加えて、我々は日常的に中に神経の健康を定量化するためにそのような全細胞数（細胞毒性のための間接的な尺度）、神経突起の長さが、神経突起分岐、および他のエンドポイントなどの他のパラメータを収集するアッセイ。生のエンドポイントデータは、更なるデータ分析のための統計分析ソフトウェアにエクスポートし、選択（ 図7）をヒットする。ここに示されたデータは、efficiようにするのHCIアッセイの能力を実証ently生理学的に関連する運動ニューロンモデルを用いてBoNT / A型阻害剤の探索において表現型スクリーニングに利用した。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
References
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