שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Introduction

שידור סינפטי מתווך על ידי exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית המכיל מוליך עצבי, ושלפוחית ​​אלה חייבת לעבור מחזור endocytic מקומי במסוף העצב לשמור על תקשורת עצבית בטווח הארוך. בהתחשב בתפקיד החיוני של שידור סינפטי במוח, הבנת המנגנון המולקולרי המהווה את מעגל השלפוחית ​​הסינפטית הוא בסיס חיוני להבנה טובה יותר בתקשורת הסלולרית בכללותו. בין מערכות מודל תא, תא chromaffin יותרת הכליה סיפק כמה תובנות העקרוניות ביותר למכונות מולקולריות שבבסיס מחזור שלפוחית ​​הסינפטית. Exocytosis, השלב האחרון בשחרור הנוירוטרנסמיטר, נחקר מאוד ובחן באמצעות השימוש בתאי chromaffin יותרת הכליה ^1,2. למעשה, רוב השחקנים המולקולריים שלתזמר את ההיווצרות, מיקוד, עגינה, ושילוב של גרגרי הפרשה זוהו בשל יישום של divטכניקות erse בתאי chromaffin ^1. יתר על כן, על ידי מתן הזדמנות לאפשר לרזולוציה יחידה שלפוחית ​​של מכונות החלבון מעורבות בexocytosis, תא chromaffin נשאר מודל רב עוצמה כדי לענות על השאלות של שלפוחית ​​היתוך ^3.

מדידות קיבול מצורף תא נוצלו ראשונה בפתרון היתוך יחיד שלפוחית ​​במהלך exocytosis ^3. Exocytosis של שלפוחית ​​קטנה כמו ~ 60 ננומטר בקוטר הוכח להיות מזוהה על ידי מדידות להתקבל קרום תא עם טכניקת מהדק תיקון בתצורת התא מצורף ^4-7. אדמיטנס מוגדר כמדד של כמה בקלות מעגל או התקן יאפשר לזרם לזרום; זה הוא ההופכי של עכבה. לפיכך, מדידות להתקבל לספק הבנה של קיבול הקרום. המטרה זו מושגת על ידי השילוב של קרום לפוחי לתוך קרום הפלזמה; התאגדות זו חושפת שינויים במשטחאזור ^8. כל שלפוחית ​​פיוזינג גורמת לעלייה הדרגתית ^ב9,10 קיבול קרום. בנוסף, מדידה להתקבל זה מספקת את מוליכות הממברנה ומוליכות נקבוביות ההיתוך במהלך אירוע exocytotic ^3. כטכניקה זו סיפקה כלי ייחודי בזיהוי קינטיקה יחידה שלפוחית ​​במהלך exocytosis, המעבדה שלנו לאחרונה מיושמת תפיסה זו כדי לזהות אנדוציטוזה של שלפוחית ​​אחת ^11,12.

העניין הספציפי שלנו הוא אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME), שכבר נחשב כמרכיב ניהול משק בית בסיסי בתאים רבים ¹³ וכדרך הראשית לאנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית במסופים עצביים ^14,15. CME ידוע להיות חשוב מבחינה ביולוגית, לעומת זאת, קינטיקה שלה תישאר לא מובנת היטב בשל מגבלות טכניות בניטור אירועי endocytic ייחודיים. בהתחשב בקווי הדמיון במנגנוני exocytic בין תאים ונוירונים ¹ chromaffin, זה plausible שמנגנוני הביקוע בתאי chromaffin עשויים עשויים לחול על אנדוציטוזה שלפוחית ​​הסינפטית בתאי עצב. מדידות הקיבול מצורף התא כבר נוצלו כדי לעקוב אחר אירועי endocytic בודדים ולנתח את קינטיקה הביקוע, שרוב השיטות לא מצליחות לפתור. בהקלטות מצורפים התא שלנו, גל סינוס ב20 kHz משולב לתוך פוטנציאל ההחזקה, והתפוקה הנוכחית מופרד למוליכות קרום בקיבול ערוץ וקרום אחד בערוץ האחר משני שלבי נעילה ב מגבר ^{16- 18.} מהשינויים במוליכות הממברנה וקיבול, ניתן לחשב את קינטיקה של הביקוע נקבובי, שסביר להניח מתאים לצוואר קרום הצינור שמחבר את שלפוחית ​​ההפנמה לקרום הפלזמה לפני שלפוחית ​​קמצוץ-off. באופן קולקטיבי, טכניקה זו נותנת לנו את ההזדמנות כדי לבחון את מנגנוני הוויסות של ביקוע שלפוחית ​​במהלך CME.

