破骨细胞是体内主要的骨吸收细胞。能够大量分离破骨细胞，已显著推动了对破骨细胞生物学特性的理解。在本方案中，我们描述了一种分离、培养及定量破骨细胞活性的方法 体外.
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摘要
摘要
破骨细胞是一类高度特化的细胞，起源于骨髓中的单核/巨噬细胞谱系。它们具有降解骨组织中有机和无机基质的独特能力，因此在调控骨骼重塑过程中发挥着关键作用。成骨细胞与破骨细胞共同负责动态偶联过程，在健康和疾病状态下通过骨吸收与骨形成协同作用，维持正常骨骼结构。
作为体内主要的骨吸收细胞，破骨细胞的分化或功能改变可能对机体产生显著影响。破骨细胞功能异常相关的疾病严重程度不一，轻者如骨质疏松症，因破骨细胞过度吸收骨组织而易于导致骨折；重者可表现为致死性新生儿疾病，由于无法形成骨髓腔以支持造血功能所致。
大量分离破骨细胞的能力 体外 显著推动了对骨重建循环的理解，并为发现治疗这些疾病的新疗法策略奠定了基础。
本文介绍一种从小鼠骨髓中分离和培养破骨细胞的方案，可获得大量破骨细胞。
引言
骨重建是一个动态过程，涉及骨形成与骨吸收的偶联1。这一高度调控的过程在维持正常体内平衡以及应对损伤和疾病时，对骨骼系统的维持起着关键作用。
破骨细胞是一类独特的多核细胞，能够吸收骨组织中的有机基质和无机基质。破骨细胞起源于骨髓的单核细胞/巨噬细胞系2-5。破骨细胞功能或形成异常可导致多种临床病理状态，包括骨质疏松等常见疾病。
生成破骨细胞的能力 体外 极大地推动了我们对骨生物学的理解6因此，针对破骨细胞相关疾病的新治疗药物正在不断涌现，这类疾病是导致显著发病率和死亡率的重要原因。7骨量和骨强度的稳态维持需要成骨细胞和破骨细胞的协同作用8,9骨稳态在多种疾病中发生改变，包括绝经后骨质疏松症，其中破骨细胞活性增强导致骨量和骨密度的病理性下降10随着人类疾病转基因小鼠模型的日益普及，人们将有更多机会解析破骨细胞在人类骨骼疾病中的作用。11-13.
文献中报道了多种破骨细胞培养技术方案，描述了诸多不同的实验变体9,12,14. Xing 及其同事在其关于从小鼠骨髓细胞进行破骨细胞生成检测的描述中，介绍了与下述方案类似的方法。然而，在收获长骨后释放骨髓细胞时，Xing 等 用完全 α-MEM 培养基冲洗骨髓腔14卡塔尔法莫研究了高血糖对破骨细胞功能的影响，并描述了一种方法：将骨髓冲洗后动员的所有细胞培养24小时，随后弃去非贴壁细胞。12，该技术也被Boyle所采用 等9 这些已发表的方案需要冲洗骨髓，这一操作繁琐，且由于必须切断骨的两端，还存在针刺伤风险以及珍贵骨髓样本的损失。我们所描述的方案采用研钵和研杵来分离破骨细胞，该方法类似于 Weischenfeldt 所述的巨噬细胞分离方法。 等15
然而，我们的经验表明，破骨细胞的分离和 体外 利用已发表的技术进行培养在破骨细胞生成方面常产生不一致的结果，往往导致无法成功培养破骨细胞。因此，我们设计了一种实验方案，可稳定地分离小鼠骨髓，以获得大量多核破骨细胞 体外 在破骨细胞诱导培养基存在下，最初接种的细胞约有70-80%分化为巨噬细胞，并进一步分化为破骨细胞。
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方案
注意：伦理声明：所有涉及脊椎动物的研究均按照斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC）批准的协议进行。
1. 准备
- 将10 ml市售的密度梯度细胞分离介质（含有聚蔗糖和泛影酸钠，密度调节至1.077 g/ml）置于50 ml锥形管中，恢复至室温。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）与2%胎牛血清（FCS）配制流式细胞术（FACS）缓冲液。取50 ml分装，并在密度梯度细胞分离介质操作步骤期间保持该分装液处于室温。
- 准备一桶冰，用于在细胞分离过程中保持组织和细胞的低温状态。
2. 准备培养基
- 配制基础培养基：不含酚红的最低必需培养基（MEM，500 ml）、谷氨酸（1×）、胎牛血清（FCS，10×）、10,000 单位/ml 青霉素（1×）。
- 使用 0.22 μm 滤器过滤基础培养基。
- 配制骨髓巨噬细胞诱导培养基：
- 取 步骤 2.1 中配制的基础培养基 50 ml。
- 加入前列腺素 E2（PGE2，分子量 352.465 g/mol），终浓度为 10-7 M。
- 加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），终浓度为 10 ng/ml。
- 骨髓巨噬细胞诱导培养基的终溶液无需过滤。
