Introduction
Genetische Untersuchungen an lebenden Organismen verwenden häufig den Hühnerembryo als Modell, weil in ovo Elektroporation stellt eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um embryonale Strukturen teilweise Transfektion in vivo mit DNA-Konstrukte 1-5. Bicistronische Expressionsvektoren, die ein Transkript, das ein fluoreszierendes Reporter zusammen mit dem Gen von Interesse, wie pCIG 6 oder Pmes 7 kodieren, ermöglichen eine schnelle Überprüfung der Transfektion Qualität in der gewünschten Region unter einem Stereomikroskop vor der Verarbeitung Embryonen für Downstream-Analyse.
Mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierung ist es nun möglich, digitale gesamte Transkriptom Expressionsprofile von RNA-Proben unter Verwendung von RNA-Seq 8,9 erhalten. Statt also zeitaufwendige Verfahren, die Analyse von nur wenigen Genprodukte parallel ermöglichen, wie in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und qPCR, Herstellung von cDNA-Bibliotheken fürHochdurchsatz-Sequenzierung kann Informationen des gesamten Transkriptoms. Beobachtung der experimentellen Effekte auf die Expression von jedem einzelnen Gens kann wiederum bieten leistungsstarke Einblicke in die Wege, durch das Konstrukt verwendet verändert. Dies ist besonders einfach, wenn eine genomische Anordnung für den verwendeten Organismus ist, wiederum ist damit der Hühnerembryo ein geeignetes Modell.
Wenn der Benutzer Zugang zu einer zuverlässigen Genomsequenzierung Zentrum hat, ist das Hauptproblem hoher Qualität zu erhalten RNA-Proben. Diese Arbeit zeigt, ein Verfahren zur Gewinnung von RNA Proben transfiziert Neuralrohren für RNA-Seq sowie den nachgeschalteten Schritten zur in silico Analyse der resultierenden Datensätze. Nach Elektroporation bei HH12-13 gefolgt von 48 h Inkubation wurden die transfizierten Stamm Rückenmarkshälften in Ribonuklease freien Bedingungen seziert sofort lysiert und weiteren Abbau durch ultra-niedrigem Gefrierpunkt geschützt, bis RNA-Reinigung und Bibliotheks preparatIonen.
Das Galaxy öffentlichen Server 10 bietet Zugriff auf kostenlose Ressourcen für die Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten. Die Menge an Speicherplatz für registrierte Benutzer angeboten wird, genug für kleine Versuchs wodurch die Notwendigkeit für die lokalen Computerinfrastruktur. RNA-Seq Datenanalyse umfasst Filterung, Ausrichtung und Quantifizierung / Vergleich der Genexpression. Obwohl es allgemeine Richtlinien für die RNA-Seq Datenanalyse, werden Filterparameter hängen weitgehend von der Qualität der Sequenzierungs und sollte nach Qualitätskontrollanalyse der Ausgangsdaten bestimmt werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um zu erhalten und vergleichen RNA-Seq Profile embryonalen Hühnerrückenmark in vivo transfiziert. Als repräsentative Ergebnis Vergleich der Datensätze von zwei unabhängigen Kontrollproben mit einem leeren Vektor transfiziert zeigte, daß das Verfahren ist reproduzierbar und sollten Identifizierung differentiell Expres ermöglichensed-Transkripte in experimentellen Proben. Daher Anwendung dieser Methode hat das Potential, die Anzahl von Entdeckungen nach einem einzigen Versuch stark erhöhen und somit eine große Menge von Daten für nachfolgende Untersuchungen.
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Protocol
1. elektroporieren das Konstrukt von Interesse in der Neural Tuben HH12-13 Hühnerembryonen in ovo
Verwenden Sie einen fluoreszierenden Reporter, vorzugsweise in einem bicistronischen Transkript oder mit einem interkalierenden viralen 2a Peptid 11 an das Protein von Interesse fusioniert, um eine schnelle Identifizierung von Personen mit zufriedenstellenden Niveaus der Transfektion zu ermöglichen. Anmerkung: Typische Inkubationszeit für diese Stufe ist etwa 48 Stunden bei 37,8 ° C.
- Öffnet sich ein kleines Fenster in der Eier nach dem Entfernen 3 ml Albumin mit einem zu einer 18 G x 1 1/2 Nadelspritze verbunden. Embryo Darstellung zu verbessern, zu injizieren eine kleine Menge Tusche 1:50 in steriler Ringerlösung unterhalb des Embryos 1-4.
- Nach Abdecken der Embryo mit steriler Ringerlösung injizieren einen 10 mM Tris-HCl, pH 8,2, und 0,1% Lebensmittelfarbstoff (F, D & C) Lösung, die 2,5 ug / ul DNA durch das hintere Ende des Neuralrohrs, bis es fülltbis zu dem Hinterhirn Region. Zu elektroporieren, die Position von Platinelektroden (0,5 mm Durchmesser) von 4 mm 1 getrennt entlang der Flankenbereich und liefern 5 Impulsen von 50 ms und 20 V mit einem Intervall von 100 msec zwischen ihnen 4.
- Nach der Elektroporation inkubieren manipulierten Embryonen für 48 Stunden mehr, bis sie Stufe HH23 erreichen und identifizieren Personen präsentiert hohe Transfektion im Flankenbereich unter einem Fluoreszenzstereomikroskop.
HINWEIS: Die Dauer der Inkubation nach der Elektroporation hängt vom Ziel des Versuchs. Die elektroporierten Plasmide können signifikante Expressionsniveaus nach 2 h 2 zu erzeugen. Wenn daher das Interesse liegt in frühen Beginn der Gene nach der Elektroporation Inkubationszeit kann reduziert werden.
2. Ernte erfolgreich transfizierter Embryonen und sezieren die elektroporiertem Spinal Cord Halbiert
HINWEIS: Dieser Vorgang dauert 2-3 Stunden für jeweils 10 Embryonen und Erträge 1-2 Ug Gesamt-RNA pro Embryo. Die Präparation der Neuralrohren erfordert feinen Bewegungen und einige Trainingseinheiten können, bevor sie auf experimentellen Proben notwendig sein.
- Dekontamination von metallischen Dissektionswerkzeuge mit RNase Dekontaminationslösung oder durch Einbrennen bei 150 ° C für 4 h 12 und bereiten DEPC behandeltem PBS. Verwenden Sie nur neue zertifizierte RNase-freie Kunststoffgeschirr.
HINWEIS: Nach der Ernte ist es wichtig, eine Standardbehandlung folgen, um RNase Kontamination während Dissektion zu verhindern. - Ernten Sie die Embryonen mit einem Paar feine Präparierscheren und gesiebt Sammlung Löffel. Halten Sie die Embryonen in kaltem DEPC-behandeltem PBS in einer 100 mm Petrischale.
- Mit einer feinen Pinzette, schneiden Sie die gesamte Flankenbereich (zwischen der hinteren Grenze des vorderen Extremitätenknospe und die vordere Grenze des hinteren Gliedmaßenknospe) und übertragen Sie diesen Abschnitt, um eine neue Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS.
- Verwenden Sie zwei feinen Glasnadeln an drei verschiedenen perforierenPunkte auf jeder dorsolateralen Seite des Embryos zwischen dem Neuralrohr und paraxiale Mesoderm.
- Führen Sie die beiden Glas Nadeln in der zentralen Perforation und langsam bewegen einer von ihnen weg entlang der Neuralrohr anterior-posterioren Achse. Wiederholen Sie dies für die Perforationen, die nicht von den ersten Sätzen erreicht wurden. Entfernen Sie das freistehende paraxialen Mesoderm mit einer feinen Pinzette.
- Drehen Sie den Embryo seitwärts, legen die Spitzen der Pinzette zwischen dem Neuralrohr und der Chorda und schieben Sie sie in entgegengesetzte Richtungen entlang der anterior-posterioren Achse, die beiden Strukturen zu trennen.
HINWEIS: Dies sollte auch die Abschaffung der meisten der Mesoderm noch mit dem Neuralrohr angebracht. - Entfernen Sie gegebenenfalls gröberen mesodermic Gewebe, das durch Ziehen mit einer Pinzette unter leichtem Halten des Neuralrohr mit einer anderen Pinzette befestigt bleiben. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie leicht das Neuralrohr an eine andere Schale mit kaltem DEPC-behandeltem PBS mit einemRNase-freie Glaspasteurpipette zu einer manuellen Pipette Pumpe gekoppelt und halten Sie auf Eis, bis alle Rohre werden seziert.
- Teilen Sie die Neuralrohren in zwei Hälften. Dazu legen Sie die scharfe Spitze eines geschlossenen Pinzette in das Lumen und öffnen Sie die Dachplatte, indem Sie die Pinzette heraus durch sie. Danach trennen Sie die Hälften durch Schneiden der Bodenplatte mit der Pinzette Tipps.
- Art, die aus nicht-elektroporiert Hälften unter einem Fluoreszenz Binokular und in ein 1,5-ml-Röhrchen mit eiskaltem DEPC-behandeltem PBS gefüllt elektroporiert. Falls nötig, schlagen Sie das Mikroröhrchen vorsichtig, um jedes Gewebe an den Kunststoffwänden befestigt zu lösen und Sedimentation der Rohre zu fördern.
- Spin bei 100 × g für 3 sec und sehr langsam zu entfernen, so viel wie möglich PBS mit einer 1 ml Pipette. Tun Sie dies, während man eine Lichtquelle, die durch den Mikroröhrchen glänzt zu überwachen, wenn eine embryonale Material auf die Pipettenspitze gesaugt; Wenn dies geschieht, langsam entladen und wiederholen Sie den centrifugation.
- In 70 ul Lyse-Lösung für die RNA-Extraktion pro Neuralrohr Hälfte und Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und kräftig vortexen. Wiederholen Sie den 5 min Inkubation und Vortexen zwei weitere Male. Bei -80 ° C.
- Sammeln mindestens acht Neuralrohr Hälften pro Probe, um eine ausreichende Ausbeute für den nächsten Schritt zu gewährleisten. Pool kleinere Proben, wenn mehrere Elektroporation / Dissektion Sitzungen sind erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von neuronalen Rohre anzuhäufen. Bewahren ausreichende Proben für Duplikate oder dreifach für jede Bedingung.
3. Entschlacken RNA und Planen Bibliotheken für Illumina Sequenzierung
- Proben von -80 ° C Lagerung entfernen und auf Eis für 15-30 min. Wieder Auftauen bei Raumtemperatur bis zur Beendigung.
- Vortex gut und bei Raumtemperatur lassen Sie für 5 min. Vortex wieder und Zentrifuge bei 15.000 g für 1 min, um unlösliches Material zu pelletieren.
- Den Überstand in ein neues Röhrchenund RNA-Extraktion gehen nach der Gesamt-RNA Isolation Kit manuelle Anweisungen. Eluieren in der empfohlenen Mindestvolumen, um die Konzentration zu erhöhen.
HINWEIS: DNase-Behandlung nach clean-up ist, um eine mögliche Kontamination von genomischer DNA-Sequenzen in RNA-Seq Datensätze zu vermeiden empfohlen. - Flick das Rohr, um den Inhalt zu mischen und zu entfernen 5 ul für die Qualitätskontrolle-Analyse. Bewahren Sie die restliche Probe bei -80 ° C bis Bibliothek Vorbereitung; Diese Proben sollten nur einmal aufgetaut werden, um RNA-Abbau zu vermeiden.
- Führen gereinigte RNA in einem Bioanalyzer Instrument mit dem RNA 6000 Nano Kit; RIN-Wert muss mindestens über 7, um fortzufahren.
- Generieren Sie Bibliotheken mit einem Illumina kompatiblen RNA-Seq-Bibliothek Vorbereitung Kit und multiplexen bis zu 4-Bibliotheken in einer Spur eines HiSeq Instrument auf 100 bp Einzel liest erzeugen. Wenn möglich, schließen Sie alle Proben im gleichen Lauf um mögliche technische Artefakte zu minimieren.
HINWEIS: Diese sollte auf 50 Mio. r ergeben sichEADS pro Probe, die mehr als genug, um die Abdeckung für die meisten Gene 13 zu erhalten.
4. Vergleichen RNA-Seq Datasets in der Galaxy Public Server 10.
ANMERKUNG: Server Speicherplatz ist begrenzt und Experimente zu vergleichen viele Proben eine vollständige Löschung des Zwischendateien in den Filterschritte generiert erfordern.
- Erstellen Sie ein Benutzerkonto in der Galaxy öffentlichen Server ( https://usegalaxy.org ) und FTP-Upload der Illumina-Datasets in fastq Format.
- Bereiten Sie hochgeladene Dateien mit dem FastqGroomer 14 Tool unter der NGS: QC und Manipulation Menü; wenn die Qualitätswerte sind bereits in Phred + 33 (Sanger) codiert, überspringen Sie diesen Schritt durch einfache Änderung der Dateityp unter den Attributen für jeden Datensatz fastqsanger.
- Analysieren Sie die allgemeine Qualität der jeden Datensatz mit der FastQC Tool unter der NGS: QC und Manipulation michnu.
HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit sollte der resultierenden Grafik für pro Basensequenz Qualität und pro Basensequenz Inhalt gegeben werden, da diese Schätzungen für die zum Beschneiden der Enden der liest verwendeten Parameter bereitzustellen. - Trim liest verwerfen 3'-Enden mit Qualitätsdaten günstig mit der fastq Qualität Trimmer 14 unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um nur bearbeiten, 3'-Enden für den Qualitätsfaktor unter 20.
- Entfernen Adaptersequenzen aus liest mit Hilfe des Tools Clip ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü. Stellen Sie das Werkzeug, um zu verwerfen liest mit weniger als 45 bp nach links, geben Sie die Sequenz der verwendeten Adapter und wählen Sie den Ausgang, beide abgeschnitten und nicht-begrenzten Sequenzen umfassen. Außerdem entscheiden nicht auf Sequenzen mit unbekannten Basen zu verwerfen, da die meisten geringer Qualität Basen wurden bereits im letzten Schritt entfernt. Verwenden der Werkzeug Trim-Sequenzen ( http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) unter der NGS: QC und Manipulation Menü schneiden Sie die ersten Grundlagen der liest bis 5 'von FastQC detektierten Sequenz Bias (typischerweise 10) zu entfernen.
HINWEIS: An dieser Stelle ist es eine gute Idee, FastQC erneut ausführen und Vergleichen mit der vorherigen Analyse zu bestimmen, ob die Datenmenge Qualität wurde verbessert. - Laden und entpacken Sie die neuesten Hühnergenom Anordnung für die UCSC Genom-Browser von Illumina iGenomes ( http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ) und laden Sie das gesamte Genom fasta Formatdatei und die Gene Annotation GTF Formatdatei durch die Galaxis Geschichte mit der Upload File unter dem Get Data-Menü.
- Karte liest für jede Probe, um das Huhn-Genom mit Hilfe der Ausrichter TopHat2 15 unterdie NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie, um ein Genom aus der Geschichte zu verwenden (wählen Sie die fasta Datei in Schritt 4.7 hochgeladen).
- Baue eine vorhergesagte Transkriptom für jede Probe mit Manschettenknöpfe 16 unter den NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung als Richtlinie verwenden (wählen Sie die GTF-Datei in Schritt 4.7 hochgeladen) und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig.
- Merge prognostiziert Transkriptomen für alle Proben mit Cuffmerge 16 unter der NGS: RNA-Analyse-Menü. Wählen Sie den Bezugsanmerkung (GTF-Datei aus Schritt 4.7) und die Sequenzdaten (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) zu verwenden.
- Vergleichen BAM Dateien TopHat2 für jede Probe mit Cuffdiff 16 unter der NGS generiert: RNA-Analyse-Menü. Bei den Feld Transcripts wählen michrged Transkriptom von Cuffmerge generiert und schalten Sie die Optionen Führen Bias-Korrektur (aus der Geschichte, fasta Datei aus Schritt 4.7) und Verwenden Mehr lesen richtig.
- Sortieren differentielle Expression Testen Tabellen numerisch aufsteigend in Spalte 13 (Q-Wert) mit dem Werkzeug Sortieren unter dem Filter und Menü sortieren.
HINWEIS: Gene / Transkripte, die signifikante differentielle Expression zwischen experimentellen Bedingungen werden die niedrigsten q-Werte zu präsentieren. - Um die Ergebnisse visuell mit Abdeckung Graphen zu überprüfen, zuerst konvertieren BAM Dateien bedGraph Format mit dem Werkzeug erstellen BedGraph der Genomabdeckung 17 unter dem Menü bedtools. Deaktivieren Meldung von Regionen ohne Abdeckung, wählen zu verbindenden Einträge im Unterschied Abständen zu behandeln und zu skalieren die Deckung durch einen Faktor, der Sequenzierung Tiefe für alle Datensätze, die verglichen werden normalisiert.
- Konvertieren Sie die resultierende bedGraph Datei an bigwig Format unter Verwendung derWerkzeug Perücke / BedGraph-to-Bonzen ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) unter dem Menü Formate konvertieren. Laden Sie die Dateien als individuelle bigwig Spuren im UCSC Genom-Browser ( http://www.genome.ucsc.edu/ ) für die galGal4 Montage und suchen ein Gen von Interesse, um die Abdeckung in den Datensätzen zu visualisieren.
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Representative Results
Um die beschriebene Methode zu validieren, wurden zwei Kontrollproben aus Embryonen mit dem leeren Vektor Pmes 7 und eine Probe von Embryonen mit dem gleichen Vektor, der die Einlage zu konstruieren SCRT2-ZNF, die die Zinkfinger-Domänen von Hühner SCRT2 18 kodiert, transfiziert elektroporiert erzeugt. Proben ergab 11-22 ug Gesamt-RNA wurden jeweils aus Pools von 8 bis 12 Embryonen. Alle drei Proben erzielt eine optimale RIN-Wert von 10 in einer Qualitätsprüfung mit dem Bioanalyzer Gerät an (Abbildung 1) durchgeführt, die zeigen, dass qualitativ hochwertige RNA kann mit diesem Protokoll erhalten werden.
Nach der Sequenzierung wurde das beschriebene Filterprozess erhöhte die Ausrichtungsrate von 83 bis 91% der liest (Daten nicht gezeigt). Wie erwartet, Vergleich der Transkriptom von zwei Kontrollproben zeigten keine deutlichen Unterschied, wenn global in einem Streudiagramm verglichen (Abbildung 2) und die Korrelationskoeffizienten nach Pearson von 0.99. Zusätzlich zeigten Anzeige der Abdeckung für alle drei Datensätze entlang der Ortskurve, die den Abschnitt des SCRT2 Sequenz eine deutliche Steigerung der Anzahl der Lesevorgänge in der Versuchsprobe (3) in diesem Bereich zugeordnet ist, anzeigt, dass die Überexpression erfolgreiche und dass Unterschiede zwischen den Kontroll- und experimentellen Proben nachweisbar mit der hier beschriebenen Methode.
Abb. 1: RNA Qualitätskontrolle Bioanalyzer Elektropherogramme zeigen hohes Maß an Integrität für die von den ribosomalen RNA Spitzen 18S und 28S angegeben zwei Steuer Gesamt-RNA-Proben. Einschübe stellen eine virtuelle Gel für den Lauf.
Figure. 2: Reproduzierbarkeit von RNA-Seq Quantifizierung Ergebnisse Streudiagramm zeigt, dass RPKM für die meisten Gene ist das gleiche in beiden Kontrollproben. Nahezu alle Gene, die dieses Muster nicht folgen haben sehr niedrige RPKM Werte und damit in der Regel aus Transkriptom Vergleiche ignoriert.
Abbildung 3: Visualisierung der Unterschiede in einer experimentellen Probe UCSC Genome Browser Anzeige der SCRT2 Locus im Hühnergenom (galGal4) zeigt eine sichtbare Zunahme der Berichterstattung über die Region, die für das Protein-Domäne (SCRT2-ZnF) ektopisch in der zum Ausdruck gebracht. Versuchsprobe.
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Discussion
Hier bieten wir Richtlinien zur Analyse Wirkungen nach der Elektroporation des Huhns Rückenmark. Obwohl Elektroporation von DNA-Vektoren wird häufiger verwendet, um ein Gen von Interesse überexprimieren, kann man auch Konstrukte dominant Negativen quimeric Proteine oder Vorstufen Codierung verwenden für siRNAs zur Genfunktion knock-down Bedingungen 19-21 erzeugen. In der Tat kann den Vergleich der Transkriptom Profile sowohl Verstärkungs- und Verlust der Funktionsanalyse resultierenden darauf hin Gene differentiell in entgegengesetzter Weise in jedem Zustand zum Ausdruck gebracht und hat somit das Potenzial, mehr spezifische Effekte aufzudecken.
Wie jede Methode zur RNA-Extraktion angewendet abwärts, Synthese von RNA-Seq-Bibliotheken benötigt eine anfängliche Mindest Menge des Ausgangsmaterials. Mit diesem Protokoll sollte 8 Embryonen ausreichend, etwa 10 ug Gesamt-RNA erhalten werden. Beginnend mit einer geringeren Anzahl von Individuen, ohne dabei eine angemessene Arbeitskonzentration ist wahrscheinlichkann bei der Verwendung von RNA Extraktionssysteme, die Endverdünnung in kleineren Volumina zu ermöglichen.
Proper Segregation des Neuralrohr von allen Mesoderm sollte ein paar Mal, bevor es auf wichtige Proben geübt werden, denn dies ist ein heikler Schritt, der eine gewisse Vertrautheit erfordert. Übermäßigen RNA-Abbau während der Präparation Schritt zu vermeiden, ist es auch wichtig, das gesamte Verfahren für alle Neuralrohren ca. 1-2 h zu vervollständigen. Auch hier wird die Praxis von Bedeutung sein, Dissektion der Zeit verbessern. Eine wichtige Beobachtung ist, dass die Verbindung zwischen Mesoderm Gewebe stärker ist als die Verbindung zwischen Mesoderm und Neuralrohr, so zieht mesodermalen Strukturen, speziell die Chorda, ist effizienter als der Versuch, unerwünschte Gewebe zu schneiden. Auch sollten Forscher fühlen sich frei, entwickeln ihre eigene Technik, um ihre eigenen Dissektion Bedingungen optimiert. Allerdings sollte darauf für Proben verglichen in einem gleichen Versuch unternommen, um ähnlich, so dass leve seziert werdenl der Kontamination mit mesodermalen Geweben möglichst homogen zwischen den Proben.
Unser Protokoll zeigt den Vergleich der Transkriptom Profile Bühne HH23 embryonalen Hühnerrückenmark bei Stufe HH12-13 transfiziert. Allerdings sollten kleine Anpassungen ihrer Anwendung auf Embryonen in früheren Stadien geerntet ermöglichen. Andererseits, wenn späteren Stadien werden zur Analyse der gewünschten Endergebnis, den genannten bicistronischen Vektoren können nicht geeignet sein, aufgrund einer kontinuierlichen Verringerung der Anzahl der Moleküle pro Zelle fortschreitender Entwicklung. Daher, insbesondere wenn die vorgesehene Endpunkt wird nach mehr als 72 h nach der Transfektion erreicht wird, kann es notwendig sein, um Vektoren Transposon-vermittelte genomische Integration des Konstrukts kodiert verwenden verwendeten 22.
Eine weitere Frage zu prüfen, ist die Heterogenität der Elektroporation Effizienz. Die Anzahl der nicht-transfizierten Zellen im Bereich von einigen wenigen bis zu einem beträchtlichen amount, vor allem die, die im ventralen Neuralrohr. Da nach der Sektion alle Zellen an nachgeschaltete Analyse unterzogen, wird ein niedriger Elektroporationseffizienz Empfindlichkeit des Assays zu reduzieren. Ein Ansatz, um die Probe mit elektroporierten Zellen anzureichern, ist die Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS), um die Population von nicht-transfizierten Zellen vor der endgültigen Probe 23 zu reduzieren. Wenn ein solcher Ansatz verwendet wird, jedoch eine größere Anzahl von Embryonen erforderlich sein, um eine ausreichende Ausbeute für RNA-Seq-Bibliothek Herstellung erzielen.
Illumina Sequenzierung wird empfohlen, da dies häufiger durch Sequenzierung Zentren und in silico RNA-Seq Datenanalyse wird vereinfacht, wenn im Vergleich zu anderen verfügbaren Plattformen 24 angeboten. Jedoch sind auch andere Möglichkeiten noch ausreichend mit Modifikationen bei der Datenfilterschritte besser geeignet zum gewählten Plattform. RNA-Seq-Daten-Analyse-Richtlinien noch nicht vollständig etabliert und Vergleich von Ausgängen from verschiedenen verfügbaren Werkzeuge, von denen einige bereits in der Galaxy öffentlichen Server enthalten ist, wird dringend empfohlen. Dennoch sollte die hier beschriebenen in silico Analyse geeignet, um gute Vergleichsergebnisse aus hochwertigem Datensätze sein. Wie in allen anderen Bereichen der Biologie, Hochdurchsatz-Sequenzierung enorm steigt die Menge an Informationen, die aus einem einzigen Experiment erhalten werden können, und das hier beschriebene Verfahren ist ein Weg, ihre Anwendung auf die Untersuchung der Rückenmarksentwicklung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indian ink | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| - ddH2O to 1 L | |||
| - Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| - 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| - ddH2O to 1 L and filter | |||
| - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| - Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).
- Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo. Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).
- Ghadge, G. D., et al. Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord. Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).
- Megason, S. G., McMahon, A. P. A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS. Development. 129 (9), 2087-2098 Forthcoming.
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).
- Cloonan, N., et al. Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing. Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).
- Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice. BMC Biol. 6, 40 (2008).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1982).
- Wang, Y., et al. Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens. BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Vieceli, F. M., Simões-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors. Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).
- Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo. Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).
- Simões-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).