Protocol

הערה: כל ההליך נערך בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות, כפי שאושר על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אילינוי בשיקגו.

1 פתרונות ותכשירי מדיה תרבות

1. שמור את כל הפתרונות ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. שמור את התקשורת והתרבות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
2. הכן של תקשורת בתרבות 100 מ"ל על ידי ערבוב 1 מ"ל של תמיסת עט סטרפטוקוקוס ו1 מ"ל של ITSX (אינסולין transferrin-סלניום-תוספים) לעם DMEM 100 מ"ל.
3. הכן פתרון אנזים על ידי ערבוב 250 מ"ל של DMEM, 2.5 מ"ל של 100 מ"מ CaCl _2, ו2.5 מ"ל של 50 mM EDTA.
4. הכן פתרון איון על ידי ערבוב 225 מ"ל של DMEM, 25 מ"ל של FBS, 625 מ"ג של אלבומין, ו625 מעכבי טריפסין מ"ג.
5. הכן הפתרון של לוק של 154 mM NaCl, 5.6 מ"מ KCl, 5.0 HEPES מ"מ, 3.6 מ"מ NaHCO3, 5.6 גלוקוז מ"מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH.
6. הכן פתרון poly-D-ליזין (PDL) של 50 מ"ג / מ"ל. השתמש בריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל ​​לcoverslips מעיל.
7. הכן פתרון תאי של 140 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, ₂ מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl _2, 10 HEPES מ"מ-NaOH, ו10 גלוקוז מ"מ. התאם את רמת החומציות ל7.3 עם NaOH עם osmolarity של 310 nmol / קילוגרם ~.
8. הכן פתרון פיפטה של 50 mM NaCl, 100 מ"מ TEACl, 5 מ"מ KCl, ₂ מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl _2, ו10 HEPES מ"מ. כדי להתאים את pH 7.3 עם NaOH עם osmolarity של 290 nmol / קילוגרם ~.

בידוד .2 הכליה בלוטת

1. החיטוי מספריים לנתיחה קטנים וגדולים ושני זוגות מלקחיים. ללבוש כפפות במהלך כל התהליך ולמקם את המגש לנתח בדלי קרח.
2. השתמש בעכברים שצולמו ביום 0-3. להרדים חיות עם CO ₂ טנק בלחץ ואחריו עריפת ראש.
3. לנצל את הקבוצה קטנה יותר של מספריים כדי לצמצם את החלק האחורי של הגור הבא עמוד השדרה מCervi קאל לזנב אזור. הקפד לחתוך באופן שטחי מתחת לעור ולא לחדור לתוך חלל הגוף.
4. בשלב בא, עור לקלף מן העמוד שדרה, כך שרירים שנחשפו ליש תצוגה ברורה של עמוד השדרה. מכאן, לעשות חתך transectional בחוט השדרה הצווארי ולאחר מכן לבצע שני חתכים מקבילים לאורך צידי עמוד השדרה.
5. עם זוג אחד של מלקחיים מחזיקים את הגוף העיקרי של בעלי החיים, להשתמש בזוג מלקחיים האחר כדי לתפוס את עמוד השדרה ולקלף את עמוד השדרה עד כליות חשופות.
6. ברגע זה, לדמיין את בלוטת יותרת הכליה בחלק העליון של הכליות. לאחר מכן למקם בזהירות שתי בלוטות מכל חיה לתוך צינור חרוטי מלא פתרונו של לוק.
   הערה: לפעמים הבלוטות תדבק המלקחיים. אם זה המקרה, בעדינות להשתמש זוג נוסף של מלקחיים על מנת לסייע בהסרת הבלוטות מהמלקחיים ולפתרונו של לוק. יכולות להיות כל הזמן הבלוטות במצב הזה עד שעה 2.

דואר "> 3. עיכול רקמות

1. בינתיים, בועת פתרון האנזים עם 5% CO ₂ + 95% O ₂ במשך 15 דקות לפני השימוש. ודא כי פתרון equilibrated הופך מצבע ורוד בהיר לצבע ורדרד / כתום.
2. הוסף את פפאין לפתרון האנזים הטרי מבעבע בריכוז סופי של 20-25 יחידה / מ"ל. דגירה כל זוג בלוטות מכל חיה ל40-60 דקות ב37 מעלות צלזיוס בפתרון האנזים עם פפאין.
3. הוסף 75% מפתרון איון על צינור אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 10 דקות. דגירה זה מנטרלת את פעילות האנזים של פפאין.
4. לאחר הדגירה 10 דקות עם פתרון איון, בעדינות להעביר את הבלוטות לתוך צינור שכותרתו חדשה ולאחר מכן לשטוף את הבלוטות 3x עם תקשורת והתרבות.

.4 תא דיסוציאציה וציפוי

1. לאחר כביסה, הנח שתי בלוטות ל200 μl של התקשורת והתרבות ואז בעדינות לכייל את הבלוטות ולמטה דרך קצה פיפטה עם טפטפת 200 μl עד שהוא כבר לא חתיכה גדולה של רקמה בפתרון.
   הערה: כאשר titrating, לשמור על בלוטות בחלק התחתון של הצינור עם כוח כלפי מטה מקצה פיפטה 200 μl ולעסוק הרקמות בעדינות ובאיטיות. להיות בטוח לשימוש תנועות איטיות, מתמשכים, אף פעם לא pipetting מהיר או פתאומי.
2. הוספת תקשורת ותרבות 250 μl נוספת להביא עד 450 μl הנפח הכולל של תקשורת בתרבות.
3. צלחת 60 μl של פתרון המכיל תא זה על כל אחד משבעה coverslips 12 מ"מ מצופה PDL מראש, אשר ממוקמים בצלחת תרבות 60 x 15 מ"מ.
4. מצופים ברגע, מניח את הצלחת לתוך החממה שנקבעה ל37 מעלות צלזיוס ומתוחזק עם זרימה / אספקה ​​קבועה של 5% CO ₂ למשך 30 דקות כדי להבטיח סביבה לכדאיויות תא. לאחר דגירה, בעדינות להוסיף 5 מ"ל של תקשורת בתרבות מראש חימם לצלחת התרבות ולהחזיר את הצלחת בחזרה לתוך החממה ל24 שעות לפני תא נספחהקלטות ד.
   הערה: בדרך כלל, התאים יכולים לשמש לקלטות אלקטרו עד 4 ימים.

.5 סלולארי גיבוש זיהוי וGigaohm חותם

1. מקום coverslip 12 מ"מ לפתרון תאי. מאז בלוטת יותרת הכליה השלמה משמשות להכנת תא, לערבב את תאי chromaffin (בדרך כלל בהירים מאוד עם חום / צביעה בצבע בז' וצורה מעגלית מושלמת ליד (איור 1) בתרבות עם תאים בקליפת המוח (קטנים ועמומים יותר chromaffin תאים).
2. משוך את טפטפות התיקון בארבעה שלבים באמצעות חולץ P-97 לתכנות. טובלים את קצה פיפטה לתוך שעווה מותכת, שיעזור להפחית את הקיבול של הזכוכית ולאחר מכן לירות פולני טיפ ל" לפוצץ משם "שעווה זה מחלק הפנימי של קצה פיפטה.
   הערה: כאשר מלא פתרון פיפטה התיקון, יש לי טפטפות תיקון בדרך כלל התנגדות של ~ 2 MΩ.
3. מתקרב לפיפטה התיקון הקרובה לתא בתוך כמה מ 'icrons. כדי להשיג תצורה המצורפת תא, לחפש כל עיוות תא קלה במהלך הגישה של פיפטה התיקון הקרוב יותר לתא. החל שאיבה עדינה עד חותם GΩ מושגת.

.6 הקלטות קיבוליות-מצורף סלולריים

1. ברגע שחותם GΩ מתגלה, לבצע הקלטות מצורפים תא באמצעות מגבר EPC-7 בתוספת תיקון מהדק ומגבר נעילה ב אנלוגי שני שלבים (ראה טבלה המצורפת של ציוד). החל sinewave עם משרעת של 50 mV (RMS) ותדירות של 20 kHz ממגבר הנעילה ב.
2. הגדר את מסנן המוצא של מגבר הנעילה ב 1 בקבוע זמן אלפיות שני ו24 db. הגדר את השלב של מגבר הנעילה ב כך ששינויי קיבול זמניים המיוצרים על ידי פולסים שאיבה עדינים מופיעים רק בזכר קיבול תיקון (Im) ללא הקרנה לזכר מוליכות תיקון (Re) (איור 2).
   הערה: אנא ראה את הפרטים לכיול של המערכת מחדשפרנץ 19.
3. לזהות טיפוסי קיבול שינויים בצעדים "כלפי מטה" (איור 3).
   הערה: הקלטה מוצקה תיחשב כסוג דמיון "מדרגות" עם הרבה צעדים כלפי מטה, דבר המצביע על הפנמת שלפוחית ​​אחת. תהליך התיקון משמש כגירוי מכאני מאז נוכחי פעולה יכולה להיות מוקלטת בדרך כלל מרוב התאים.
4. שם קבצים כתיקיות בודדות כולל תאריך: MM / DD / שנה וכל הקלטה המצורפת סלולארי כשל המספור בודד (xx) בתוך קובץ ש.

Representative Results

כדאיות התא והאיכות של חותם gigaohm הן קריטיות בקביעת האיכות של הקלטות קיבול מצורף תא. לכן, זה קריטי כדי להשיג תרבית תאים אפקטיבית ויעילה לפני קלטות אלקטרו, ותאי קיימא טיפוסיים באיור 1. העיסוק והזמן יהיה מועילים בהשגת חותם gigaohm עם איכות גבוהה. אם אחד יכול לראות בבירור עיוות תא כאשר פיפטה התיקון מתקרבת התא כפי שמתוארת בשלב פרוטוקול 5.3, יש סיכוי טוב יותר בקבלת חותם איכות גבוהה. איור 3 מדגים הקלטה טיפוסית של קיבול קרום עם מטה מרובים הקשורים לשלבים אנדוציטוזה שלפוחית ​​אחת.

1 דוגמאות איור של תאי chromaffin יותרת הכליה עכבר קיימא24 שעות לאחר תרבית תאים. הצבע על 3 תאי chromaffin קיימא חצים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

התאמת איור 2 שלב בהקלטות מצורף תא. עם הגדרת השלב הראשונית, שאיבה עדינה לגרום לשינויים זמניים בשני הקיבול (IM) ומוליכות עקבות (Re), ותחזיות בשמץ Re מבוטלות על ידי שלב 23 ° משמרת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 ג טיפוסיקיבול מצורף-ell הקלטה בצעדים כלפי מטה מרובים, הקשורים באנדוציטוזה שלפוחית ​​אחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מדידות קיבול מצורף תא דורשות כמה שלבים קריטיים על מנת להשיג הצלחת הקלטות באיכות גבוהה: 1) תאי קיימא ובריאים שהוכנו מבלוטת יותרת הכליה; 2) ציפוי PDL של coverslips; 3) היווצרות חותמת gigaohm; רמת רעש של המערכת 4); ו5) תיקון שלב.

לניתוח של בעלי חיים, שינויים אחד יכול באופן פוטנציאלי לעשות הוא להתאים את הגישה הניתוחית למיומנות החליפה הטובה ביותר וכדי למנוע נזק במהלך נתיחה. בנוסף, תרגול מספיק באיתור והסרה של בלוטת יותרת הכליה הוא הכרחי כתאים שישמשו עבור קלטות אלקטרו לבוא אך ורק מהלשד של בלוטת יותרת הכליה. לעיכול אנזים, זה קריטי לאזן פתרון האנזים ידי מבעבע הפתרון עם 5% CO ₂ 95 +% O _2. הייה בטוח כי צינורות מחוברים לצילינדר הוא מספיק וחזק ללא דליפות. בנוסף, כדי להיות בטוח שסופו של הדברפתרון n ממוקם כראוי בזמן המבעבע 15 דקות כולו; זו יכולה להיות מושגת באמצעות הצבת סוף מחט 20 G שכבר קהה בסוף צינורות כדי לכוון זרימת אוויר הולם. יתר על כן, זמן נוסף לצעד זה לא יפגע כל עוד זרימת האוויר היא לא כל כך חזקה כמו לעלות על גדותיו הפתרון בצינור. טיטרציה תא היא עוד מרכיב קריטי שייקח בפועל. רוב התאים עלולים להינזק אם טיטרציה יתר; לעומת זאת, אם טיטרציה זה לא מספיק, יהיה מעט מאוד תאים מבודדים אחת ניתקו מהרקמות. כדי לכייל באופן יעיל, לנצל את קצה פיפטה μl 200 לפיפטה למעלה ולמטה 7-8x, כדי לוודא שבלוטות מועברות בעדינות באמצעות קצה פיפטה 200 μl כפי שאתה לכייל.

