This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Specialized immunceller, der infiltrerer tumormikromiljøet regulere væksten og overlevelsen af neoplasi. Maligne celler skal undvige eller undergrave anti-tumor immunrespons for at overleve og trives. Tumorer drage fordel af en række forskellige mekanismer immun "escape" herunder rekruttering af tolerogenisk DC, immunosuppressive regulatoriske T-celler (tregs) og myeloide afledte suppressorceller (MDSC), som inhiberer cytotoksiske anti-tumor respons. Omvendt kan anti-tumor effektor immunceller langsom vækst og ekspansion af maligniteter: immunstimulerende dendritiske celler, naturlige dræberceller, som huser medfødte anti-tumor immunitet, og cytotoksiske T-celler alle kan deltage i tumor suppression. Balancen mellem pro- og anti-tumor leukocytter i sidste ende afgør opførsel og skæbne for transformerede celler; et væld af humane kliniske undersøgelser har båret dette ud. Således detaljeret analyse af leukocytundergrupper indentumormikromiljøet er blevet stadig vigtigere. Her beskriver vi en fremgangsmåde til analyse af infiltrerende leukocytundergrupper stede i tumormikromiljøet i en mus tumormodel. Mouse B16 melanoma-tumorceller blev inokuleret subkutant i C57BL / 6-mus. På et bestemt tidspunkt, blev tumorer og omgivende hud reseceret en bloc og forarbejdet til enkeltcelle-suspensioner, som derefter blev farvet for flerfarvede flowcytometri. Ved hjælp af en bred vifte af leukocyt delmængde markører, var vi i stand til at sammenligne de relative procentdele af infiltrerende leukocytundergrupper mellem kontrol og chemerin-udtrykkende tumorer. Efterforskere kan bruge sådan et værktøj til at studere immun tilstedeværelse i tumormikromiljøet og når det kombineres med traditionelle skydelære størrelse målinger af tumorvækst, potentielt vil give dem mulighed for at belyse effekten af ændringer i immun sammensætning på tumorvækst. En sådan teknik kan anvendes på en hvilken som helst tumor model, hvor tumoren og dens mikromiljø Cen skal resekteres og behandles.
Balancen mellem tumorvækst og fremme og regression er delvist afhængig af balancen mellem pro- og anti-tumor infiltrerende leukocytter til stede i mikromiljø 1,2. For at undersøge tumormikromiljøet (TME) og specifikt at identificere de infiltrerende leukocytunderpopulationer, har vi udviklet en metode til vurdering af subkutane tumorer i en murin tumormodel. Vigtigheden af at studere tumormikromiljøet er velkendt og støttet i litteraturen. Talrige undersøgelser har vist, at balancen i pro- og anti-tumor infiltrerende immunceller kan påvirke resultaterne af tumorvækst, ikke kun i mus, men også humane undersøgelser (oversigt i 3,4). For eksempel Curiel et al., Viste, at forværret kliniske resultater i ovariecancerpatienter blev korreleret med tilstedeværelse af stigende procentdele af tumor-infiltrerende regulatoriske CD4 + T-celler (tregs) 5. Vores eget arbejde viste også virkningen af et ikkeVel leukocyt kemoattraktant på forholdet mellem leukocytundergrupper i en mus melanom model 6, som også korreleret med nedsat tumorvækst. Således de detaljerede analyser af leukocytundergrupper inden for en tumor er nu mere bredt anerkendt og stadig vigtigere.
Der er mange måder at evaluere tumormikromiljøet for infiltrerende leukocytter; for eksempel grupper har udviklet transgene mus til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner med henblik på at afbilde TME 7 klassisk immunhistokemi og immunofluorescens af konserverede afsnit 8, herunder forskellige afbildningsmodaliteter såsom MRI, PET, konfokal mikroskopi 9-11 – nogle med evnen til at overvåge intravitally 10,12. Disse kan anvendes med forskellige molekylære imagografimidler, såsom nanopartikler 13 eller hidtil ukendte kontrastmidler 14 mærket immunceller. Vores metode er en flowcytometri tilgang og har flere fordele.For det første kan tages prøver hele tumormikromiljøet; på tidspunktet for analysen, er hele subkutan tumor og omkringliggende periferien kirurgisk reseceret til forarbejdning. Dette eliminerer enhver potentielt prøveudtagning forspænding inden for en enkelt tumor, og giver en mere "global" analyse af tumoren som helhed. For det andet, ved hjælp af flerfarvet flowcytometri at analysere leukocytundergrupper giver os mulighed for mere specifikt at måle fænotypen af infiltrerende leukocytter. Afhængig af antallet af anvendte farver, kan identificeres meget specifikke delmængder. Dette er vigtigt, da der er flere leukocytundergrupper inden for en bestemt celletype – eller endda i en generel subtype klassificering – som har forskellige funktioner, som er potentielt betydning for, skæbne tumoren. For eksempel har plasmacytoide dendritiske celler (PDC) været impliceret i anti-tumor immunitet 15. CCR9 + delmængde af pdCs har imidlertid vist sig at være tolerogen 16 og flytte balanse af sådan en delmængde kan have en indvirkning på tumorvækst.
Vores metode er egnet til subkutan eller andre tumorer, der kan resektion en bloc. I vores hænder blev tumorer ensartet resekteret på tidspunktet for eutanasi. Det er imidlertid tænkeligt, som er blevet gjort i nogle undersøgelser, at en subkutan tumor kunne resektion med lukning af den omgivende hud i en overlevelse kirurgi 17, således at yderligere vurdering af dyret. Analysen udføres derefter på den resekterede tumor. Således repræsenterer resultaterne en enkelt tidspunkterne i tumoren udvikling. Mens dette giver et detaljeret indblik i mikromiljøet, er det også et statisk billede af, hvad der er ingen tvivl om en dynamisk proces. Imidlertid isolerede leukocytter (fx via magnetisk separation eller densitetsgradient) kan derefter analyseres separat fra tumoren epitel og stroma eller anvendes i andre, funktionelle assays til yderligere at definere deres fænotype, som det har været tidli-gere beskrevet 18. Denne metode ville så være nyttig for alle forskere interesseret i at forstå sammensætningen af leukocytterne i tumormikromiljøet på et givet tidspunkt, enten i indstillingen af det naturlige sygdomsforløb, eller efter en bestemt terapeutisk perturbation. Selvom det ikke er gjort af os, variationer af denne procedure kan også potentielt anvendes til at analysere specifikke dele af en tumor i isolation. For eksempel, givet størrelsen af tumoren, den perifere zone (r) kan dissekeres væk fra den centrale, eventuelt nekrotisk kerne af tumoren for at give forskeren en mere rumligt adskilt visning af tumormikromiljøet.
I den spirende området tumor immunologi, vil der uden tvivl være en eksponentielt stigende antal studier, der evaluerer nye immunmodulerende midler i murine tumormodeller. Adskillige rapporter har understreget forskellene i specifik leukocyt funktion i tumoren versus den perifere enjø. For eksempel Shafer-Weaver et al. Viste i en musemodel som antigen-specifik T-effektorceller CD8 + celler, medens aktiv i periferien, blev transformeret ind i CD8 + T-suppressor-celler, når de solgt til tumormikromiljøet 19. Dette var til dels på grund TGFp, men andre faktorer er sandsynligvis involveret. Således evaluering leukocytundergrupper – tal og forhold, samt funktionelle status – vil i tumoren selv give en mere nøjagtig gengivelse af effekten af en særlig immunmodulation på tumor skæbne.
Vores teknik gør det muligt detaljeret analyse af tumor og giver forskeren mulighed for at tættere finde ændringer i leukocytpopulationer end tidligere metoder.
Udførelse detaljeret analyse af tumormikromiljøet, er afgørende for de mekanismer og effekter af immunmodulering. Med den stigende forekomst af ImmunoTherapeutics i den humane kliniske rige, forstå virkningen af disse midler på tumorinfiltrerende leukocytter bliver nødvendige i at definere deres virkningsmekanisme. Hos mennesker ofte findes der kliniske og / eller logistiske problemer med at opnå og analysere tumorvæv for leukocyt delmængde analyse, og dermed analyse af svaret perifere immun udføres ofte…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud R01-CA169354 og R01-047822 fra National Institutes of Health og en Merit Award fra Institut for Veterans Affairs (ECB). RKP blev støttet af NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, Californien Breast Cancer Research Project Fellowship, og en American Cancer Society mentored Research Scholar Grant; BAZ blev støttet af NIH tilskud AI079320. JM blev støttet af stipendier fra NIH T-32 uddannelse tilskud T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 og American Cancer Society ph.d.-stipendium PF-12-052-01-CSM.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |