Abstract
Beteende styrs av nervsystemet. Kalcium avbildning är en enkel metod i det transparenta nematoden Caenorhabditis elegans för att mäta aktiviteten av neuroner under olika beteenden. Att korrelera neural aktivitet med beteendet, bör djuret inte immobiliseras men bör kunna röra sig. Många beteendeförändringar inträffar under långa tidsskalor och kräver inspelning under många timmar av beteenden. Detta gör också att det är nödvändigt att odla maskar i närvaro av livsmedel. Hur kan maskar odlas och deras neural aktivitet avbildas över långa tidsskalor? Agarose mikrokammare Imaging (AMI) har tidigare utvecklats till kultur och observera små larver och har nu anpassats för att studera alla livsstadier från tidig L1 till vuxen skede av C. elegans. AMI kan utföras på olika livsstadier C. elegans. Långsiktig kalcium avbildning uppnås utan att immobilisera djuren genom att använda kort externt utlöses exponeringar comkombination med en elektron multiplicera laddningskopplad anordning (EMCCD) kamerainspelning. Zooma ut eller scanning kan skala upp denna metod för att bilden upp till 40 maskar parallellt. Således beskrivs en metod för att avbilda beteende och neural aktivitet över långa tidsskalor i alla livsstadier C. elegans.
Protocol
1. Instrument, Kultur Media och Rätter
- Använd ett mikroskop som är kapabel att hålla provet i fokus och som är utrustad med en automatisk stadium. Bygg en skräddarsydd lock värmare eller köpa en kommersiell lösning. Inrätta en LED-EMCCD kamerasystem där exponeringen av kamerans utlösare LED-belysning genom en TTL-signal med användning av tillverkarens instruktioner.
Obs: Se diskussion för mer information. - Polydimetylsiloxan (PDMS) stämplar:
- Tillverka PDMS frimärken i en mikrofluidik anläggning eller har PDMS frimärken produceras av en kommersiell gjuteri. Om du vill använda en kommersiell gjuteri, skicka en AutoCAD-fil till bolaget och ange djupet (15 um, till exempel) av anordningen. Efter leverans från gjuteriet, skär PDMS chip i sina 16 frimärken med en skalpell.
- Bond varje enskild stämpel på en glasskiva med hjälp av luftplasma. För limning, exponera både PDMS stämpeln och glasskiva till luft plasma för enskjutningen 1 min (med hjälp av de högsta inställningarna plasma på 0,5 mbar). Se till att ytorna för limning peka uppåt under plasmabehandlingen. Sedan placera PDMS stämpeln på glasskiva.
- Ta en 3,5 cm nedre skålen och skära ut en kvadratisk yta av 18 x 18 mm från mitten av botten av skålen med hjälp av en vertikal fräsmaskin och vassa roterande knivar. Använd låg rotationshastighet av kaporganet och långsam matning för att hindra plasten från att smälta på grund av värme som produceras av friktion. Förbered flera rätter på en gång.
Obs: Botten skålen kan återanvändas många gånger efter försöket om det är rengöras efter blötläggning i ren etanol O / N. - Agaros:
- Lös 3 g hög smältpunkt agaros i 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml kolesterol (5 mg / ml i etanol), H2O till 1 L, sterilisera i autoklav) genom kokning. Gör alikvoter av den lösta agaros i 2 ml Eppendorf-rör och Störe. Också förbereda en sats av låg smältpunkt agaros exakt samma sätt som den hög smältpunkt agaros.
- Före användning, placera tre alikvoter av hög smältpunkt agaros på ett värmeblock vid 95 till 98 ° C. Före användning, placera en alikvot av låg smältpunkt agaros på ett värmeblock vid 95 till 98 ° C tills det har smält och sedan till ett värmeblock vid 30 till 35 ° C.
2. Val av djur
- Odla maskar på en låg densitet på ympade NGM plattor för att få rena djur. Se till att det finns gott om mat och bara några djur på tallriken.
- För avbildning L1 larver, överföra cirka 30 ägg som innehåller embryon vid kringla stadiet på en ny seedade NGM platta. För överföring senare larvstadier eller vuxna C. elegans, överföra cirka 30 maskar på en ny seedade NGM platta.
3. Framställning av agaros Microchambers
- Framställning av skålen:
- Ta en plastskål med en fyrkantig öppning 18 x 18 mm vid botten och placera den upp och ned med öppningen uppåt. Stänga öppningen genom att placera en bit dubbelsidig tejp av 20 x 20 mm på öppningen. Vänd skålen runt så att den klibbiga tejpen är på botten och placera skålen på en hård yta. Skär öppningen gratis med en skalpell.
- Med hjälp av en P1000 pipett fyller 2 ml 3% hög smältpunkt agaros i S-Basal i skålen. Placera agarosen på det område som omger öppningen och låt stelna. Vänta tills agarosen är solid.
- Vänd runt skålen och dra bort skyddsfilmen som täcker dubbelsidiga tejp så att den klibbiga sidan kommer att finnas kvar på skålen och kommer att exponeras.
Anmärkning: Som ett resultat kommer en fin ring med tejp omger utsidan av öppningen. Agarosen fungerar som en fuktreservoar, som senare kommer att omge provet.
- Gjutning av microchambers:
- Exponera the PDMS yta för gjutning med luftplasma för 20-60 sekunder.
Obs! Den här plasmabehandling gör PDMS ythydrofil, som hindrar fångst av luftbubblor och ger skarpare utskrifter. - Konstruera två distanser av samma höjd genom att stapla 5-9 objektglas. Place, parallellt med sina långsidor, den första distans stacken, då en enda glasskiva, sedan återigen ett distans stack. Placera glasskiva som innehåller PDMS stämpeln ortogonalt över distanser. Justera höjden på distansorganen, så att det finns ett utrymme på cirka 1,5 mm mellan formningsytan av PDMS stämpeln och den enda glasskiva.
- Placera en droppe het vätska med hög smältpunkt agaros på den enda glasskiva nära PDMS stämpel och snabbt skjut PDMS stämpel vertikalt i vätske agaros. Låt agarosen stelna. Kontrollera att det blir ett opakt utseende, vilket vanligtvis tar ca 2 minuter. Dra av stämpeln vertikalt med ett drag.
Obs: Det är praktiskt att glue distans glider tillsammans med dubbelsidig tejp. Den vertikala rörelsen av stämpeln förhindrar luftbubblor från att fastna i agarosen.
- Exponera the PDMS yta för gjutning med luftplasma för 20-60 sekunder.
- Överför äggen eller maskar tillsammans med OP50 bakterierna på agarosen med hjälp av en fin platinatråd plockning. Fördela ett ägg eller en mask per kammare tillsammans med mat med hjälp av en ögonfrans. Fyll cirka 30 ägg på en agaros pad.
- Skär agarosen plattan innehåller de fyllda microchambers i en kvadrat med ca 15 x 15 mm, så att den passar fint in i öppningen av skålen. Plocka upp torget agaros platta med pincett och placera den upp och ned på ett täckglas på 20 x 20 mm. När sjunkit, inte lyfter inte upp det igen eller skjut den runt eftersom detta kan leda till att bakterier och maskar att skjutas ut ur sina kammare.
- Montering av skålen:
- Placera glastäckglas på öppnandet av plastskål. Tryck försiktigt ner glaset täck på ring av dubbelsidig tejp.Var noga med att inte bryta glaset.
- Vänd skålen upp och ned och använda en P1000 pipett för att fylla gapet mellan agar plattan innehållande microchambers och agarosen behållaren med vätska med låg smältpunkt agaros kyldes till ca 30 ° C. Vänta tills agarosen stelnat.
- Täta skålen med ett lock. För inverterade mikroskop använder en uppvärmd lock. För upprätt mikroskop använda en vanlig lock och försegla skålen med Parafilm.
- Efter avslutad framställning av microchambers, kontrollera dem under ett stereomikroskop. Den korrekta fyllningen är avgörande. Se diskussionen för mer information.
4. Kalcium Imaging
- Använd transgena stammar som uttrycker genetiskt kodade kalcium sensorer såsom HBR16 (goeIs5 [pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: UNC-54-3'UTR, UNC-119 (+)]) 27.
- Använd en förening mikroskop utrustat för brett fält epifluorescence. Anslut TTL-utgången på EMCCD kameran tillTTL-ingång av LED, så att varje gång kameran registrerar en ram provet kommer att lysa. Använd en exponeringstid av ca 5 ms. Använd EM vinst i intervallet 50-300.
- Ange en skur film körs under 24 timmar med varje mask som avbildas varje 15-30 min första för 20 sekunder med DIC, då för 20 sekunder med en GFP fluorescens att spela GCaMP, och sedan fatta ett slutgiltigt bild av mKate2 signalen tas till kontroll för uttrycksnivåer. Använd en bildhastighet på 2 / sek under varje skur.
- För visuell uppgifter inspektion, använda en falsk-färgkarta för att öka synligheten av små förändringar i fluorescensintensitet. Handling fluorescerande data som AF / F, med F är den genomsnittliga utgångsvärdet av fluorescens. En detaljerad beskrivning av kalciumdataanalys kan hittas i litteraturen 20.
5. Parallell AMI av flera Worms
- Ställ skålen innehåller microchambers på mikroskopet, fokusera på provet och engagera autofocus. Inrätta en programvara protokoll så att kameran får en skur av 40 bildrutor i 20 sekunder varje halvtimme under 24 timmar, vilket resulterar i 1920 bildrutor per mask, en rimlig mängd data. Ställ in skanningen så att det besöker varje mask med hjälp av scenen. Sikta på att filma omkring 30 maskar i en körning.
- Image flera maskar genom att zooma ut, det vill säga med hjälp av en lägre förstoring. Använd en lägre förstoring för att täcka flera microchambers med kamerachip och filma flera intilliggande microchambers samtidigt. Efter utgången av bilden förvärvet, separera data för varje enskild kammare genom att beskära ett område av intresse täcker ett djur.
- För att snabbt utvärdera data rörlighet, använd ram subtraktion 28-32.
6. Imaging olika stadier av livscykeln av C. elegans
- Använd agaros microchambers för alla livsstadier C. elegans från L1 till vuxna och inklusive dauers. Använd lämpliga kammar dimensioner för DIFka levnadsstadier som visas i tabell 1.
| Utvecklingsstadium | Kammarstorlek | Kammardjup | Typisk inspelningstid | Förstoring |
| L1 | 190 x 190 | im | 10-15 ^ m | ägg - mitten av L2 | 400X |
| L2 | 370 x 370 pm | 15 | im | ägg - L3 | 200X |
| Dauer larv | 370 x 370 pm | 25 | im | 4 dagar | 200X |
| L3 | 700 x 700 | im | 45 | im | L2 - L4 | 200X |
| L4 | 700 x 700 | im | 45 | im | ung L4 - unga vuxna | 100X |
| Unga vuxna | 700 x 700 | im | 45 | im 12-24 h | 100X |
Tabell 1. Kammar storlekar för olika livsstadier. Visade är Kammarens dimensioner och förstoringar som är användbara för olika steg som är optimerade för en 8 x 8 mm kamerachip.
Representative Results
Agarose microchambers kan tillämpas på alla livsstadium C. elegans. Som kan ses i Figur 1A, kan observeras larvutveckling och sömnbeteende under L1 lethargus. Man visar kammarstorlekar som är 190 x 190 ^ m, 10 ^ m djup. Om längre tidsskalor krävs, kan större kamrar användas. Såsom kan ses i figur 1B, med användning av en kammare med större dimensioner (370 x 370 | im, 25 ^ m djup) tillåter utveckling av C. elegans från ägg tills vuxen. Figur 1C visar en analys av långsiktiga förändringar i beteende med hjälp av ram subtraktion av en mask som odlas i en kammare från ägg tills vuxen. Här visas medelvärden intensiteter efter ram subtraktion för utvalda skurar under vakna och lethargus. Ju lägre den genomsnittliga intensitet efter ram subtraktion värdena är, desto lägre rörlighet av masken. Visas väljs skur spår från en vakna tillstånd och en lethargus skick per larvstadiet. Denobserverade ökningen av medelintensiteten under utvecklingen beror främst på ökad kontrast och storleken på djuret. Figur 1D visar en Dauer larv, en alternativ livsfas som är engagerad under ogynnsamma miljöförhållanden 33. Kammarstorlek är 370 x 370 ^ m, 15 ^ m djup. Notera att Dauer larv placerades in i kammaren utan bakteriell mat, vilket skulle orsaka utförsel från Dauer larvstadium. Figur 1E visar en vuxen mask som redan har lagt många ägg in i kammaren. Kammar dimensioner som används för vuxna var 700 x 700 pm, 45 pm djup. Slutligen visar figur 1F en vuxen hermafrodit och en manlig parning inuti en vuxen kammaren.
Kalcium Imaging i rörliga maskar är möjligt med GCaMP kalcium sensorer. Figurerna 2A, B visar kalcium avbildning av kommandot interneuronen AVA för en L1 larv 27. Figurerna 2C, D visar kalcium aktivitet för samig typ av neuron i ett vuxet djur.
Ökning långsiktig avbildning är möjlig genom att skanna och genom att zooma ut. Figur 3A visar bildkvaliteten hos samtidig avbildning av 30 maskar på en kamerachip med en 5 megapixel kamera. Figur 3B visar bildkvaliteten 4 maskar kalcium avbildas samtidigt.
Figur 1. Anpassning av AMI till alla livsstadier C. elegans. (A) Larva avbildas från tidig L1 fram till början av L2 skede i 190 x 190 pm kammare. (B) Utveckling från ägg tills vuxen i en 370 x 370 pm kammaren. (C) Rörlighet för en mask bedömas med hjälp av ram subtraktion. Visas är den genomsnittliga intensiteten hos alla bilder i bilden efter ram subtraktion för en vald skur film för varje larver staGE för wake och lethargus beteende. (D) en Dauer larv i frånvaro av mat i en 370 x 370 | im kammaren. (E) Vuxen hermafrodit med många ägg som in i en 700 x 700 | im kammare. (F) Parning av en hane och en hermafrodit inuti en 700 x 700 | im kammaren. YA betyder unga vuxna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kalcium avbildning med AMI. (A) Kalcium avbildning med GCaMP3 i kommando interneuronen AVA L1 larver med hjälp av NMR-1-promotorn. Här visas två falskt färgbilder. I den vänstra bilden, är aktiviteten hos AVA låg och masken inte gör en bakåtrörelse. I den högra bilden aktiviteten hos AVA är hög, och masken rör sig bakåt. (B) Kalcium transienter över tiden för en L1 mask. (C, D) Kalcium transienter i ett vuxet djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Imaging flera maskar parallellt genom att zooma ut. (A) Samtidig avbildning av 30 L1 maskar per ram med hjälp av 190 x 190 pm kammare och ett 100 gångers förstoring (med hjälp av en 10X mål) och en 16,6 x 14 mm kamera chip. (B) Samtidig avbildning av fyra L3 maskar per ram med hjälp av 370 x 370 pm kammare och 100 gångers förstoring och ett område av intresse för en 16,6 x 14 mm kamera chip.et = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Hårdvara
Fokus för ett mikroskop typiskt glida vid långtidsbildtagning. För sammansatta mikroskop, fokusera bevarande system kan köpas från de stora tillverkarna mikroskop. Om en förening mikroskop med fokusstyrning är för dyrt, skulle ett enkelt alternativ vara att använda en stereomikroskop. Sammansatta mikroskop tillåta användning av målen med hög numerisk apertur (NA) och kan lätt automatiseras. 40X olje mål är väl lämpade. Nedsänkning i vatten linser är inte perfekt på grund av avdunstning under långvarig avbildning. Differentiell interferenskontrast (DIC) genererar en fin kontrast som hjälper till att följa morfologiska och beteendemässiga förändringar, men enkel ljusa fält avbildning kan också användas. För DIC eller ljusa fält avbildning, använder rött ljus genom att placera en röd ljusfilter i dia-belysning väg mikroskop. För scanning av flera microchambers är en automatiserad skede behövs. Bästa prestanda är achieved när en etapp används som har icke-linjär acceleration och retardation och kan ställas in på låg skanningshastighet för att förhindra att störa djuren under skanning. Vi har inte observerat beteende svar eller kalcium ökning mechanosensitive neuroner (ALM och PLM) under skanning, vilket tyder på att långsamma skanning faktiskt inte aktiverar mechanosensitive systemet av masken (data visas ej). Kommersiella LED-system kan användas. Flera företag erbjuder färdiga att använda lösningar som inkluderar lysdioderna på olika våglängder. Lysdioden bör ha möjlighet att externt trigga LED med en TTL-signal. Det behövs en mycket känslig kamera för kalcium avbildning av rörliga djur. EMCCD kameror är de mest känsliga kameror på marknaden. Kameran måste ha en TTL-utgång under exponering (även kallad "brand" output). Ett lock värmare krävs för att förhindra kondensation på locket, om användning av ett inverterat mikroskop. På en upprätt mikroskop, kommer skålen placeras så att locket will vara i botten och sålunda kondensation förhindras och inget lock uppvärmning krävs. Locket bör tätt stänga skålen för att förhindra avdunstning av vatten under långvarig avbildning.
PDMS frimärken
Ytan av PDMS stämpel som innehåller strukturen för formning agarosen är vänd bort från den glasskiva, som uppbär PDMS stämpeln. En lista med företag som erbjuder anpassade mikroflödes chips kan hittas på Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Fylla nematoderna i sina kamrar
Detta är det mest kritiska steget i protokollet och följande punkter bör beaktas: A) fuktighet av agarosen är avgörande för att överföra maskar och för avbildning. Om agarosen är för fuktigt, det vill säga, det finns en likvid covering ett område på flera microchambers, kommer det inte vara möjligt att fördela bakteriell mat och maskar på ett kontrollerat sätt på grund av att vätska kommer att göra bakterierna strömma bort. Om agarosen är för torr sedan bakterier och maskar kan inte gå av pick lätt vilket innebär att ökad kraft måste användas för att släppa maskar och bakterier som lätt orsakar skador på agarosen. När du fyller i en massa maskar agarosen kan torka upp. I värsta fall agarosen kommer att vara så torrt i slutändan att kamrarna kommer att kollapsa. Om agarosen är för torr kan den rehydreras genom att placera en liten droppe (omkring 2 | j, l) av S-Basal på sidan av chipet där inga maskar. Sedan doppa den platinatråd plocka in i vätskan och även dra en del av vätskan in i det område där kamrarna är fyllda med maskar. B) Mängden mat är avgörande för framgångsrik långsiktig avbildning. Om det inte finns tillräckligt med mat, kan maskar slut på det. Om det finns alltför mat kaviteten av kammarenkommer inte att bete sig som en vätska, utan snarare som en fast substans och kommer att tillåta maskar för att undkomma från kammaren genom att skjuta bort bakterierna. Sikta på att få en bakteriesuspensionen som fyller hela kammaren. Masken är i ständig fysisk kontakt med agar och glasytan längs större delen av sin längd under experimentet och krypa beteende tycks likna rörelse på en tallrik och olik stryk i vätska. C) Mekanisk skada av agarosen kan förstöra experimentet. En fin plockning är viktigt. Det borde inte ha vassa hörn. En mjuk ögonhår fäst vid en pipettspetsen kan användas för att flytta bakterier eller maskar i kamrarna istället för att använda en platina plockning. I de flesta fall är dock torkad agaros orsaken till skadan. Pick eller ögonfrans bör helst bara knappt röra agarosen själv, och vattenfilmen på agarosen ytan bör dra av maskar och bakterier. Vid tätning kamrarna, återigen, är väsentligt fukten av agarosen. Det bör intevara någon fri vätska på agaros ytan eftersom detta kan tvätta bort bakterier och maskar under försegling. Stora bubblor kan avlägsnas genom att försiktigt lyfta ett hörn av agar plattan. Små bubblor som är mindre än kammaren ofta fastnar inuti kamrarna. Dessa bubblor är inte ett problem och kommer att försvinna genom absorption. Efter montering skålen, kontrollera igen att agarosen inte är för torrt eller för blött. Kamrarna skall vara snyggt förseglas och det ska inte finnas någon vätskeflöde mellan kamrarna. Om agarosen är för blöt, kommer kamrarna inte täta ordentligt. Maskar kan fly eller deras mat kommer att tvättas bort. Om provet är för fuktigt, enkelt öppna locket och låt agarosen torka i en minut eller två. Om agarosen är alltför torr, kan kamrarna kollapsa och maskar kommer undan.
Ökning genom att zooma ut
För fluorescens avbildning, är zooma ut begränsas av den låga mängden ljus uppnås vid lägre förstoringsgrader. Dessutom, EMCCD kameror är optimerade för känslighet och har ofta en relativt låg upplösning. Men skala upp avbildning fyrfaldig är väl möjligt. Till exempel kan fyra kamrar 190 pm x 190 pm plats på en ram när du använder 140X förstoring (uppnås genom att använda en 20X mål och en 0,7X kamerafäste) och en 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm kamera. En kamera med hög upplösning med en stor chip (t.ex. sCMOS kameror, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 pixlar = 5,5 megapixel) optimerar uppskalning av DIC och ljusa fält avbildning. Till exempel, upp till 30 L1 maskar i 190 pm x 190 pm kammare kan passa på varje ram av den här kameran när du använder en 100x förstoring (se figur 3). I princip, zooma ut och skanning kan också kombineras för att erhålla ännu större antal djur. De flesta neuroner bo ganska bra i fokus, så att endast ett fokalplan behöver avbildas. Om nervceller finns att flytta ut ur fokus, az skanning med en piezo-enhet kan tas vid varje tidpunkt point.
Anpassning till olika beteenden
Detta protokoll ger en god uppfattning om beteendet över långa tidsskalor. Självklart måste tidpunkten för skurarna anpassas till olika beteenden och livsstadier.
Begränsningar av tekniken
Flera faktorer begränsa giltighetstiden för avbildning. Det viktigaste är mängden mat. När maten konsumeras, larver sluta utveckla. Således, i små kammare (190 x 190 pm) maskar utvecklas tills L3 scenen och sedan arrestera. Om det krävs längre imaging tid, större kamrarna måste användas. Den högst långsiktig avbildning ligger i intervallet 2,5 - 3 dygn. Om längre avbildning krävs, maskar måste återvinnas och placeras i nya kammare. När avbildning vuxna maskar, är en annan begränsning som orsakas av avkomman av dessa maskar. Vuxna maskar lägger ägg från vilken larverna kläcks. Dessa larver kommer också stanna inne i kammaren, Konsumerar mat, och kan störa bildanalysen. Om avkomman är ett problem, är en lösning att antingen använda sterila vuxna eller upprepade gånger placera maskar i nya kammare. För att återhämta sig maskar, är agarosen plattan innehåller kammaren skärs fri med en skalpell, dras bort täck, och placeras på ett NGM platta som maskar kan återvinnas. En annan begränsning är att begränsa maskar till relativt små områden. Detta kan vara ett problem om långväga rörelse måste analyseras. Medan djur i kamrarna kan stimuleras mekaniskt och optogenetically 21,27,34,35, kommer den förseglade typen av kammaren gör det svårt att tillämpa lösliga eller flyktiga stimulantia. Biologiskt viktiga gaser, såsom syre eller koldioxid kan diffundera fritt i ägarn. Den stora luftbehållare i skålen bör hålla gaskoncentrationerna i kamrarna konstant över den tid som behövs för experiment. Det bör dock hållas i minnet att den lokala syre concentration i kammaren kan likna mer de förhållanden som råder i vätskekultur än kulturen på plattan.
Betydelse med hänsyn till befintliga metoder
Mikrofluidikanordningar har kraftigt avancerade beteende och utvecklings studeras i C. elegans. Ofta är mikroflödes strukturer gjorda av PDMS 12. Här beskriver vi ett protokoll för att generera mikroflödesodlingskammare gjorda av agaros. Styrkan i denna teknik är kombinationen av hög bildkvalitet, sambandet mellan beteende med fysiologiska mätningar, långsiktig imaging och en rimligt hög genomströmning. Hög bildkvalitet uppnås genom avbildning genom glastäck använder höga NA mål. Som ett resultat, kan utföras fluorescens avbildning såsom kalcium avbildning och konfokal avbildning av subcellulära strukturer. Eftersom djuren inte är immobiliserade som i andra system, gör det en korrelation av beteende med fysiologiska mätningar. Because djuren har gott om mat, fortsätter de att utveckla möjliggör långsiktig avbildning. Detta system kan bild många maskar i en körning, eftersom djuren är begränsade till sina definierade kamrarna. Sålunda kan denna metod lätt skalas upp 9,27,34-36.
Framtida tillämpningar
Hittills har detta system använts främst för att studera sömn beteende i C. elegans L1 larver. Emellertid kommer en anpassning till alla stadier gör det möjligt att studera en mängd olika beteenden också i dauers och vuxna. Ett brett utbud av beteenden kan studeras med denna teknik som sträcker sig från parning till äggläggning.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Max Planck-sällskapet och Göttingen Graduate School Junior Group stipendium HB finansierat detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
| Top Vision low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| Stereomicroscope | Leica | M5 | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
| Lid heater | MPI workshop | custom made | |
| Plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
| Double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 25 mm x 33 m | alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |
References
- Brenner, S.
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
- Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).
- Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A.
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208 (2008).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
- Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
- Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
- Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
- Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198 (2008).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
- Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
- Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
- Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
- Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782 (2013).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
- Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
- Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853 (2013).
