Summary
Bu yöntem, fare modellerinde yeni ilaçların farmakokinetiğini değerlendirmek için, karotid arter yoluyla sabit bir ilaç çözeltisi sunmak amacı ile geliştirilmiştir.
Abstract
Yeni bir sistemi içine bir ilaç, ilaç kombinasyonu veya bir ilaç teslimat kullanımını öneren zaman, bir çalışma modeli içindeki ilacın farmakokinetiklerini değerlendirmek gerekir. Fare modelleri kullanımı genellikle klinik öncesi ilaç keşfi ve ilaç geliştirme 1-8 hayati adım olarak, bir üniforma, tekrarlanabilir bir şekilde farelere uyuşturucu sokmak için bir sistem tasarlamak gereklidir. İdeal olarak, sistem, bir ayar süresi boyunca düzenli aralıklarla kan örnekleri toplanmasını izin vermelidir. Kütle spektrometresi ile ilaç konsantrasyonlarını ölçmek için yeteneği, tek tek farelerden 1, 9, 10, zaman içinde plazma ilaç seviyelerindeki değişiklikleri takip etmek araştırmacılara sağladı. Bu çalışmada, paklitaksel, üç üzerinde sürekli bir arteryal infüzyon olarak transgenik farelerin sokuldu saat kan örnekleri aynı anda ayar zaman noktalarında retro-orbital kanamalardan tarafından alınmıştır ise. Karotis arter infüzyon juguler ven infüzyon için potansiyel bir alternatif, faktörler gibi vardırmeme tümörleri veya diğer engel şah infüzyon pratik yapmak. Bu tekniği kullanarak, plazma ve dokuda paklitaksel konsantrasyonları juguler infüzyon ile karşılaştırıldığında benzer seviyelerde elde etti. Bu eğitimde, biz başarıyla tek fare modeli için optimize edilmiş bir kateter hazırlayarak karotid arter kateterizasyonu nasıl göstereceğiz, sonra eklemek ve fare karotis artere kateter sabitleyin, arka dışarı kateterin ucunu iplik nasıl göstermek fare boyun ve ilaç akışı kontrollü bir oranını vermek için bir pompa fare kanca. Birden çok düşük hacimli bir retro-orbital kan zamanla plazma ilaç konsantrasyonlarının analiz edilmesi için izin verir.
Introduction
Karotis yoluyla ilaç verme cihaz ve teknik optimize güvenilir ve tekrarlanabilir şekilde gerçekleştirilebilir. O ince detaylara kontrolü ve dikkat gerektiren her ne kadar prosedür, karmaşık değil. Üstün bakım ve maharet karotis arter izole ve genellikle uygulama yoluyla elde edilebilir kateter takılması için ihtiyaç vardır. Deneyimli bir teknisyen tarafından Cerrahi bir saat geçmemelidir. (Fare gerçek ilaç infüzyonunun tepki olabilir) başarılı bir cerrahi sonrasında fare normal ve sağlıklı görünen olmalıdır ve ilaç (lar), kontrollü, üniform sürekli bir dozajda tatbik edilebilir. Kan örnekleri, karotid arter dışında kalan bir bölgede alınmalıdır; retro-orbital kanamalar ilaç konsantrasyonlarının analizi için toplanması kolay ve tatmin edici olmuştur.
Optimum boyutu ve şekli kateterler başarılı bir infüzyon 11 performans paha biçilmez bir varlık vardır. Bu kateterler mevcut commerciall bulunduy genelde çok büyük ve / veya fare karotis arter kolay erişim için izin vermek için çok esnek olması. Bu infüzyon şırınga fareyi bağlamak için kullanılan polietilen borudan moda kateterler tercih kanıtladı. Böylece, tüm boru, bağlantı ve iğneler infüzyon düzeneğinin basitleştirilmiş tutarlı boyutlar, vardı. Bu teknik kullanılarak, bu yine de görülebilir ve karotid artere kan akımı kateter ilk tespit edilir kadar sonra geri değildir noktadan sonra arter içine kateter ucu itmek için gerekli değildir. Bu arter delinmesiyle veya kateter sahip tehlikeler kan akışının yüksek basınç aracılığı ile dışarı itilir azaltır. Kateter tasarımı Burada böylece dikişlerle iyi kateter güvence ve cerrahi bant bir öncelik olduğunu, bir yerde tutmak için "çarpmak" dahil değildir.
İnfüzyonlar klinik daha iyi bir uygulama benzeri olarak, ortak bir IV bolus enjeksiyonu tercih edilebilirBöyle taksanlara 3, 12, burada açıklanan 13. tekniği olarak ilaç, başlangıçta boyun veya femoral ven erişim meme tümör büyümesi ve / veya ekleme alanının aşırı vaskularizasyonu engellediği burada fare modellerinin içine infüzyon sağlamak için geliştirilmiştir. Bu yöntem, çoğu zaman da tümörsüz farelerdeki uygun olabilir: jugular duvarın eğiliminin çok daha başarısız girmeleri ve tamamlamak için sorunlara neden rip çünkü izole edilmesi ve karotis kateterizasyonu, ancak biraz daha fazla invasif biz, bu tercih jugular bulunmuştur 3 saat süre ders.
Burada gösterilen sonuçlar, C57BL / 6J ile ilgili olsa da (in-house-yetiştirilmiş) fareler, başarılı bir transgenik manipüle fare modellerinde farmakokinetiklerini takip etmek, FVB ve karışık suşlar da dahil olmak üzere, farelerde çeşitli suşları içine paklitaksel aşılamak için bu tekniği kullandık Hücresel taşıyıcı fonksiyonlarını aşağı düzenleyecek. Kan ve doku örnekleri paclitax beklenen seviyelerde gösterdi ToplananEl, boyun infüzyon 1 sonra görülen seviyelerin aralığındadır. Bu teknik, diğer fare modellerinde ve infüzyon çözeltileri ile eşit derecede iyi çalışırlar beklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Fox Chase Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından ve Laboratuar Hayvan Tesisi tarafından onaylanmış ve hayvanların insanca tedavisi için kurumsal kurallarına uygun olduğu tespit edilmiştir.
1. Ön Hazırlık
- Kateter hazırlanması: inceltme, körelmiş ucu (Şekil 3A) oluşturmak üzere tadil edilmiş bir polietilen boru kısa bir uzunluğu, bir kateter hazırlayın. Önceden birden fazla kateter yapmak ve süresiz kaydedin.
- Bir Bunsen beki yakin ve düşük istikrarlı alevi oluşturmak için ayarlayın. Polietilen yumuşatmak için alev yakın tüp tutun. Boru erimeye başladığı zaman, yavaş bir boru, inceltilmiş bölüm, yaklaşık olarak 0.25 mm dış çap oluşturmak için, iki ucu ayrı çekin.
- Eğimli end ince kesit boyunca yaklaşık 0,75 cm kesin. Bu yeterli boru bir aşırı uzun kateter yaratmadan, arterde güvence altına alınmalıdır sağlar.
NOT: th uzun ince ucunue kateter tıkanmasına bir eğilim vardır. Aşırı uzun ucu da önemli kateterin sıvı hacmi kapasitesini değiştirmek için yeterince sıvı tutabilir. - Düzgün ısıtmalı, uç biraz yuvarlak ve genişlemiş hale geldiğinde - alev hızla geçerek geçerek eğimli ucu künt. Artere takarken yardımcı olur biraz geriye ucu kanca, boru çapa.
- Ince başlar noktasından tüp 6.0 cm kesin. Bu çok yönetilebilir kateteri, bu aşırı boru kemiren veya ilk tuzlu temizlemek için çok fazla ekstra infüzyon hacmi gerektiren gelen fare önlemek için boyun çıkmak için aracılığıyla iplik ve basılı tutun ve rahat çalışmak yeterince uzun, ama yeterince kısa yapar .
- Yaklaşık 0.2 ml heparin solüsyonu bir şırınga hazırlayın, bir keskin olmayan iğne ile. Kateter (Şekil 3B), geniş ucuna iğne yerleştirin. Kabarcıklar orada olduğundan emin olmak için dikkatli olmak, heparin ile kateter doldurunboru. Steril bir alanda bir kenara heparin şırınga ve kateter ayarlayın. Bir petri kateter (ler) üzerine yerleştirilmesi, ve gamma ışıması 20 Gy maruz bırakılması ile, gama ışını uygulanarak sterilize kateter. Bir gama radyasyon kaynağına erişiminiz yoksa, bu tür dalgıç, gaz veya kimyasal-sterilizasyon gibi sterilizasyon diğer araçlar, araştırmak için hayvan tesisi ile kontrol edin. Polietilen ısı sterilize edilemez, kaynatmayın.
- Tuzlu kurşun (Şekil 3B) oluşturulması.
- Bir kabarcık ücretsiz çizgi sağlamak için dikkatli olmak, yaklaşık 0.5 ml, ikinci bir şırınga steril tuzlu su hazırlayın.
- Bir ikinci boru parçası, yaklaşık olarak 15 cm kesin ve keskin olmayan şırınga iğnesi üzerine kayma. Hortumun serbest ucuna bir bağlantı girişi takın.
- Salin akımının düzgün olarak kurşun ile tuzlu su, küçük bir hacim ilerletilmesiyle engelsiz edin. Içinden akışını kontrol etmek, kateter takıldıktan sonra bu tuzlu öne kullanınkateter ve kan hattını teşvik etmek. Steril bir alanda bir kenara tuzlu şırınga ayarlayın.
- Ameliyat öncesinde, gaz sterilizasyon veya cam boncuk sterilizasyon alternatif olarak otoklav ile ekipmanları sterilize veya.
- Steril cerrahi alan hazırlayın.
- Dezenfektan gibi% 70 etanol veya klor dioksit ile tezgah ve mikroskop yüzeyleri silin. Temiz bir kağıt, emici ped ile tezgah ve mikroskop tabanı örtün.
- Güvenli bir yapışkan bant ile bağlı, temiz bir emici kağıt iki tabaka ile kaplayarak, bir ameliyat panosuna hazırlayın.
- Onlar kolayca erişilebilir, böylece (Malzeme Listesinde Katalogda gibi) tüm cerrahi malzemeleri yerleştirin.
- Steril dikiş üç uzunlukları 8 cm, her biri ve diğer malzemeleri ile kenara kesti. Kolayca kullanılabilir bir bağlantı noktası (Şekil 3B) yerleştirin.
2. Cerrahi
- Hayvanın Hazırlanması
- Anesthhassas buharlaştırıcı bağlı anestezi odasına 2-3 izofluran% maruz etize fare. Odasından fareyi çekiniz ve farenin boyun / üst gövde saç tıraş ve sağ kulak altında (kateter çıkış yerinde). Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlerin için veteriner vazelin oftalmik merhem uygulayın. Hazırlık (en az iki dakika önce) ya da hazırlık sırasında, bir burun hunisi yoluyla fare izofluran uygulanması ile solunan bir odacık içinde, fare yeterli sürenin geçmesine olanak sağlanmasıyla, cerrahi hazırlıkları sırasında uyandırmak etmez hayvan emin olun. Anestezi odasına fare dönün.
- Fare yeterince etkisiz olduğunda, steril cerrahi alana gitmek farenin burun ve ağzına anestezi burun konisi yerleştirin ve burun konisi için izofluran akışını yönlendirir. Forseps ile pençe kısma doğru Anesthetization onaylayın; Fare hiçbir tepki gösterdiğinde, bir sonraki adıma geçin.
- Kafa doğru bakacak, sırtında fare yerleştirinaraştırmacı. Kulaklar, baş--pençeleri güvenli ve arka-pençeleri yapışkan bant veya diğer kısıtlayıcı cihazla cerrahi kuruluna sabit fare tutmak için. Povidon-iyot ve% 70 etanol ile kesi alanı temizleyin.
- Karotid arter izolasyonu
- Uzunlamasına boyun orta hatta hafifçe sağa doğru açılmış olan bir 1 cm yapın. Bu, soluk borusu (Şekil 4A) ortaya çıkarmak için yağ ve kas ayırmak için forseps kullanır. Trakea (Şekil 4B) karotis arter paralel olarak çalışan bulun.
- Dikkatle arter (Şekil 4C) örten ayrı fasya için forseps kullanabilir. Hafifçe karotis kenara vagus siniri çekin ve arasındaki boşluğa forseps yerleştirin. Yavaşça açık forseps (kadarıyla (en az 3 mm) mümkün olduğunca yukarı (posterior), fasya bir boşluk oluşturmak ve dikkatle larinks (ön uca) yakın arterde fork, arterden sinir çekmeye Şekil 4D).
- Herhangi yeniden kaldırmakarter iyice izole kadar döndü- rün fasya (Şekil 4E). Nemli ve böylece daha az gözenekli ve daha rastgele yırtılmaya karşı daha az eğilimli doku tutulması için cerrahi alanına tuz bir damla ekleyin.
- Sütür yerleştirme ve kateter arter hazırlık (Şekil 4, 5).
- Arterin altında ipek dikiş ipliği çekmek için forseps kullanın. Mümkün (Şekil 4F) olarak anterior doğru kadarıyla arteri kapatmak için güvenli bir düğüm.
- Arterin altında ikinci bir iplik çizin. Geçici mümkün (Şekil 4F) olarak posterior doğru kadarıyla arteri kapatmak için bir geri çekilebilir düğüm.
- Arterin altında üçüncü bir iplik çizin. , Ilk iki sütür arasında çok gevşek bir düğüm hızlı yerleştirme (Şekil 4G) sonra kateteri sabitlemek için kullanılacak.
- % 70 etanol biraz onları ıslatma yolumdan tüm sütür uçlarını tutun.
- Sütür ile, arter hafif gergin çekmek için alt düğüm kapmak. Nick Yukarıdaki arter, ancak ön sütür (Şekil 4H), çok yakın. Çok derinden kesmek için değil dikkatli olun, ama açılış engellenmemiş olduğundan emin olmak için yarık kontrol edin.
- Ya sonunda büyük hava cepleri oluşturarak önlemek için çalışıyoruz, şırınga iğne heparin dolu kateter çıkarın. (Sağ elini kullananlar için) genellikle aşağıya ve hafifçe sağa, rahat bir açıyla eğim konumlandırmak için kateter işleyin.
- Sütür tutarak hafifçe gergin kalan arteri tutmak için ise, hafifçe yarık (Şekil 4I) içine kateter yerleştirin. Anterior sütür tutun ve kateter üzerinde (arter ponksiyon eğimli ucu neden olabilir kateter ile aşırı yukarı iterek) aşağı arter çekmek için forseps kullanabilir. Dikkatle kateter ve ön dikiş bırakın.
