Protocol
1. Plantation
- Remplissez plateaux alvéolés (128 cellules; 28 x 54 cm avec des cellules 3 cm carrés et 5 cm de profondeur) avec un mélange de mini-mottes. Pour faciliter le remplissage uniforme des cellules comprimer sol dans chaque plateau à l'aide d'une fiche bac vide.
- Plante graines de laitue ¼ de pouce de profondeur 2-3 graines par cellule. Toutes les lignes expérimentales dans des bacs répliquées usine pour fournir à la fois une sécheresse souligné et les plateaux de contrôle pour l'essai de la sécheresse.
- Placez plateaux alvéolés dans un bac de base sans trous.
- plateaux de l'eau et la couverture avec bac inversé ou dôme en plastique. La germination se produit normalement dans 48 à 72 h. Après la germination, enlever le couvercle et déplacer les plateaux en serre.
NOTE: Ce protocole pourrait également être effectuée dans des chambres de croissance.
2. Croissance et entretien des plantes
- plateaux de l'eau si nécessaire 1-4 semaines après la germination, normalement ce est 2-3 fois par semaine, en remplissant le bac inférieur et permettant sol pour devenir saturé (~ 1 h) rayons de se asseoir pendant une période prolongées dans l'eau, car cela pourrait avoir un impact négatif sur la santé des plantes et le développement des racines et peuvent affecter l'écran de la sécheresse.
- Fertiliser plateaux une fois par semaine avec un engrais 20-20-20 soluble commerciale mélangé à un taux de 1,5 c / gal.
- Plaques minces à une plante par cellules 1-2 semaines après la germination.
3. Initier stress hydrique
- Lorsque les plantes sont de vieilles quatre semaines plateaux séparés en 2 groupes. Sous réserve d'un groupe à un stress hydrique sévère. Utilisez les autres magasins commandes bien arrosées. L'eau du groupe témoin comme dans l'étape 2.1 pendant toute l'expérience. Lors de l'ouverture de la contrainte de la sécheresse de suspendre la fertilisation tous les bacs pour le reste de l'expérience.
- La période de sécheresse expérimentale se produit plus d'une semaine. Sur la première journée du procès de stress de la sécheresse (jour 0) remplir tous plateaux inférieurs avec de l'eau et laisser le sol dans les bacs à fiches afin de devenir complètement saturé puis égoutter l'eau de plateaux. Saturant le sol immédiatement avant le début de til période de stress aidera à minimiser toute variation de l'humidité du sol entre les cellules individuelles dans les plateaux alvéolés.
4. Conduite de l'écran de stress de base sécheresse avec les paramètres à mesurer
REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent comment recueillir les trois mesures physiologiques qui seront enregistrés au cours de l'écran de la sécheresse alors que le tableau 1 fournit un calendrier des mesures prises sur chaque jour de la période d'essai sécheresse stress.
- Mesurer la Feuille relative Teneur en eau (RWC) aux jours 0, 2, 4 du procès.
- Clips une plante de laitue dans le bac et retirez deux feuilles.
- Percez trois disques de chaque feuille en utilisant un perce-bouchon # 9 (~ 1,6 cm de diamètre). Combinez poinçons de feuilles comme un échantillon.
- Peser les disques de feuilles, ce est la valeur de poids frais (FW) utilisé pour le calcul RWC, puis placer les disques dans une boîte de Petri.
- Ajouter de l'eau distillée juste assez pour la plaque à tousow tous les disques de feuilles de flotter. Ce est bien hydrater les disques de feuilles de recueillir poids turgescents pour l'analyse RWC. Laisser les disques de feuilles de flotter pendant 24 heures à température ambiante.
- Retirez les disques de feuilles maintenant pleinement hydratés des plaques et doucement sécher l'extérieur des disques de feuilles avec du papier absorbant avant de peser les disques. Enregistrez ces poids que le poids turgescents (TW) pour le calcul RWC.
- Lieu disques de feuilles sur un laboratoire de papier essuyer ou un disque de papier filtre dans une boîte de Pétri ouverte et sec dans un incubateur à 55 ° C pendant 24 heures.
NOTE: Le papier empêche les disques de feuille d'adhérer à la boîte de Pétri pendant le séchage. - Peser disques de feuilles sèches et enregistrer les poids secs (DW) pour le calcul RWC.
- Calculez RWC utilisant la formule de Weatherley comme décrit par Smart et Bingham 11,12.
RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
FW = poids frais, TW = poids turgescents, DW = poids sec - Répétez l'étape 4.1 pour chaque matériel génétique et de traitement dans l'essai.
- Enregistrer la plante veux début une fois par jour le jour 1 de l'essai de stress de la sécheresse et se terminant lorsque 100% des plantes sont fanées, normalement 4 ou 5 jours.
- La phase de récupération et de différentiel de croissance
- Au jour 6, de conclure la période sécheresse stress et les plantes stressées entrent dans la phase de récupération du procès. Remplissez les plateaux inférieurs avec de l'eau et permettre aux plateaux victimes de la sécheresse à tremper pendant 24 heures avant de reprendre le programme d'arrosage standard, étape 2.1, que les plateaux de contrôle.
- Permettre à tous les plantes de récupérer pendant 10 jours.
- 10 jours après la sécheresse-stress récolter l'ensemble dessus de la portion de terrain de chaque plante et enregistrer le poids frais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lors de l'exécution d'un grand écran afin de séparer une population par le trait expérimentale souhaitée, dans le cas de ce protocole réponse sécheresse stress, les données générées seront en conséquence être varié de très soulignent sensibles à susceptibles tolérant à la sécheresse et tous les points entre les deux. Figure 1 contient des graphiques représentant le type de résultats que l'on peut attendre de ce protocole. Cultivars représentatifs de trois types de laitue différentes (Romaine (cos), pommée, laitue pommée et) sont inclus dans les données présentées. Bien que les données représentant seulement trois types de laitue sont présentés ici ce protocole a été élaboré lors de la projection de milliers de laitue et les épinards matériel génétique dans la plupart des types. En plus des trois types de laitue mentionné précédemment ce protocole a été utilisé avec succès à l'écran feuille rouge et vert et de la tige de type laitue avec du matériel génétique de l'espèce serriola Lactuca étroitement liés ainsi que l'indépendant leafy épinards légume vert. Les auteurs ont utilisé les données générées en utilisant ce protocole pour affiner une collection de laitue de plus de 4000 à un bassin de candidats de 200 variétés de laitue pour les essais sur le terrain.
Figure 1. Les résultats représentatifs Les données présentées sont représentatives des trois mesures physiologiques inclus dans ce protocole pour trois types de laitue romaine, y compris (cos, ROM), pommée (CRSP) et butterhead (MAIS). (A) Le pourcentage de plantes qui sont fanées sur chaque jour de la période de sécheresse-stress du procès, à partir du jour 1, est enregistré jusqu'à ce que toutes les plantes atteignent 100% fanées. (B) Feuille teneur relative en eau est mesurée aux jours 0, 2 et 4. -D : sécheresse stress, C:. commande (C) Poids des plantes après la période de sécheresse-stress et de récupération de 10 jours montrant différentiel de croissance en raison desécheresse stress. Les barres d'erreur représentent l'écart type. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. plateaux représentatifs et des exemples de diagrammes plantation (A et B) Exemple plateaux montrent la réponse à la sécheresse l'accent sur trois jours d'un procès en utilisant ce protocole par rapport aux plateaux de contrôle. (C et D) Ces diagrammes de plateau représentent les plateaux alvéolés 128 utilisés montrant deux méthodes de plantation utilisés dans ce protocole. Les bords externes des plateaux (gris cellules ombrées) doivent être plantés, mais non utilisées pour les échantillons expérimentaux, en raison de la propension des cellules de bordure pour sécher plus rapidement que les cellules intérieures.
| Jour | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| RWC-FW | X | X | X | ||||
| Wilt | X | X | X | X | (X) | (X) | |
| Retenir l'eau | X | ||||||
| Reprendre l'arrosage | X |
Tableau 1. Calendrier de la période de sécheresse-stress. L'eau est retenu sur le dispositif expérimentalplateaux ouverts à compter du jour 0 de l'essai et arrosage reprend le jour 6. Des échantillons frais de mesures de teneur en eau par rapport à lames sont prises aux jours 0, 2, 4, et le pourcentage de plantes flétries sont enregistrées début par jour le jour 1 et jusqu'à 100 % des plantes sont fanées, normalement jour 4, mais peut se étendre à jour cinq ou même six.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Considérations de numéro de l'échantillon pour l'écran.
Le nombre d'échantillons nécessaires devrait être basée sur l'utilisation souhaitée des données à partir de cet écran. Si les résultats de la qualité de la publication sont souhaitées il est recommandé de récolter trois plantes individuelles (3 réplicats biologiques) de chaque ligne et effectuer un minimum de deux répétitions expérimentales de donner des points adéquates pour l'analyse statistique de la qualité. Si le résultat souhaité est simplement de réduire rapidement une grande piscine de matériel génétique candidat pour effectuer des expériences de stress hydrique plus strictes ou plus complexes, moins d'échantillons et de répétitions ou peuvent être nécessaires. Le nombre d'échantillons requis doit être décidé au moment de la plantation.
mise en page de plantation et les considérations de l'assèchement du sol dans des plateaux.
Un élément très important est que le sol dans des cellules sur le bord du plateau de prise sèche plus rapidement que les cellules et les soins intérieursdevraient être prises pour éviter les biais dans les résultats que par la récolte des plantes de l'intérieur du plateau (Figure 2). Seulement la récolte des plantes à partir des cellules intérieures influencera probablement la disposition de la plantation du plateau. Au cours de l'écran dans lequel ce protocole a été développé entre 3 et 6 germoplasme a été planté par plateau de prise avec un cultivar de laitue de commande. L'un des défis de dépistage de la tolérance à la sécheresse dans une culture de la spécialité est souvent il ne existe pas de matériel génétique tolérant ou susceptibles stress savoir d'utiliser des contrôles positifs ou négatifs. Lorsque aucun contrôle positif ou négatif est disponible que dans le développement de ce protocole l'utilisation d'un matériel génétique standard dans tous les essais permet un niveau de base du contrôle interne de la variabilité des conditions tout au long de chaque écran. Le nombre de matériel génétique différent qui peut être planté contribuera directement à la vitesse à laquelle une collection de matériel génétique peut être projeté, mais il est limité par le nombre de plantes nécessaires à each mesure prise au cours du procès. En limitant le nombre de matériel génétique unique dans chaque bac à entre 3 et 6 tout laitue peuvent être plantés en deux emplacements dans chaque plateau assurant qu'aucune laitue est planté dans seules les cellules extérieures. Une autre considération est que la variabilité des taux de croissance et la taille de la plante entre matériel génétique peut conduire à des taux réduits de l'assèchement du sol dans des cellules contenant de petites variétés. Cela pourrait biaiser les résultats dans la direction de petites variétés étant plus représentée parmi potentiel matériel génétique résistant à la sécheresse tiré de cet écran, mais cela ne semble pas être le cas sur la base des résultats observés. En outre, l'utilisation de méthodes secondaires sévères pour étudier le matériel génétique de candidat de ce protocole devrait confirmer ou infirmer ces résultats.
L'importance de la cohérence sur l'observation de la flétrissure.
Le contrôle des installations pour flétrissement doit être effectuée en mêmetemps quotidien pour éviter de petites fluctuations dans l'apparition de stress des plantes, a observé que la flétrissure, probablement causée par les fluctuations présentes dans une serre ainsi que la régulation circadienne des stomates température et d'humidité. Aussi, soyez sûr d'être cohérent quand marquant plantes fanées ou non. L'établissement d'un ensemble de lignes directrices dans la notation flétrissement est particulièrement important si plusieurs personnes se produiront l'écran pour assurer des résultats cohérents. Le seuil utilisé pour ce protocole est toutes les feuilles de la plante doivent être fanées de marquer la plante comme étant flétries.
Sélection des paramètres mesurés.
Les paramètres mesurés dans ce protocole ont été choisis en fonction de leur utilité pour identifier le stress de l'eau ainsi que la capacité d'adaptation des mesures à un système de débit semi-haute en utilisant la main-d'œuvre disponible minimal. Beaucoup d'autres mesures peuvent être très utiles pour identifier la sécheresse-stress (par exemple., L'activité photosynthétique, La croissance des racines, la conductance stomatique ...), et sur la base de la nature de l'écran qui sera effectuée (ce est à dire, le nombre de matériel génétique utilisé, nombre de répétitions, vitesse désirée de débit ...) d'autres paramètres peuvent être facilement intégrés dans cet écran.
Commentaires sur l'utilisation des résultats de protocole.
Les collections de l'USDA contient plus de 4000 individus matériel génétique de la laitue qui est un nombre qui fait des essais de terrain Comprenant tout le matériel génétique impraticable. Ce protocole a été développé dans le but de permettre seul un très petit nombre de chercheurs (1-2 personnes) pour cribler des collections de l'USDA pour la tolérance à la sécheresse potentiel. Grâce à l'utilisation de ces méthodes de collecte de l'USDA a été réduit à 200 variétés qui ont ensuite été utilisées dans les essais sur le terrain qui peuvent reproduire plus étroitement les conditions sécheresse stress. Ce protocole a été également utilisé pour réduire une population de plus de 400 épinards matériel génétique à 40 pour une utilisation dans le domaine trials. Ce protocole seul ne devrait pas être considérée comme suffisante pour identifier avec un degré élevé de certitude matériel génétique qui contient tolérance à la sécheresse durable, dans des conditions de stress hydrique, mais peut simplement servir d'outil pour cribler rapidement pour le potentiel tolérance au stress dans des conditions de déficit hydrique dans un écran rapide et efficace en utilisant un grand nombre de matériel génétique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plug tray 128 | T.O. Plastics Hummert International |
11-8595-1 | Any brand plug tray will work, but use the same style of trays for all trials. |
| lower tray (Display tray) | T.O. Plastics Hummert International |
11-3305-1 | |
| plug/planting mix (Sunshine Mix #5) | Sunshine Hummert International |
10-0467-1 | A different mix may need to be substituted if adapting this protocol to a different crop. Sunshine mix #4 was used in spinach trials. |
| fertilizer (20-20-20) | Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International |
07-5915-1 | Any fertilizer can be used, adjust type as needed for adapting this protocol to specific crop needs. |
References
- Dijk, A. I. J. M., et al. The Millennium Drought in southeast Australia (2001–2009): Natural and human causes and implications for water resources, ecosystems, economy, and society. Water Resour. Res. 49, (2013).
- Aghakouchak, A., Feldman, D., Stewardson, M. J., Saphores, J., Grant, S., Sanders, B. Australia’s Drought: Lessons for California. Science. 343, 1430 (2014).
- Tolomeo, V. California Agricultural Statistics 2012 Crop Year. USDA National Agricultural Statistics Service Pacific Regional Office-California. , http://www.nass.usda.gov/Statistics_by_State/California/Publications/California_Ag_Statistics/Reports/2012cas-all.pdf (2013).
- Cavagnaro, T., et al. Climate Change: Challenges and Solutions for California Agricultural Landscapes. White paper CEC-500-2005-189-SF. California Climate Change Center. , Available from: http://www.energy.ca.gov/2005publications/CEC-500-2005-189/CEC-500-2005-189-SF.PDF (2005).
- Lobell, D. B., Gourdji, S. M. The Influence of Climate Change on Global Crop Productivity. Plant Physiol. 160, 1686-1697 (2012).
- Jackson, L. E., Stivers, L. J. Root distribution of lettuce under commercial production: implications for crop uptake of nitrogen. Biological Agriculture and Horticulture. 9, 273-293 (1993).
- Jackson, L. E. Root architecture in cultivated and wild lettuce (Lactuca spp). Plant. Cell and Environment. 18, 885-897 (1995).
- Malcom, S., Marshall, E., Aillery, M., Heisey, P., Livingston, M., Day-Rubenstein, K. Agricultural Adaptation to a Changing Climate: Economic and Environmental Implications Vary by U.S Region. USDA Economic Research Service. Economic Research Report Number. 136, Available from: http://www.ers.usda.gov/media/848748/err136.pdf (2012).
- Chaves, M. M., Maroco, J. P., Pereira, J. S. Understanding plant responses to drought- from genes to the whole plant. Funct. Plant Biol. 30, 239-264 (2003).
- Ingram, J., Bartels, D. The Molecular Basis of Dehydration Tolerance in Plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 377-403 (1996).
- Weatherley, P. E. Studies in the water relations of the cotton plant. I. The field measurement of water deficits in leaves. New Phlytol. 49, 81-97 (1950).
- Smart, R. E., Bingham, G. E. Rapid Estimates of Relative Water Content. Plant Physiol. 53, 258-260 (1974).