- 配制破骨细胞诱导培养基：
- 取 步骤 2.1 中配制的基础培养基 50 ml。
- 加入前列腺素 E2（PGE2，分子量 352.465 g/mol），终浓度为 10-7 M。
- 加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），终浓度为 10 ng/ml。
- 加入 RANKL，终浓度为 10 ng/ml。
- 破骨细胞诱导培养基的终溶液无需过滤。
3. 骨髓分离
- 使用二氧化碳吸入法处死一只 C57BL/6 小鼠，随后进行颈椎脱位。
注意：必须由经过培训的人员使用适当的技术、设备和试剂对啮齿类动物实施安乐死。 - 将小鼠固定在解剖板上，并用 70% 酒精喷洒。
- 解剖取出股骨、胫骨、肱骨和脊柱。
- 将小鼠仰卧位放置。沿下肢垂直方向做切口，沿股骨和胫骨长度方向分离软组织附着物进行解剖。最后，从膝关节和髋关节脱位，使骨骼完全脱离骨架。
- 沿上肢长度方向做切口以分离肱骨。通过解剖肩关节和肘关节处的软组织关节囊附着物，使肱骨脱位。
- 最后将小鼠翻转，使其呈俯卧位。沿脊柱中线做皮肤切口。观察脊柱两侧的椎旁软组织，沿脊柱骨性边缘切开，穿过椎旁软组织团块。使用剪刀在颈部基底部和脊柱末端（尾部附着点近端）横向剪断脊柱，使脊柱完全脱离软组织附着。
- 骨骼取出后，将其置于冰上的 FACS 缓冲液中保存。
- 使用滤纸清除骨骼上的肌肉和软组织。
- 将清理后的骨骼放入研钵中，加入 3 ml FACS 缓冲液。
- 用研杵和研钵轻轻研磨骨骼。
- 吸出带血的液体，通过 70 μm 细胞滤筛过滤后转移至 50 ml 锥形管中。
- 向研碎的骨骼中加入 5 ml FACS 缓冲液，进一步研磨。再次用移液器吸取液体，通过 70 μm 滤筛转移至 50 ml 锥形管中。
- 通常在新鲜 FACS 缓冲液中用研钵和研杵重复研磨骨骼两到三次，每次加入 5 ml 新鲜 FACS 缓冲液，直至液体不再呈现红色。
- 将骨髓悬液在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，获得细胞沉淀。
4. 骨髓细胞的梯度分离
- 吸去上清液，并用 10 ml 的 FACS 缓冲液（室温保存）重悬细胞。
- 取一个 50 ml 的锥形管，其中含有 10 ml 商业化的密度梯度细胞分离介质（室温）。
- 将骨髓溶液缓慢地铺加到密度梯度细胞分离介质上。使用电动移液器操作，将移液器吸头倾斜靠在锥形管内壁靠近顶部的位置，并将锥形管倾斜约 30°。调节移液器至低速模式，轻柔地排出骨髓溶液，避免扰动密度梯度细胞分离介质。
注意：最终两种溶液之间将形成清晰的分界（细胞溶液与密度梯度细胞分离介质溶液）。 - 使用室温离心机，在平衡状态下以 200 × g 离心 15 分钟，对密度梯度细胞分离介质和细胞溶液进行离心。此外，关闭离心机的加速度和减速度设置，以确保利用密度梯度细胞分离介质实现充分的相分离。
- 离心后，吸去中间混浊的层，该层含有目标骨髓细胞。
- 将这些细胞转移至新的锥形管中，并加入 20 ml 额外的 FACS 缓冲液（冰上保存）以洗涤细胞。
- 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟，获得细胞沉淀。
- 将最终的细胞沉淀重悬于 1 ml 巨噬细胞刺激培养基中，用于使用血细胞计数板进行细胞计数。
5. 细胞计数
- 取10 µl细胞悬液，与10 µl台盼蓝混合。取10 µl混合液加入血细胞计数板，测定每毫升溶液中的细胞数量。
6. 细胞培养
- 将2 ml巨噬细胞刺激培养基加入24孔板的每个孔中。
- 每孔加入200,000个细胞。
注意：根据我们的经验，细胞接种密度是实现理想培养效果的最关键因素之一 体外 破骨细胞的培养 - 轻轻振荡培养板，然后置于37 °C的普通培养箱中。
- 3 天内不要更换培养基。
- 在巨噬细胞刺激培养基中培养3天后，更换为破骨细胞培养基。
- 此后，每天更换培养基，持续5–7天，此时在培养板上应可见到较大的多核破骨细胞。
7. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
- 5–7 天后 体外 培养，从培养孔中吸出培养基。
- 用1×PBS轻柔洗涤各孔三次。
- 加入4%多聚甲醛溶液固定细胞，在4 °C孵育1小时。
- 在此期间，将TRAP染色液（可从商业途径获得）预热至37 °C。
- 在多聚甲醛中固定1小时后，吸除多聚甲醛溶液，用1×PBS轻柔洗涤3次。
- 向待染色的板的每个孔中加入1 ml预热的TRAP染色液。
- 将培养板置于37 °C培养箱中避光孵育1小时。
- 孵育1小时后，吸去TRAP染色液。
- 用预热的去离子水洗涤孔板3次。
- 用Gill苏木精复染液（注意）对孔板染色1–2分钟。
- 使用明场显微镜观察破骨细胞图像。
- 用去离子水洗涤孔板，直至染色达到适当的颜色强度，通常表现为细胞核呈现蓝色。
8. 破骨细胞吸收实验
- 使用市售的24孔聚苯乙烯培养板，该培养板预先包被有骨基质或无机结晶磷酸钙涂层。
- 向每个孔中加入2 ml巨噬细胞刺激培养基。
- 将步骤2末尾 freshly isolated 的200,000个骨髓细胞加入每个孔中。
- 在将培养板放入37 °C培养箱前，轻轻振荡混匀。
- 第3天，将培养基更换为破骨细胞分化培养基。
- 使用破骨细胞分化培养基每天更换培养基，持续5–7天。
9. 破骨细胞吸收活性的定量分析
- 5–7 天后 体外 在矿化基质上使用破骨细胞分化培养基进行培养后，按照下述方法分析矿化表面，以评估破骨细胞形成吸收陷窝的能力，此为破骨细胞活性的指标。
- 吸出骨吸收实验板中的培养基，每孔加入100 μl 10%次氯酸钠溶液。
- 将细胞与10% 漂白液在室温下孵育15分钟。
- 用蒸馏水洗涤各孔3次。
- 吸去残留的水分，甩掉平板上多余的水，室温晾干3–5小时。
- 使用市售的Von Kossa染色试剂盒对板进行复染，以便更清晰地观察未被吸收的基质。
- 使用明场显微镜拍摄吸收表面代表性区域的图像。
- 使用图像分析软件，计算骨吸收表面所占的百分比，以定量分析破骨细胞的吸收活性。
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结果
该方法的目的是简便地分离出大量破骨细胞 体外，通常在一周内完成。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP染色）确认成功分离出大量破骨细胞。图1A）。大的破骨细胞呈现为具有多个细胞核（通常 ≥ 3 个细胞核）的大型紫色细胞。采用本方案，常可分离出每个破骨细胞含有多达 30 个细胞核的破骨细胞（图1B).
使用矿化表面被认为是体外评估破骨细胞吸收活性的金标准方法。in vitro。通过该方法，可测定已形成的矿化表面百分比，即“吸收陷窝”，从而确定破骨细胞的吸收能力（图2）。
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讨论
轻松分离并大量培养破骨细胞的能力 体外 在促进骨生物学及破骨细胞介导疾病的认知方面发挥了重要作用。这一进展源于RANKL的发现，该分子最近被确认为调控破骨细胞形成、分化及存活的主要因子。16-18.
根据我们的经验， 体外 骨髓来源破骨细胞的培养在很大程度上依赖于接种密度。我们观察到，本实验方案未能成功获得破骨细胞，通常是由于骨髓来源细胞在铺板时接种密度未达到最佳条件所致。因此，本方案建议在24孔板的每个孔中接种200,000个细胞。此外，为最大限度提高该技术的成功率，建议严格按照上述方法配制破骨细胞诱导培养基，并在最初3天不干扰培养板后，自第4天起每天固定时间更换培养基，以维持破骨细胞诱导因子的稳定浓度。另外，我们发现使用特定试剂也有助于更高效地培养出大量多核破骨细胞。
该技术受限于能否获得可调节加速度和减速度参数的常温离心机，以及特定试剂的获取。除此之外，本方案非常简便，我们在不同年龄和遗传背景的小鼠中均取得了良好的实验效果。例如C57BL/6、C...
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披露
所有作者均无披露事项或利益冲突需要声明。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 DE021683、R01 DE019434、U01 HL099776、Oak基金会以及Hagey儿科再生医学实验室的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含谷氨酰胺和酚红的MEM培养基 | Gibco | 51200-038 | |
| 重组小鼠M-CSF | Gibco | PMC2044 | |
| 重组小鼠TRANCE/RANK L/TNFSF11（E. coli表达） | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| 前列腺素E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A | |
| 骨吸收检测板，24孔板 | Corning Life Sciences | 3987 |
参考文献
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