- Artere kateter girişine yakın orta sütür düğüm, sıkarak kateter sabitleyin. Sıkı bir üçlü düğüm yapmak, ancak kateter içinden akışını engellemeyecek şekilde sıkı çekin emin olun. Ek artere giriş altında, ön sütür ile aşağı bağlayarak kateter sabitleyin.
- Tekrar hat içine hava kabarcıkları tanıtan önlemek için çalışıyoruz, konektör fişi ile kateter tuzlu kurşun takın.
- Posterior sütür uçlarını kavrayın ve yavaşça düğüm serbest bırakmak için çekin. Arterin aşağı dikiş manevra, kateterin ucuna (iş parçacığı çıkarmayın). Kan kateter içine akması gerekir; kan akışı varsa, yavaşça daralmasını çıkarmaya çalışmayın sonda kıpırdatmak.
- Akış engelsiz göründüğünde, biraz orta sütür üzerinde ek bir düğüm bağlamak için (posterior sütür itibaren) son iplik kullanın.
- Her el forseps ile, sadece ön sütür altında kateter üzerinde tutmak için forseps bir çift kullanın ve kolayca tarafa viraj olacak bu yüzden diğeri ile, kateter içine bir ilginçlik basın. İkinci ilginçlik yaratmak için tekrarlayın. Bu kateterin serbest ucu arter duvarına karşı yanal olarak açmak için sondanın ucunu zorlamadan, fare kafasının arkasına doğru çekilmesine izin verir.
- Ağız ve burun üzerinde konumlandırılmış burun konisi tutarak, onun (sol) tarafa üzerine fareyi çevirin, ve% 70 etanol ve povidon-iyot ile insizyon bölgeyi temizleyin. Küçük bir kesi altında ve sağ kulak arkasında (yaklaşık 4 mm) yapmak. Yanak içinden bir kanal oluşturmak için cilt altında künt boş prob çalışırken boyun boşluğuna, derinin açık kapağını tutmak için forseps kullanın. Bunun yerine bezi ve deri arasında gitmek için çalışmakla, tükürük bezinin etrafında probu getirmek için önerilir. Dikkatle prob çıkmak için bir alanı boşaltmak için forseps kullanın.
- Boyun çıkmak için bir sonda ile liman fiş / kateter Konuyu. Çok sert çekmeyin; kateter ezilme veya kan damarları veya organları daraltıcı değil emin olun.
- Ipek ya da zımba ile göğüs kesi topikal analjezik ve yakın yara yönetmek.
- Anestezi fareyi çıkarın ve hayvan temiz kurtarmak için izin, bir ısıtma yastığı üstüne alan (yer kafesi ısındıya da bir ısı lambası altında), en az 30 dakika daha karıştırıldı.
3. İnfüzyon
- 5 mg / paklitaksel / ml metanol çözeltisi alikotları hazırlayın.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne paklitakselin 50 mg ölçün. Steril 10 ml metanol ekleyin. Cap tüp. Toz eritildi kadar el ile ya da oda sıcaklığında dönen bir çalkalayıcı üzerinde döndürün.
- Kısım, -20 ° C'de, 500, 20 küçük, derin dondurucu, güvenli tüplere çözeltisi ul ve saklayın.
- Hemen infüzyonu önce oda sıcaklığında veya 37 ° C su banyosu içinde çözülme tek tek kısım.
- Infüzyon pompası (Şekil 6) hazırlayın.
- Yaklaşık 40 cm polietilen borunun uzun bir uzunluğa kesilir. Bir ucunda bir köreltilmiş bir iğne ve diğer bir bağlantı girişi takın.
- Th hızını hesaplamak için, birçok programlanabilir pompa şırınga haznesinin çapını gerektirir (bilinen bir iç çapı olan bir şırınga içine ilaç hazırlayıne pompa kolu). Şırıngaya bir iğne takılır ve iğne ve boru içinden ilaç yükü.
- Üreticinin talimatlarına göre pompanın içine şırınga yerleştirin. Başbakan pompa böylece ilaç konektör fişi sorunsuzca akıyor, ve infüzyon için hazırdır.
- Pompalamak için fareyi takın.
- Sabit fare tuşunu basılı tutun ve liman fiş yakın kateteri, kelepçe için hemostat kullanın. Fişini çıkarın ve şırınga ve boruya bağlı konnektörü ile değiştirin.
NOT: Kan tüp yoluyla geri akmaya başlayabilir. - Hızla kateterin hacmi temizlemek için hızlı bir pompa yönetmek (tüp 6 cm hacmini gözlemleyerek deneysel hesaplanan), sonra hemen istenen infüzyon hızına geçin.
- Sabit fare tuşunu basılı tutun ve liman fiş yakın kateteri, kelepçe için hemostat kullanın. Fişini çıkarın ve şırınga ve boruya bağlı konnektörü ile değiştirin.
- Üç saatlik bir zaman süreci için Paklitksel infüzyon devam edin.
- Bu genellikle fare akışında bir tıkanma belirtisi olarak kavşaklarda sızıntıları kontrol etmek için zaman zaman boru izleyin.Infüzyon (uyuşukluk veya hiperaktivite, rahatsızlık belirtileri) için beklenen veya beklenmeyen reaksiyonları için fareyi izleyin.
- Infüzyon uzunluğuna ve niteliğine bağlı olarak, fare yemek veya içmek, ancak kurumun kurulan politikaya göre yiyecek ve suya erişim sağlamak için emin olmayabilir. Büyük miktarda kan toplanması ile fareyi dehidrasyon için potansiyelin farkında olun.
- Fare uzakta sıcaktan uzak kalmak isteyen görünen sürece, bir ısıtma yastığı veya lamba ile kafes sıcak tutmaya devam. Hayvan ameliyattan sonraki birkaç saat içinde ötenazi değilse, ameliyat sonrası ağrı için steril barınma koşulları ve tedavi dahil olmak üzere hayvan ameliyat sonrası tedavisi için planını uygulamak.
- (Kötü bir ekleme işareti olabilir) borudan hiperaktivite yoluyla boru, ya da tahriş çekip almaz bunu sağlamak için, özellikle ilk birkaç dakika içinde, fare üzerinde bir yakından takip edin. Fare aşırı aktif değilse, sabit Monitohalka gerekli, ama hayvan boru içinde karışık almaz emin olmak için rutin fareyi kontrol olmayabilir. Koşum ve bağlama sistemi piyasada bulunmaktadır, ancak bunların kullanımı bu protokol kapsamı dışındadır.
- Örneklerinin toplanması.
- (Protokol, meme tümör modellerinden faydalanmak karotid kateterden ile aynı zamanda yerleştirilen bir boyun kateteri vasıtasıyla kan toplama dikkate takdirde) submandibuler ya da retro-orbital kan almalar ile düzenli aralıklarla kan örnekleri alınmalıdır. Infüzyon hattı çekmek için dikkatli olun. Retro-orbital kanamalardan tarafından toplanması durumunda, hafifçe bir inhalasyon anestezik ile fare uyutmak (örn metoksifluron) böylece bir fare sabitlemek için ense kapmak gerekmez.
- Plazmadan kan hücreleri ayırmak için hemocrit santrifüj içinde kan dönerler. Faz ayrılması yüzüne tüp gol bir dosya veya elmas uçlu kalem kullanın. Tüp kırmak ve küçük, derin dondurucu güvenli tüp içine, sadece plazma toplamak. At Mağaza -Analiz edilinceye kadar 80 ° C.
NOT: hemocrit santrifüj mevcut değilse, plazma kan hücrelerinin ayrılması için yüksek hızda bir mikro santrifüjde, kan mikro santrifüj tüpü içine örnek ve sıkma aktarın. Ikinci bir tüp içine plazma toplamak ve -80 ° C'de saklayın. - CO 2 boğulma fare öldürülür. Sıvı azot ilgi ve flaş donma organlarından - (50 mg yaklaşık 20) doku toplayın. Analiz edilinceye kadar -80 ° C'de saklayın.
4. Numune Analizi
NOT: Bu protokol için tüm numuneler sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi ile bir dış laboratuvar aracılığıyla analiz edilmiştir - aşağıdaki gibi paklitaksel konsantrasyonları hesaplanır (LC MS / MS):
- Örneklerden paklitaksel ekstratının. % 0.1 asetik asit içinde bir doku örneği, ekstre etmeden önce% 50 metanol kullanılarak homojen. (Metil tert-bütil eter kullanılarak sıvı / sıvı ekstraksiyonu ile paklitaksel ekstratınınBir iç analog (dosetaksel) standardı ile güçlendirilmiş MTBE). MTBE'yi ve kuru örnekleri çıkarın. % 50 asetonitril,% 0.1 asetik asit solüsyonu içinde yeniden süspanse edin.
- Kalibrasyon standartları hazırlayın. (Doku örnekleri için 0.1 ila 5000 ng / ml arasında, plazma örneği için 1 ile 20.000 ng / ml) standartları nihai dizi elde etmek üzere, C57BL / 6 matrisi uygun geri paklitakselin bilinen bir konsantrasyon ekleyin. Yukarıdaki çalışma örneklerinde olduğu gibi aynı yöntemi kullanarak, kopya standartlar ayıklayın. Elektrosprey iyonizasyon HPLC / MS / MS ile örneklerinde paklitaksel tepe ölçün.
- Iç standarda paklitakselin alanı oranı kullanılarak konsantrasyon hesaplanır. Eğri üzerinde oturması standart bir eğri ve interpolasyon çalışma örnekleri oluşturmak için kalibrasyon standartları kullanın. Homojenizasyon önce numunenin başlangıç ağırlığı ile çalışma örneklerinin konsantrasyonunu normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Paklitaksel dağıtımı 165 dk düşük hızda infüzyon ardından 15 dakika yüksek hızda infüzyon 3 saat dozlama rejimi sırasında öngörülebilir desenleri, izler.