לציפוי PDL, תמיד אפשר להאריך את זמן הדגירה של PDL על coverslips עד 3 שעות כדי להבטיח ציפוי מספק של coverslips. ציפוי PDL הוא קריטי עבור chromaffin תאים לצרףולגדל על coverslips לאחר ציפוי תא. אם ציפוי PDL הוא לא מספיק, רוב התאים יהיו להתנתק מcoverslip, אשר יהפוך את ההיווצרות חותמת gigaohm קשה.

תמיד ניתן לשנות הקלטות מצורפים תא והשתפרו, כטכניקת התיקון היא תהליך ייעודי. שאיבה עדינה ומעודנת היא קריטית בקידום ההיווצרות החותם gigaohm כאשר פיפטה התיקון והתא נמצא בקשר. יותר מדי יניקה תהרוס את קשר קצה תא תיקון ובמצבים קיצוניים, יכולים להישאב לתוך התאים פיפטה את התיקון. זה יקויימו בקלות על אוסצילוסקופ על ידי שינוי לתצורת תא כולו או על ידי התנגדות מינימאלית מאוד חוזרת לאחד גדול מאוד; תרגול הוא בעל החשיבות העליונה להשגה במערך חותם gigaohm באיכות גבוהה.

בעוד התנגדות חותם גבוהה היא קריטית על מנת למזער את רמת הרעש בהקלטות המצורפת תא, שני השלבים הבאים הם גםחשוב להפחית את רמת הרעש כדי לפתור אירועי endocytic אחת: (1) בפתרון פיפטה התיקון, TEACl מנוצל כדי לחסום K ⁺ ערוצי מתח מגודרת; (2) קצה פיפטה מצופה בשעווה דביקה והשעווה בתוך קצה פיפטה ניתן להסיר על ידי ליטוש חום.

בעוד התאמת השלב המפורטת בשלב פרוטוקול 6.2 היא קריטית כדי להגדיר את השלב הראשוני להקלטה, צעד זה לא יכול להיות אידיאלי. לכן, חשוב לבצע תיקון שלב במהלך ניתוח ביקוע הנקבובי לאירועים בודדים. בפוטנציאל הממברנה מנוחה של -65 mV, כל תא הקלטות להראות שיש לו תא chromaffin עכבר טיפוסי קיבול מבוא של 5 pF והתנגדות כניסה של 500 MΩ, המחשבת את מוליכות הממברנה של תאי chromaffin העכבר כ~ 0.4 PS / FF. משמעות הדבר הוא כי אירוע endocytic עם גודל קיבול של 1 FF יגרום הפסד נקי של מוליכות הממברנה של ~ 0.4 PS. ערך זה הוא זניח בהשוואה בשינוי מוליכות קרום ypical 50-100 pS הקשורים לסגירת ביקוע הנקבובי endocytic בהקלטות מצורף תא. לכן, אנו בטוחים כי תיקון השלב שלנו מאפשר לנו להתאים את הבסיס של מוליכות הממברנה כך שהסגירה לפני ואחרי הביקוע הנקבובי היא באותה הרמה; תהליך זה עשוי להביא <שגיאת 1% לניתוח הנתונים שלנו.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כיצד יכולים להיות מנוצלים הקלטות קיבול מצורף תא כדי לפקח אנדוציטוזה שלפוחית ​​בודדת באמצעות תאי chromaffin עכבר כמערכת המודל. טכניקה זו מאפשרת לנתח את מנגנוני פיקוח לביקוע שלפוחית ​​במהלך אנדוציטוזה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm