التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

Abstract

عيوب الحركي الناتجة عن الاضطرابات العصبية يمكن أن يكون أحد أعراض ظهور المرض في وقت متأخر، بعد سنوات من الانحطاط تحت الإكلينيكي، والاستراتيجيات العلاجية الحالية وبالتالي ليست شافية. من خلال استخدام كامل تسلسل exome، وقد تم تحديد عدد متزايد من الجينات تلعب دورا في الحركة البشري. على الرغم من تحديد هذه الجينات، فإنه ليس من المعروف كيف أن هذه الجينات هي الحاسمة لسير قاطرة العادي. ولذلك، فإن فحص موثوق بها، التي تستخدم الكائنات نموذج لتوضيح دور هذه الجينات من أجل تحديد أهداف جديدة للالفائدة العلاجية، هناك حاجة أكثر من أي وقت مضى. لقد قمنا بتصميم نسخة توعيتهم للمقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية التي تسمح للكشف عن العيوب أكثر اعتدالا في وقت سابق، ولديه القدرة على تقييم هذه العيوب بمرور الوقت. ويتم تنفيذ في كوب فحص تخرج اسطوانة، التي أغلقت مع فيلم الحاجز الشمع. عن طريق زيادة المسافة عتبة للتسلق إلى 17.5 جم وزيادة مدة التجربة لمدة 2 دقيقة لاحظنا وجود حساسية أكبر في الكشف عن الخلل التنقل خفيفة. ويكلف فحص فعال و لا يتطلب تدريبا مكثفا للحصول على نتائج استنساخه للغاية. وهذا يجعل من تقنية ممتازة لفحص المخدرات مرشح في المسوخ ذبابة الفاكهة مع عيوب الحركة.

Introduction

يتم التعرف على الاضطرابات العصبية المدمرة مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري، والشلل النصفي التشنجي وراثي على نحو متزايد. لسوء الحظ، فإن معظم هذه الاضطرابات العصبية لا تزال دون معالجة. الاستخدام السريري على نطاق واسع، الاختبارات الجينية مشاركات الجينوم على نطاق مثل كله التسلسل exome أدى إلى تزايد عدد الجينات بالتورط في الاضطرابات قاطرة الإنسان. على الرغم من هذا التقدم، والتقدم المرضي من أوائل حتى مراحل متأخرة، لا يزال بعيد المنال في هذه الاضطرابات. يوفر ذبابة الفاكهة واحدة مع الأدوات الوراثية لدراسة متطلبات الجين بطريقة المكانية والزمانية التي تسيطر عليها. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت ذبابة الفاكهة مفيد في فحص المخدرات لظروف عصبية مثل الشلل الرعاش ^{1، 2} مرض الزهايمر أو الإعاقة الفكرية ^{3،4 5،6} والصرع وغيرها. كان هدفنا لتطوير فعالة من حيث التكلفةوفحص موثوق بها من شأنها أن تسمح تحليل الإنتاجية العالية التي من شأنها أن تكون لا تزال حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في الأداء الحركي.

هناك عدة فحوصات تستخدم لتحديد آثار الطفرات الوراثية و / أو الظروف البيئية على السلوك تسلق ذبابة الفاكهة. معظم المقايسات الاستفادة من الميل الطبيعي للذباب في الصعود، والمعروفة باسم انجذاب بالجاذبية السلبية، أو فحص التسلق. بنزر ⁷ اقترح في عام 1967 أن جهاز مكافحة الحالية المستخدمة لدراسة انجذاب ضوئي ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة gravitaxis. ومنذ ذلك الحين، Ganetsky ⁸ وغيرها الكثير ^{9 -12} قد بنيت على فحص الأولي. المبدأ هو وضع عدد معروف من الذباب في قارورة والاستفادة من قنينة بقوة ضد سطح صلب، مما تسبب في الذباب ان يسقط الى أسفل القارورة. كما هو سلوك فطري، فإن الذباب تحاول الصعود إلى أعلى القارورة، بدلا من الجاذبية. هذا الاختبار هو الكمي وmeasuوارتفعت الدقة كم عدد الذباب الماضي علامة على القارورة خلال فترة الوقت المحدد. أصبح قياس سرعة بدلا من العدد الكلي للذباب تسلق معلمة موثوقة وأظهرت عيوب في الحالات التي يكون فيها عدد من المعايير الذباب ليس كبيرا ^(13).

وقد أثبت الفحص تسلق مفيدة في دراسة العديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون ^14. ومع ذلك، لاحظنا أن العيوب قاطرة قد لا تكون قابلة للكشف في وقت حيث ينظر التنكس العصبي بالفعل في دراسات باثولوجية ^14. وبالتالي، استخدام الفحص التقليدي قد تحد من القدرة على دراسة المراحل المبكرة من المرض والتسبب. ظهور عيوب قاطرة خلال مراحل لاحقة من أمراض قد تعكس مرض الذي تقدم هو متقدمة جدا لإنقاذ كاملة.

هذا يثير مشكلة محتملة مع حساسية مقايسة تسلق التقليدي. عدم القدرة المحتملة للالتقليديينtional تسلق فحص للكشف عن العيوب قاطرة خفيفة ويمكن أن يعزى إلى الارتفاع الذي يطلب فيه من الذباب في الصعود. التقليدية التدابير فحص ^15،16 عدد من الذباب لتسلق بنجاح على ارتفاع 2-5 سم في 10 إلى 20 ثانية.

Protocol

كان البحث على ذبابة الفاكهة السوداء البطن في الامتثال مع جامعة المبادئ التوجيهية للبحوث ألبرتا.

1. يطير مجموعة

1. جمع 20 الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون _{2 (ز)} تخدير ووضعه في 25 ملم × 95 ملم جمع قارورة تحتوي على المواد الغذائية.
2. مخزن قارورة تحتوي على الذباب أفقيا لتجنب محاصرة الذباب في أي السوائل التي قد تتراكم في الجزء السفلي من القارورة.
3. احتضان الذباب للا يقل عن 21 ساعة على 22 ° C في 45٪ الرطوبة في الحاضنة لمدة ما يقرب من 15 ساعة. تعيين حاضنة مع ضوء 12 ساعة: دورة الظلام.

2. تسلق الفحص

1. في صباح اليوم التالي، ونقل 20 الذباب من قنينة واحدة في كوب 250 مل تخرج اسطوانة. بمناسبة موقف اسطوانة ليبقيه ثابتا كل يوم. استخدام واحدة اسطوانة الزجاج في التركيب الوراثي لمنع التلوث المتبادل بين الأنماط الجينية. يغسل في نهاية كل تجربة وريال عمانياألمد لهم بين الأنماط الجينية.
   1. إجراء تجارب في الضوء المحيط (أو الضوء الأحمر إذا كان هناك خلل محتمل في رؤية) في درجة حرارة ورطوبة 22 ° C و 40٪ على التوالي. لتجنب إيقاع الساعة البيولوجية يخزي، نفذ دائما التجارب في نفس الوقت من اليوم.
2. ختم الجزء العلوي من اسطوانة مع فيلم الحاجز (فيلم الشمع) لمنع هروب أي الذباب (الشكل 2).
3. إعداد كاميرا الفيديو على حامل ثلاثي الأرجل. الكاميرا التركيز على خط 190 مل من 250 مل تخرج اسطوانة (17.5 سم).
4. حساب عدد من الذباب الميت في الجزء السفلي من الاسطوانة وفي قارورة الغذاء. تسجيل هذا الرقم كما في وفيات.
5. بخفة جدا الاسطوانة ضد سادة رغوة الخلايا المغلقة مرارا وتكرارا مع ما يكفي من القوة لإزاحة الذباب على السطح السفلي الداخلي. الاستفادة من 5-10 مرات بينما تستخدم اليد الأخرى للضغط سجل على الكاميرا.
6. اضغط على "سجل" الموجود على الكاميرا.
7. بدء فيدEO كاميرا تسجيل والاستفادة من اسطوانة ست مرات في نمط غير إيقاعية متميزة.
8. إجراء كل محاكمة لمدة 2 دقيقة من الوقت الذي يتم استغلالها آخر الذباب وتسجيل عدد من الذباب عبور ارتفاع 17.5 سم (190 مل) في كل نقطة زمنية المختار (قياس كل 10 ثانية). ملاحظة: إن مل وضع علامات على اسطوانة تختلف من نموذج اسطوانة واحدة إلى أخرى اعتمادا على قطر. لتجنب الخطأ، وقياس ارتفاع على كل اسطوانة المستخدمة.
9. وبمجرد أن المحاكمة قد انتهت، والتخلص من الذباب في الايثانول 95٪.
10. كرر الخطوات من 2،1-2،9 حتى يتم اختبار جميع مكررات مع الذباب جديدة في كل مرة.
    ملاحظة: على الرغم من 5 مكررات قد يكون كافيا مع الطفرة التي لها تأثير قوي على الحركة، 10 مكررات البيولوجية لل20 الذباب (200 الذباب) ويوصى للكشف عن الفروق الصغيرة.
11. عند الانتهاء من التجربة، وغسل اسطوانات في غسالة الصحون المختبر وO جاف / N لإعادة استخدامها.

تحليل 3.

1. Analyأشرطة الفيديو زي كل تطير المحاكمة. كل 10 ثانية، وتسجيل عدد من الذباب الذي اجتياز خط المرمى.
   1. إذا ذبابة يصعد إلى أسفل أو السقوط، سجل أن يطير -1 والاعتماد الطاير المقبل لعبور خط الهدف في نفس العدد الطاير أن قفز إلى أسفل أو سقط. على سبيل المثال، إذا انخفض ذبابة ^ال 15 تحت خط الهدف، الطاير المقبل لعبور خط (16 ^تشرين تطير) تعتبر ذبابة ^ال 15 وليس ^ال 16.
2. طرح معدل الوفيات الناجمة عن العدد الإجمالي من الذباب (20) للحصول على عدد من الذباب التي تبقى في المحاكمة. في كل نقطة زمنية، يجب الحصول على جزء من الذباب فوق خط المرمى.
3. رسم كل نسبة في كل نقطة زمنية (انظر الشكل 3).
4. تحليل أداء عند نقطة البيانات 120 ثانية وأداء الطالب اختبار t عند وجود 2 مجموعات أو ANOVA والاختبار البعدي للمقارنات متعددة (مع تعديل Bonferroni للتخطيط وتوكي للتعاون غير المخطط لهmparisons). وكولموجوروف-سمرنوف ¹⁷ تتم أيضا للتأكد من الوضع الطبيعي والتباين على قدم المساواة ولكن أيضا لمقارنة توزيع مجموعة متحولة إلى عنصر التحكم.
5. لتقديم البيانات عبر الشيخوخة، ورسم النسبة المئوية للذباب تسلق في 120 ثانية مع الذباب من مختلف الأعمار (2 أيام، 1 أسبوع، 2 أسابيع) لمعرفة ما إذا كان هناك عجز التدريجي (الشكل 4).

Representative Results

تسلق هو سلوك قوي وقابلة للتكرار. في الواقع، في يوم من الأيام القديمة الذباب من النوع البري تصل إلى أداء تسلق مسافة الهدف بسرعة (25-30 ثانية). الذباب متحولة تمثل مجموعة من الأداء بين معتدلة (أو تأخر) لإكمال عدم القدرة على الصعود إلى الهدف. نحن لتوضيح هذا هنا مع اثنين من الأليلات الطافرة مختلفة. أول واحد هو أليل شديد في spastin الجين عن طريق الحذف الكامل للجين spastin (المنتجعات ^{5.75) 18.} في هذا الخط (المنتجعات ^5.75 مع TM6b) يوم واحد الذباب القديمة لا تصل WT أداء تسلق حتى بعد 2 دقيقة. ويعرض هذا الخط متحولة مع عيوب شديدة حتى عند استخدام الأسلوب قارورة (الشكل 1A، B). الاستفادة من الطريقة المعروضة هنا يصبح أكثر وضوحا عند دراسة متحولة لنفس الجين ولكن مع حذف ناقصة نشرت من قبل نفس المجموعة (المنتجعات ^17-7 مع TM3) ^18. في هذا الأداء حالة ما يصل إلى 8 أيام من الطبيعي (الشكل 1C-F ترونج>). في 8 أيام، تلك الذباب تعرض لاحظ وجود خلل في تسلق إلى أن تكون خفيفة ولكنها مهمة في طريقة اسطوانة ولكن ليس في طريقة قارورة لنفس العدد من التكرار. هذا قد يوحي بأن باستخدام أكبر مسافة الهدف يسمح للكشف عن عيوب في المسوخ أقل حدة. اختيار الضوابط المناسبة وراثيا يضمن أن التأثير هو نتيجة التعبير المعدلة وراثيا (الشكل 3) أو التفاعل الوراثي. لمزيد من الإثبات، وتشمل إنقاذ النمط الظاهري السلوكي مع التعبير عن بروتين من النوع البري لجين دراستها. للدراسات التفاعل، مقارنة الذباب التي هي متخالف لكل من الطفرات في المصالح مع الذباب الذي لا تملك إلا طفرة واحدة من الفائدة. كما يسمح للفحص واحد لمراقبة تطور الخلل التسلق على مر الزمن، جانبا هاما في نمذجة اضطرابات الحركي التقدمية (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، 2 دقيقة تسمح لرؤية أفضل تطور تسلق في المسوخ شديدة.

الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما">
الشكل 1. مقارنة المقايسات تسلق مختلفة للحصول على طفرات حادة يمكن أن ينظر إلى درجات مختلفة من تسلق عيب باستخدام أساليب مختلفة ولكن الطفرات أكثر اعتدالا قد لا يتم الكشف مع بعض المقايسات. لشرح هذا استخدمنا خطين متحولة تنشر لspastin الجينات: spastin ^5-75 الذي يحتوي على الحذف الكامل للجين spastin وspastin ^17-7 والذي يحتوي على حذف جزئية من الجين spastin (A) أولا، ويتم تقييم التسلق من خلال وجود الذباب تسلق إلى أعلى قارورة فارغة الغذائية. يتم تسجيل عدد من الذباب في الجزء العلوي بعد 18 ثانية. باستخدام هذا البروتوكول يعتبر عيب كبير في Spast ^5-75 / TM6b بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (N = 10، ع <0.001). (B) المقبل، وتسلق الأداء وتقييمها باستخدام الأسلوب هو موضح هنا. هو D أيضا تسلق efective في في نفس النمط الجيني Spast ^5-75 / TM6b. الفرق في الأداء مهم للغاية (N = 5، ص <0.001)، ولكن الفجوة في الأداء هو أكبر. للطفرات تبين أن لها أقل تأثير الفكر (على سبيل المثال، Spast ^17-7 يحتوي على حذف جزئية من الجينات spastin)، وطريقة اسطوانة المقدمة هنا قد تكون أكثر حساسية. (C) ويلاحظ وجود خلل كبير مع 3 أيام من العمر spast ^17-7 لوحظ / TM3 مع أسلوب قارورة (N = 5). (D) لا عيب كبير مع 3 أيام من العمر spast ^17-7 / TM3 مع أسلوب اسطوانة (N = 5). (E) ويلاحظ وجود اتجاه غير الإحصائي مع 8 أيام من العمر spast ^17-7 / TM3 الذباب (N = 5). (F) ولكن لوحظ أهمية لمدة 8 أيام من العمر spast ^17-7 / TM3 اختبار مع أسلوب اسطوانة قدمت لنفس العدد من مكررات (N = 5، ص <0.001).r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. تمثيل تخطيطي للالتجريبية اقامة. تندس 20 الذباب في اسطوانة زجاجية ثم توج مع فيلم الحاجز الشمع. ثم يتم استغلالها الذباب الى الاسفل، وعدد من الذباب عبور خط الوسط وتسجيلها باستخدام كاميرا لمدة 120 ثانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. ممثل النتائج من تجربة تسلق الجبال. نسبة الذباب بعد أن مرت ويمثل خط عتبة كل 10 ثانية على duratiعلى الفحص. في هذه التجربة، 3 الضوابط المناسبة وراثيا (البرية من نوع والمنتجعات UAS -RNAi / +، Elav-GAL4 / +) وبالمقارنة مع الذباب المعدلة وراثيا تحتوي على كل مكونات GAL4 (المنتجعات Elav-GAL4 / UAS -RNAi) UAS و. وUAS المنتجعات رني هو من VDRC # 108739. هذا التمثيل يسمح لتقييم معدل التسلق لكل الوراثي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. الرسم البياني الممثل الشخصي للشيخوخة. ومنذ العديد من الاضطرابات قاطرة تقدمية، من المهم أن يصور تطور مع مرور الوقت. في هذا الرسم البياني، تتم مقارنة الذباب WT إلى المسوخ متخالف (منتجعات / WT) والمسوخ عبر متخالف (spast5-75 / spast17-7) في 2 أيام (A) و 8 أيام (B)(N = 10، ع <0.001). وصفت النتائج أيضا على مر الزمن ل120 ثانية. نقطة زمنية (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد ثبت بالفعل أن تكون ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا في مرض ¹⁴ والظروف العصبية الأخرى ^1،2 باركنسون. بالإضافة إلى الأدوات الجينية المتاحة في ذبابة الفاكهة، والحفظ جدا الجينوم من أجل الجينات المسؤولة عن الاضطرابات العصبية ^19. ظهور أساليب الفحص الجيني الجينوم (بما في ذلك كله التسلسل exome) من المرجح أن تستمر في تقديم قائمة أكبر من الجينات المرشحة المرتبطة اضطرابات الحركة البشرية. فإن تطوير علاجات لهذه الظروف تتطلب النماذج الحيوانية لزيادة فهمنا لعلم الأمراض تشارك في المراحل المبكرة من التنكس العصبي. استخدام ذبابة الفاكهة وانجذاب بالجاذبية الفحص السلبي يوفر وسيلة غير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لتحديد الجينات المسؤولة عن عيوب قاطرة وبعد فحص المخدرات مرشح لإنقاذ النمط الظاهري. وهذا يضيف إلى الجزيئية، الكهربية، والبراهين التصوير ركما يمكن الحصول على قبعة في نموذج حيواني نفسه. باستخدام الفحص التسلق، والبعض الآخر قد استنسخت بنجاح عيوب السيارات في الذباب متحولة عن الجينات تعطيل الحركة البشري. ومع ذلك، فقد أظهرت الأبحاث السابقة أن التغيرات المرضية يمكن أن تسبق الكشف عن العيوب قاطرة عدة أيام ^(14). ويلاحظ هذه الظاهرة أيضا في ظروف الاعصاب الإنسان حيث نتكلم عن التغييرات تحت الإكلينيكي. ونحن نعتقد أن من خلال فهم ومن ثم معالجة هذه التغييرات تحت الإكلينيكي، سيتحسن تعديل المرض بشكل كبير.

نقدم هنا نموذجا يسمح للكشف عن عيوب الحركة الخفيفة التي قد تساعد في فهم مرور من "سابق للأعراض لأعراض" من أمراض الاعصاب باستخدام نموذج ذبابة الفاكهة. وقد استخدمت العديد من المجموعات مسافة التسلق قصيرة (5-10 سم)، ولكن، قمنا بزيادة المسافة إلى 17.5 سم كما هو الحال في بالادينو وآخرون. ^20. على الرغم من هذا الاختلافبين مرتفعات تسلق قد تبدو بسيطة، كان المقصود من الزيادة في الارتفاع إلى زيادة صعوبة الاختبار، مما يساعد في التعرف على العيوب تسلق طفيفة نسبيا. أيضا، اختارت بعض الطرق لإلقاء الضوء على رأس الاسطوانة مع مصباح الألياف الضوئية، للاستفادة من الاستجابة phototaxic من الكبار ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، يمكن للمصدر الضوء يسبب انعكاس الضوء داخل الاسطوانة. وبالتالي، يتم استخدام النفقات العامة مصدر منتشر ضوء الفلورسنت بدلا من ذلك. بالإضافة إلى ذلك، طفرة في الجينات المسؤولة عن التنكس العصبي قد تؤثر على وظيفة العين وبالتالي انحياز النتائج. الزيادة في حجم العينة 10-20 الذباب يزيد من القدرة الإحصائية من كل محاكمة. في البداية، قمنا بزيادة هذا العدد ليصل الى 30 الذباب، ولكن خفضت في وقت لاحق من أجل تقليل الازدحام والتفاعل بين آثار الذباب. يتم تجاهل العينات بعد استخدام مرة واحدة، بدلا من أن يستمر لمدة أربع تكرار التجارب لكل عينة، للقضاء عossibility التعلم أو التعب. بسبب الذباب مع فقر مدقع أداء التسلق، وكان يأتي بنتائج عكسية لتسجيل الوقت اللازم ل50٪ من الذباب لعبور خط الهدف لأنه يمكن أن يستغرق وقتا طويلا لهذه المعايير التي ينبغي الوفاء بها. بدلا من ذلك، أعطيت الذباب مدة 2 دقيقة لعبور خط المرمى. تم تسجيل عدد من الذباب لعبور الخط واهمال في الزيادات من 10S، وأعربوا عن القيمة الناتجة كنسبة مئوية.

هذه الشروط هي إنشاء تقييم أكثر حساسية من قدرات التسلق ذبابة الكبار. في حين تصاميم أخرى للمقايسة لا تزال مفيدة، ويمكن اعتبار هذا النموذج في الحالات التي يتم التحقيق فيها عيوب مبكرة خفيفة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار قد تساعد في الكشف عن التغيرات الصغيرة في سياق محاكمات المخدرات.

قضية مهمة هي أن السلوك انجذاب بالجاذبية سلبي يقوم على الذباب يجري استغلالها في الجزء السفلي من الاسطوانة. فمن therefخام هامة لتقييم أشكال أخرى من الحركة، مثل على سطح مستو أو رحلة. جوانب أخرى مثل التحفيز والتفاعل الاجتماعي لا بد من اعتبار نخلط المحتملين. التحذير الآخر هو أن الفحص قدم يسمح واحد فقط لتقييم الحركة في الذباب الكبار. وهذا يحد من القدرة على الحصول على إرتباطات عصبية مرضية للسلوك لاحظ وهو أمر مهم جدا في فهم الآلية المرضية للمرض. في الواقع، وقد تم ذلك معظم أعمال التصوير العصبي في يرقة الوصل العصبي العضلي حتى الآن في ذبابة الفاكهة. الحصول على سلوك الحركة في يرقة قد تكون خطوة هامة من أجل رسم علاقة مباشرة بين السلوك والتغيرات المرضية.

من المهم جدا للسيطرة على درجة الحرارة والرطوبة التي تربى الذباب واختبارها. بالإضافة إلى التأثير على تطور ذبابة، كان لهذه العوامل أثر هام على قدرة التسلق من الذباب المطروحة وتخزينها في ظروف غير مثالية. في صresence من زيادة الكهرباء الساكنة أو الرطوبة، لم الذباب لا تؤدي على النحو الأمثل. وكان هذا التأثير لا يساوي لجميع المورثات، متحولة الذباب عادة يجري أكثر تأثرا بهذه العوامل من الضوابط. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج اسطوانات لغسلها وتجفيفها بشكل صحيح بين كل تجربة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila stocks			The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.
Video camera			Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.
Graduated cylinder	Kimble	20028W	Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.
Computer			Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.