Şekil 1 juguler ven-infüzyon plazma paklitaksel konsantrasyonları ve karotis arter-infüzyon bir karşılaştırmasını göstermektedir. Paklitaksel konsantrasyonları başlangıçta yüksek hacimli infüzyon sonraki ilk 15 dakika hızlı bir şekilde açılır ve daha sonra bir sonraki 150 dakika boyunca yatay duruma getirmek. Karşılaştırıldığında, bir fakir infüzyon paklitaksel seviyeleri aşağı analiz boyunca kapalı nispeten düşük başlangıç ve yukarı hover ve. Bu büyük olasılıkla erken infüzyon hattı blokaj neden oldu. Tahlil kayıtları fare ilacın bir alt uygulama fikri teyit, infüzyon için herhangi bir harici reaksiyonu için çok az olduğunu göstermektedir. Sonunda, 2 karaciğer ve beyin dokusu, aynı zamanda, kan plazması içinde paklitaksel bağıl seviyelerde göstermektedir 3 saat infüzyon.
hep ">:" keep-together.within-page = fo "jove_content
Şekil 1:. Karotis ve juguler kürlerde Plazma paklitaksel düzeyleri Eğri bireysel farelerde plazma paklitaksel konsantrasyonlarını temsil eder. Her bir fare, bir başlangıç yüksek hızlı oluşan iki fazlı bir infüzyon, hemen düşük bir hızda, ardından 0.42 mg / kg / dakika 15 dakika infüzyon, 0.021mg / kg / dakika ve 165 dakikalık bir infüzyon. Karotid infüzyon için, eğri (AUC) altındaki alan / ml'lik, yaklaşık 37 ug / mL ∙ dak juguler enfüzyon için bir AUC karşı ∙ dakika yaklaşık 59 ug idi. Karotid infüzyon için oluşturulan, eğrilerden hesaplandı paklitakselin yarı ömrü 10 dak ve juguler enfüzyon 11 dakika idi. Karotis infüzyon juguler infüzyon göre ilaç konsantrasyonunun kabaca eşdeğer seviyelerini gösterir. Döngüsü yukarı ve aşağı, sık sık r Sürekli düşük konsantrasyonları veya konsantrasyonlarıfakir infüzyon epresent.
Şekil 2:. Dokusu ile Paklitaksel konsantrasyonu hemen son kan numunesinin 3 saat paklitaksel infüzyon ve alındıktan sonra, fare öldürüldü, ve karaciğer ve beyin doku örnekleri alındı. Paklitaksel konsantrasyon plazmadaki düzeyleri ve doku kütle-spec analizi tarafından satın alındı. Bu veriler, Şekil 1 'de karotis infüzyonla fare toplanan numuneleri temsil eder.
Şekil 3: Cerrahi öteberi. (A), Kateter Üretim: yeniden izin verirken, malzeme giderleri olanları kendi kateterler aşağı tutar Çekmearaştırmacı boyutunu ve fare yaş ve boyutuna kateter şekli terzi (B) Cerrahi öncesi hazırlayın:. Üç (3) ipek sütür, yaklaşık 8 cm her; Steril liman fiş; Tuzlu şırınga ve kurşun; Kateter heparin şınngaya bağlanmış.
Şekil 4: karotis arter ve kateter hazırlanması. Deri yoluyla Cut (A), bezleri kenara çekilin ve fena halde ayrı yağ kas göstermek için forseps kullanabilir. (B) hafifçe ayrı kas trakea sağ tarafını ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Karotis arter (E). (D). Arter çevresinde (C) Arası fasya. Trakea paralel çalışan, karotis arterden ayrı vagus siniri, büyük kalın duvarlı damarlar gibi görünür hale karotiko kadar fasya kaldırmaya devam edecektird tamamen boşluğu boyunca izole edilir. arka ucunda (F) Sütür kalıcı ön ucunda düğüm, ve kayma düğüm. (G) Üçüncü dikiş karotis altında dişli ve çok gevşek düğümlenir. (H) Arter sadece ön dikişle üstünde kesildikten sonra. ( I) arterde nick içine kateter yerleştirin. Kateter üzerinde aşağı arter çekmek için forseps ile ön dikiş kapmak. (J) Güvenli kateteri her üç dikiş ile karotis arter.
Şekil 5:.. Dikiş yerleştirme cerrahi bölgenin şematik önce ve sonra kateter kurulum A Şekil 4H'de gibi, arter bir nick eklenmesi ile, fotoğraf Şekil 4G ile gelir.
Şekil 6:. Infüzyon seti-up Şırınga şematik ilaç ile dolu, ve künt bir iğne ile örtülüdür. Polietilen hat karotis kateter şırınga takılır. Pompa yavaş yavaş kan dolaşımına doğrudan üniforma dozajının teslim edilmesi, şırınga sıkıştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karotis arter infüzyon paklitaksel farmakokinetiği bu çalışmada önemli bir tekniktir. Karotid arter infüzyon hızlı bir şekilde dolaşım sistemi 14 içinde ilacı dağıtmak için bir yöntemdir. 3 saat infüzyon bolus enjeksiyonlar daha taksanlann gibi ilaçların klinik yönetiminin yakın bir mimik olduğunu. Ameliyat güvenilir tek bir kişi tarafından yapılabilir, ameliyat süresi oldukça kısadır ve başarı oranları>% 75 vardır. Numuneler toplandıktan sonra, bunlar, uygun yöntemlerle analiz edilmelidir. Plazma ve doku örnekleri paklitaksel konsantrasyonu belirlemek için kütle spektrometrisi kullanılmıştır. Ayrıca bu tekniği doğrulamak için, analiz için bağımsız bir laboratuara kan ve doku örnekleri gönderdi. Bu veriler, her bir hayvan, test edilen (Şekil 1) için tek tek plazma-paklitaksel konsantrasyonu eğrileri olarak çizilmiştir, ve paklitakselin dağılımı, farklı dokularda (Şekil 2) ile karşılaştırılmıştır. Her iki durumda da, bu imilaç ve ilgi sistemine bağlı olarak, ilaç dağıtım ve / veya metabolizmayı analiz etmek en iyi yöntem dikkate portant. Farklı ilaçların ölçümü için diğer seçenekler HPLC-UV veya immünoanalizleri 2 içerebilir.
Başarılı karotis kateterizasyon için gerekli iki temel faktör de moda kateterler ve üstün arter izolasyon vardır. Fare modeli ölçülerine uygun kateter Fashioning çok önemlidir. Kateter çapı çok kalın olursa, bir çok ince kateter güvenceye almak için daha önce veya infüzyon sırasında tıkayabilir olasılığı olacak ise, artere ekleme, aşırı zor olacaktır. Kateter ucunun açısı ve netlik de ılımlı bir aralıkta olmalıdır; zor olacaktır çok sıkıcı bir ucu artere eklemek için ise, arter duvarı delebilir çok keskin bir ipucu. Burada verilen ölçümleri, bir model şablon olarak, on haftalık yaşında C57BL / 6J fareler, yaklaşık olarak 20 g kullanılarak elde edilmiştir. Ölçümler ölçekli olmalıyukarı veya aşağı ampirik bireysel modeller uygun.
Karotis arter izolasyonu hassas, bilinçli süreç doku gereksiz zarar vermemek ve büyük ölçekli kanamayı önlemek için olmalı. Subkutan yağ genellikle kolayca orta keskin forseps düşük ile ayrılabilir. Karotis üzerinde kas dokusu kas liflerinin önyargı boyunca uçlu forseps orta ince ile ayrılmalıdır. Daha geniş bir boşluk gerekirse, teknisyen küçük kan damarlarının koparılması vermemek için son derece dikkatli olmak gerekir. Karotis görünür olduğunda, hala ince uçlu forseps ile arterden uzak tweezed gereken fasya adil bir miktar olacaktır. Son olarak, vagal sinir ya da zarar vermeden karotid arterden ayrılmalıdır. Karotid doğru izole edildiğinde, bu arter iki tarafında boş bir alanı ile bunun altında bulunan forseps eklemek mümkün olmalıdır (Şekil 4E bakınız).
Ne zaman trouble çekim yoksul infüzyon, araştırmacı beklenen dozajının teslim edilmesi pompayı programlanmış düzgün emin olmak için pompa üzerindeki talimatları inceleyerek başlayın. Sonra, dikkatle test hayvanına tanıtan olacak hacmini değiştirmeyi düşünebilirsiniz. İlacın seyreltme dozaj hacim, uygun şekilde hesaplanmalıdır: hacim hayvan tahammül ve ideal ölçüde kan basıncını etkilemez için çok büyük olmamalıdır; Pompa güvenilir sunmak için, ve kavşaklarda takunya önlemek için sürekli bir akış yaratacak henüz hacim yeterli büyüklükte olmalıdır. Takunya normal bir olay haline, daha küçük bir göstergesi (büyük çaplı) iğne ve tüp geçiş düşünün. Plazma ilaç içeriği beklenen seviyeye ulaşamıyor Dahası, eğer araştırmacı fareler kateter iyi artere yerleştirilen ve serbest akışlı kalır olup olmadığını belirlemek için otopsi sonrası kontrol ve gerektiğinde kateter şekli / boyutunu değiştirmek gerekir.
UsefulnBu yöntemin esini boyutu ve öznenin genel sağlık, ve infüzyon süresi, amaçlanan uzunluğu gibi faktörler ile sınırlı olabilir. Cerrahi ve infüzyon zaten sıkıntılı konuyu taşırmak edebilirsiniz. Hatta sağlıklı bir hayvanda, karotis arter kateter kısa vadeli infüzyon, birkaç gün genellikle birkaç saat boyunca sadece uygundur. Fareler gibi sitelere yara topikal anestezi tekrarlanan uygulamaları, ya da rüçhan sistemik analjezikler gibi, ilaç infüzyon yanıt rahatsızlık belirtileri varsa kullanılacak hangi ağrı kesici yöntemleri düşünün. , Yerel hayvan düzenleyici kuruluş veya IACUC tarafından onaylanmış tüm hayvan çalışmaları için bu yordamı gerçekleştirmek için uygun izinleri elde etmek gerekli olacaktır. Eğer daha uzun bir infüzyon için ya da fare, uzun bir süre için infüzyon hayatta kalabilmesi için gerekli ise, alternatif bir enfüzyon yöntemleri araştırılmalıdır.
Çalışmaya hakim karotis perfüzyonunu yaptıktan sonrapaklitaksel farmakokinetiklerin, biz C57BL / 6J'de ve FVB fare ve diğer fare modellerinde diğer ilaçların etkilerini ve Abcc10 modülatörleri araştırmak için gelecekte bu tekniği kullanmayı planlıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu projeye verdikleri destek için FCCC Laboratuar Hayvan Tesisi kabul etmek istiyorum. Biz plazma ve dokuda paklitaksel düzeylerini analiz onların yardım için Wolfe Laboratuvarları, Inc teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri EHB için K01CA120091 verir ve CA06927 Fox Chase Kanser Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene tubing 0.024” OD X 0.011” ID | Braintree Scientific, Inc. | PE10 | |
| 3 Blunted needles (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | NB-30 | |
| Stainless steel port plug (28 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | PP-28 | Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal. |
| 2 Stainless steel connector plugs (30 gauge) | Braintree Scientific, Inc. | C-30 | |
| Three 1 cc syringes | Becton, Dickinson and Co. | 309659 | |
| Sterile 0.9% Saline solution | Hospira | 0409-7984-37 | |
| Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution | Braintree Scientific, Inc. | HGS | |
| Silk suture | Braintree Scientific, Inc. | SUT-S 113 | |
| Vanna Scissors (micro-scissors) | World Precision Instruments | 14122 | This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well. |
| Hartman Mesquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 501705 | |
| Betadine Swabsticks | Perdue Products L.P. | BSWS1S | |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1160-01 | May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia. |
| Paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Micro Capillary Tube Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| C57BL/6J mice | Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred | ||
| API 4000 Q-Trap mass spetrometer | Applied Biosystems |
References
- Gallo, J. M., Li, S., Guo, P., Ma Reed, K., J, The Effect of P-Glycoprotein on Paclitaxel Brain and Brain Tumor Distribution in Mice. Cancer Research. 63 (16), 5114-5117 (2003).
- Sonnichen, D. S., Relling, M. V.
- Gianni, L., et al. Nonlinear Pharmacokinetics and Metabolism of Paclitaxel and Its Pharmacokinetic / Pharmacodynamic Relationship in Humans. Journal Clinical Oncology. 13 (1), 180-190 (1995).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Nonlinear Pharmacokinetics of Paclitaxel in Mice Results from the Pharmaceutical Vehicle Cremophor EL. Cancer Research. 56 (9), 2112-2115 (1996).
- Sparreboom, A., Van Tellingen, O., Nooijen, W. J., Beijnen, J. H. Determination of paclitaxel and metabolites in mouse plasma, tissues, urine and faeces by semi-automated reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 664, 383-391 (1995).
- Bradshaw-Peirce, E. L., Eckhardt, S. G., Gustafson, D. L. A Physiologically Based Pharmacokinetic Model of Docetaxel Disposition: from Mouse to Man. Clinical Cancer Research. 13, 2768-2778 (2007).
- Eiseman, J. L., et al. Plasma Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Paclitaxel in CD2F1 Mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 34 (6), 465-471 (1994).
- Schinkel, A. H., et al. Normal Viability and Altered Pharmacokinetics in Mice Lacking mdr1-type (drug-transporting) P-glycoproteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 4028-4033 (1997).
- Fraser, I. J., Dear, G. J., Plumb, R., L’Affineur, M., Fraser, D., Skippen, A. J. The Use of Capillary High Performance Liquid Chromatography with Electrospray Mass Spectrometry for the Analysis of Small Volume Blood Samples from Serially Bled Mice to Determine the Pharmacokinetics of Early Discovery Compounds. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 13 (23), 2366-2375 (1999).
- Bateman, K. P., et al. Reduction of Animal Usage by Serial Bleeding of Mice for Pharmacokinetic Studies: Application of Robotic Sample Preparation and Fast Liquid Chromatography – Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 754 (1), 245-251 (2001).
- Berndt, K., Vogel, J., Buehler, C., Vogt, P., Born, W., Fuchs, B. A new method for repeated drug infusion into the femoral artery of mice. J. Am. Assoc. Lab Animal Sci. 51 (6), 825-831 (2012).
- Fergusson, G., Ethier, M., Zarrouki, B., Fontés, G., Poitout, V. A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat. J. Vis. Exp. (78), (2013).
