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方法文章

测量慢性处理后小鼠脾细胞中的DNA损伤与修复 体内 暴露于极低剂量的β射线和γ射线

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DOI：

10.3791/52912

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2015年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

本文内容

摘要

一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。

摘要

低剂量辐射暴露可能产生多种生物学效应，其效应在数量和质量上均不同于高剂量辐射所引起的效应。以恰当且科学合理的方式回答与环境、职业和公共健康安全相关的问题，在很大程度上依赖于准确测量低剂量污染物（如电离辐射和化学物质）生物学效应的能力。DNA损伤与修复是评估健康风险最重要的早期指标，因其具有潜在的长期后果，例如癌症。本文描述了一种研究慢性 体内 低剂量γ射线和β射线照射对小鼠脾细胞DNA损伤与修复的影响。利用一种广泛认可的DNA双链断裂标志物——磷酸化组蛋白H2AX（称为γH2AX），我们展示了该标志物不仅可用于评估DNA损伤水平，还可用于检测低剂量辐射可能引起的DNA修复能力的变化 体内 曝光。流式细胞术可对大量样本中免疫荧光标记的γH2AX进行快速、准确且可靠的检测。通过将分离的脾细胞暴露于2 Gy的挑战性辐射剂量，可诱导足够数量的DNA双链断裂以启动修复过程，并通过检测辐射后1小时的诱导性DNA损伤和辐射后24小时的残留DNA损伤来评估DNA双链断裂修复能力。残留DNA损伤提示修复不完全，可能带来长期基因组不稳定性和癌症风险。结合其他可在此类样本中轻松测量的检测方法和终点指标 体内 研究（例如染色体畸变、骨髓网织红细胞微核率、基因表达等），该方法能够对低水平应激源的生物学效应进行准确且具有生物学背景的评估。

引言

关于低剂量或极低剂量电离辐射可能产生的有害效应，一直存在重大争议。公众对辐射的恐惧主要源于广岛和长崎原子弹爆炸的画面以及罕见的核电站事故（媒体的大肆报道加剧了这种恐惧），这导致了极为严格的辐射防护法规和标准，而这些标准可能缺乏充分的科学依据。在过去三十年中，大量研究报告指出，低剂量辐射不仅未表现出有害效应，反而可能诱导出潜在的有益生物学效应1-4。辐射对健康的主要风险因素是致癌概率，该概率是基于接受高剂量或中等剂量辐射的原子弹幸存者的流行病学研究估算得出的。目前采用将这些数据线性外推的方法（即所谓的“线性无阈”模型，LNT模型）来估计低剂量辐射下的癌症风险。然而，这种方法并未获得全球科学界的普遍认可，且仍存在激烈争论5。

显然，需要开展更多研究来阐明这一问题，并可能改进辐射防护标准。此类研究应包括慢性处理（对环境和职业暴露的最佳模拟）、体内动物模型（最适用于将效应外推至人类）以及DNA损伤率、DNA修复和诱变等终点指标。已知DNA是辐射损伤效应的主要靶点，修复不完全或错误修复可能导致诱变和癌症的发生6。

DNA 双链断裂（DSB）是最具危害性的 DNA 损伤类型之一，可能导致细胞死亡和肿瘤发生7。因此，能够可靠且准确地测量低剂量辐射和/或化学污染物等其他应激因素暴露后 DSB 的水平显得尤为重要。目前最敏感且特异的 DNA DSB 标记物之一是磷酸化的组蛋白 H2AX，称为 γH2AX8，尽管也有其他标记物和方法被提出9,10。据估计，在诱导的 DSB 附近，有数千个 H2AX 分子参与形成 γH2AX，从而可通过抗-γH2AX 抗体进行免疫荧光标记并结合荧光显微镜检测单个 DSB11。该反应非常迅速，通常在 30 至 60 分钟内达到峰值。已有证据表明，γH2AX 可通过招募其他修复因子至断裂位点，并通过修饰染色质结构以锚定断裂的 DNA 末端并为其他修复蛋白提供可及性，从而促进 DNA DSB 的修复（综述见12）。在 DNA DSB 修复完成后，γH2AX 会被去磷酸化和/或降解，新合成的 H2AX 分子将取代染色质受损区域中的 γH2AX10。因此，监测 γH2AX 的形成与消失可准确评估 DNA DSB 修复的动力学过程。该方法已被用于研究接受高剂量辐射的各种人类肿瘤细胞系中 DSB 的修复情况，其修复速率及残留 DSB 水平已被证明与放射敏感性相关13-15。

我们改进了这一实验方法，并将其应用于 在体 小鼠研究以考察长期低剂量暴露的影响 γ- 和 β-辐射对DNA双链断裂水平及修复的影响 （图1）首先，我们展示了一种对小鼠进行长期慢性暴露的方法 β-辐射，其来源为氚（氢-3）以氚化水（HTO）形式或以有机结合氚（OBT）形式溶解于饮用水中。这两种形态在体内的蓄积和（或）分布方式预期存在差异，因而可能产生不同的生物学效应。两种形态均对核工业构成潜在危害。该暴露情况与长期慢性暴露相似。 γ-辐射在等效剂量率下进行，以实现两种辐射类型之间的正确比较，这对于评估它们的相对生物学效应至关重要。β-辐射由电子组成，因此在性质上与 γ-辐射，高能光子。由于这一差异， Β-辐射主要代表内部健康危害，可能产生与之不同的生物学效应 γ辐射。这一并发症引发了关于辐射暴露监管的重大争议 β-由HTO释放的辐射。因此，各国对公共饮用水中HTO的监管限值各不相同，欧洲为100 Bq/L，而澳大利亚则高达75,000 Bq/L。因此，将HTO的生物学效应与等效剂量的 γ-辐射。其次，使用免疫荧光标记法，在慢性暴露结束后测量分离的脾细胞中DNA双链断裂的发生率 γ通过流式细胞术检测H2AX。这可以评估DNA损伤的程度 体内 暴露。然而，合理推测此类低水平暴露可能不会产生可检测到的DNA双链断裂（DSB）频率；相反，可能会引发一些隐匿性的变化或应答，从而影响细胞修复DNA损伤的能力。如果发现这些变化，其效应可能是刺激性的（产生有益作用）或抑制性的（产生有害作用）。本方案通过使用高剂量辐射对分离所得的脾细胞进行挑战，诱导大量DNA损伤，从而揭示此类潜在变化。例如，2 Gy 可产生约每细胞 50 个 DNA 双链断裂，或总数量增加 3 - 5 倍 γH2AX 水平）。随后，形成与消失的 γ通过流式细胞术监测H2AX，以反映DNA双链断裂（DSB）修复的启动与完成。通过该方法，不仅可检测基础状态及处理诱导下的DNA双链断裂水平，还可评估其对细胞响应并修复由更高强度应激因素所引发DNA损伤能力的潜在影响。

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方案

所有小鼠的操作和处理程序均应遵守立法机构和/或动物护理项目制定的规定，并经当地动物护理委员会批准。本方案中描述的所有方法均按照加拿大动物护理委员会的指南进行，并获得当地动物护理委员会的批准。

警告：所有涉及放射性物质的工作（包括但不限于氚的处理、外部γ射线照射、放射性动物组织的处理、垫料废弃物的处理）均应遵守立法机构和/或辐射防护主管部门制定的规定，并由经授权的人员在经过认证的实验室和/或设施中进行。

1. 动物实验

  1. 动物分组
    1. 若小鼠来自外部机构，需在动物设施中至少适应环境10天。如果研究包含多个处理组，应确保动物供应商能够将所有动物作为同一批次送达。
    2. 将小鼠随机分配至处理组，每组10只。若使用C57BL/6品系的雄性小鼠，建议由动物供应商在其设施内预先对年轻的C57BL/6雄性小鼠进行随机分组，以减轻攻击性问题。
  2. 小鼠长期暴露于内源性β射线辐射
    1. 通过稀释原始HTO和OBT（氚标记的脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸氨基酸混合物）溶液，配制小鼠饮水中氚的工作浓度（10 kBq/L 和 1 MBq/L）。
    2. 使用液体闪烁计数器测量放射活性，验证饮水中氚的最终浓度；必要时调整浓度。
    3. 通过自由饮水方式对动物进行为期一个月的处理。若在两周内处理用水量减少，需补充更多水；否则每两周更换一次水瓶。
    4. 对照组小鼠同样进行相同操作，但不接受辐射处理。将其饲养于独立的“洁净”房间或正压环境下的独立“洁净”鼠架上，以避免空气中氚的交叉污染。
  3. 小鼠长期暴露于外源性γ射线辐射
    注意：γ射线辐照设施/设备因地点不同而异。
  4. 利用现有的剂量测定方法，确定γ射线源周围产生目标剂量率的辐射场对应距离，并确保覆盖动物笼位区域内的辐射场均匀性。
    注意：1.7 μGy/h 相当于体内1 MBq/L 氚所产生的剂量率。
  5. 将小鼠笼置于步骤1.3.1确定的距离处，持续暴露一个月。每日γ辐照中断时间应控制在30分钟以内。使用热释光剂量计测量总吸收剂量。

2. 处死与取样

  1. 准备无菌手术器械、插入70微米细胞筛网的60 mm培养皿、15 ml和1.5 ml离心管，以及添加5%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基，并将所有物品置于生物安全柜内。确保操作过程的无菌性至关重要。
  2. 向每个60 mm培养皿中加入5 ml RPMI培养基。
  3. 采用当地动物护理委员会批准的方法处死小鼠。对于本方案中所述的脾细胞实验，颈椎脱臼是一种合适的选择。然而，如果需要采集血液样本用于其他检测（例如，mFISH、细胞松弛素阻断微核试验或其他常见的遗传毒性检测），则应在异氟烷麻醉后进行心脏穿刺取血。
  4. 将动物仰卧放置，头部朝向远离操作者的方向。用70%乙醇喷洒小鼠体表。使用镊子夹住尿道口前方的皮肤，并用剪刀在会阴区域做一个小切口。
    1. 从此切口开始，沿腹侧中线剪开至胸腔，注意仅剪开皮肤，避免损伤下方的肌层。将皮肤从中线分离。
    2. 用镊子夹住腹壁，沿肌层中轴剪开，以暴露腹腔。
  5. 用无菌镊子轻轻夹住脾脏，同时用剪刀剪断周围结缔组织，轻柔牵拉，完整取出脾脏。
  6. 切取一小块脾组织（约脾脏的1/10），放入1.5 ml离心管中。在液氮中速冻，随后于-80 °C保存，用于后续补充实验。
  7. 将剩余的脾组织放入含有5 ml预加RPMI培养基的60 mm培养皿中的细胞筛网上。
  8. 继续处理下一只小鼠。
    注意：在处死其余小鼠期间，已取出的脾脏可保存在含培养基的60 mm培养皿中（最多2小时）。根据参与人员数量，每天可处理5至15只小鼠。

3. 脾细胞培养物的制备

  1. 使用带有弯曲末端的无菌镊子在细胞筛中剪切脾脏，进行匀浆处理。
  2. 移除细胞筛，并将60 mm培养皿中滤过的细胞悬液收集至15 ml离心管中。
  3. 用5 ml培养基冲洗细胞筛，以收集残留的细胞。
  4. 在室温下以300 × g离心5分钟。
  5. 倒去上清液，并将沉淀重悬于10 ml RPMI培养基中。
  6. 在室温下以300 × g离心5分钟。
  7. 倒去上清液，并将沉淀重悬于5 ml RPMI培养基中。
  8. 将4 ml细胞悬液转移至25 ml组织培养瓶中，放入CO2培养箱（37 °C，5% CO2，80%湿度）中培养。

4. 难度照射与固定

  1. 将步骤 3.8 中剩余的 1 ml 细胞悬液转移至预冷的 1.5 ml 离心管中，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。本样品中测得的 DNA 损伤将同时反映处理诱导的损伤以及用于构建 DNA 修复曲线的 t = 0 时间点数据。
  2. 使用真空泵小心吸除上清液。将沉淀物轻柔地重悬于 1 ml TBS 缓冲液（20 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl，2.7 mM KCl）中。
  3. 于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。使用真空泵小心吸除上清液。将沉淀物轻柔地重悬于 300 μl TBS 中。
  4. 在低速涡旋振荡的同时，加入 700 μl -20 °C 的 100% 乙醇。盖紧管盖并轻轻颠倒数次以混匀。
  5. 将样品储存于 -20 °C。乙醇固定的脾细胞可在 -20 °C 下保存至少 12 个月，而 γH2AX 信号无明显损失。
  6. 使用现有的辐照装置，对步骤 3.8 中的脾细胞培养物进行 2 Gy 的挑战性 γ 辐照，剂量率 ≥ 200 mGy/min。
    注意：此次辐照的目的是诱导 DNA 双链断裂（DSB），以挑战细胞的修复机制。X 射线也可用于此目的。
  7. 立即将培养物放回 CO2 培养箱中。
  8. 在 2 Gy 挑战性辐照后 1 小时，将培养物从培养箱转移至生物安全柜中。为获取代表性样品，使用移液器轻柔重悬细胞，并将 1 ml 细胞悬液转移至预冷的 1.5 ml 离心管中。随后将细胞培养物放回 CO2 培养箱中。
  9. 于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。使用真空泵小心吸除上清液。将沉淀物轻柔地重悬于 1 ml TBS 中。
  10. 重复步骤 4.3 至 4.5。
  11. 在 2 Gy γ 辐照后 24 小时，按照步骤 4.8 至 4.10 所述方法收集并固定 t = 24 小时的样品。

5. 使用抗-γH2AX 抗体进行免疫荧光标记

注意：通常情况下，每天可对15至30个样本进行免疫荧光标记，并通过流式细胞术在单次运行中完成检测。为确保不同处理组之间的准确比较，每组均应包含一个或多个样本。更多详细信息请参见参考文献16 。

  1. 根据待处理样本数量，准备一组带标记的试管并置于冰上。使用12 x 75 mm未封口的玻璃试管。本实验无需无菌条件。额外准备一个仅用于标记二抗的对照样本（“2nd Ab only”），作为历史对照。在每项研究中的每次流式细胞术检测中均应使用该历史对照样本。
  2. 向每支试管中加入0.5 ml预冷的TBS缓冲液。
  3. 从-20 °C取出固定后的脾细胞，涡旋振荡5秒，将0.5 ml分装液转移至已准备好的含TBS缓冲液的试管中。将剩余样本立即放回-20 °C保存，作为备份样本。
  4. 在4 °C下以300 x g离心脾细胞5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于含1% FBS的1 ml预冷TBS缓冲液中。
  5. 在4 °C下以300 x g离心细胞5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于1 ml TST缓冲液（含0.05% Triton X-100和2% FBS的TBS）中。冰上孵育20分钟。
  6. 在4 °C下以300 x g离心细胞5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于200 μl用TST缓冲液按1:150稀释的一抗anti-γH2AX抗体溶液中。对于“2nd Ab only”对照样本，使用200 μl TST缓冲液代替一抗溶液。
  7. 将试管以45–60°倾斜角置于旋转摇床上，在室温下以300 x g振荡孵育1.5小时。
  8. 在孵育期间，用TST缓冲液将Alexa-488标记的山羊抗小鼠二抗按1:200稀释，配制足够体积（每样本200 μl）。
    注意：所有涉及Alexa-488标记抗体的操作（如下文步骤5.10至5.16）均应在弱光条件下进行，且标记后的样本需用铝箔包裹试管以避光保护。
  9. 完成1.5小时孵育后，向每支试管中加入1 ml含2% FBS的预冷TBS缓冲液，在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于1 ml含2% FBS的TBS缓冲液中。
  10. 在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于200 μl来自步骤5.8的二抗溶液中。
  11. 按照步骤5.7的方式，在摇床上孵育样本1小时。
  12. 向每管中加入1 ml含1% FBS的预冷TBS缓冲液。
  13. 在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于1 ml预冷的TBS缓冲液中。
  14. 在4 °C下以300 x g离心5分钟。弃去上清液，轻轻重悬沉淀于0.5 ml含50 μg/ml碘化丙啶的TBS缓冲液中。
  15. 室温下避光孵育5分钟。
  16. 根据仪器特定的操作流程16在流式细胞仪上分析样本。每样本至少检测10,000个细胞。

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结果

图2 展示了使用本方法制备的脾细胞预期的流式细胞术图表示例。细胞首先根据前向散射光和侧向散射光进行设门 <电子体积-侧向散射> 散点图图 2A 和 二维；电子体积相当于前向散射）。FL3/碘化丙啶直方图（图2B 和 2E）证实细胞周期分布正常。使用FL1通道计算的平均γH2AX信号证实了 > 2 Gy 照射细胞中 DNA 双链断裂增加 2 倍（图 2F）与未经处理的对照组相比（图2C接下来，我们检测了通过流式细胞术测量免疫荧光标记的γH2AX在小鼠脾细胞中所述方法的敏感性。 图3A 显示小鼠脾细胞在处理1小时后的γH2AX水平，提示DNA双链断裂（DSB） 离体 与未处理的对照组相比，暴露于低剂量（0.1 Gy）或高剂量（2 Gy）γ辐射后，均可观察到DSB水平的变化。可见0.1 Gy诱导DSB水平轻微升高，且该升高具有统计学显著性。...

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讨论

本文所述方案适用于开展大规模的小鼠体内研究，以检测各种化学和物理因素（包括电离辐射）在低剂量水平下的遗传毒性效应。我们独特的无特定病原体动物设施配备有GammaBeam 150辐照仪和一条长达30米的辐照通道，可支持对数百甚至数千只小鼠进行终生、低剂量率或极低剂量率的长期辐照研究。在大学或医院环境中，若常规开展放射生物学研究并遵循辐射防护指南/法规，则可建立规模较小的慢性低剂量辐照设施。然而，对于涉及放射性核素（如氚）操作的动物体内辐照设施，通常适用更严格的监管规定。尽管此类经认证可开展体内辐射暴露研究的实验室较为罕见，但在全球多个研究机构中仍存在，其独特的技术能力可用于本方案所述的研究工作。

在本实验方案中，我们采用γH2AX的免疫荧光标记来准确评估实验暴露所诱导的DNA双链断裂（DSB）水平。更重要的是，通过对分离出的脾细胞进行体外（ex vivo）挑战性照射，可以评估DNA双链断裂应答的完整性（挑战后1小时的γH2AX水平）以及DNA双链断裂修复能力（24小时与0小时相比的γH2AX水平）。需要注意的是，通过荧光显微镜对每个细胞中γH2AX...

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披露

作者声明不存在任何已知的相互竞争的财务利益。

致谢

作者谨此感谢法国巴黎辐射防护与核安全研究所（Institute of Radioprotection and Nuclear Safety，法国巴黎）的同事 Sandrine Roch-Lefevre 和 Eric Gregoire 所做出的贡献。本工作得到了加拿大政府科学技术项目在加拿大核实验室（加拿大安大略省查尔克河）、CANDU 所有者集团（加拿大安大略省多伦多）、加拿大核安全委员会以及法国巴黎辐射防护与核安全研究所的资助和支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HTO：氚水，[3H]从本地核反应堆获取 储备液活度为 3.7 GBq/mL；  可用 Perkin Elmer 的 HTO 替代
OBT：丙氨酸，L-[3-3H]：有机结合氚（OBT）Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT：甘氨酸，[2-3H]：有机结合氚Perkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT：脯氨酸，L-[2,3-3H]：有机结合氚（OBT）Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
氚水，[3H]（HTO）Perkin ElmerNET001B005MC可替代本地来源的 HTO  
GammaBeam 150 照射仪加拿大原子能有限公司本地制造可用活度足够低的其他 γ 辐射源替代 
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMI赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）SH3025501Hyclone RPMI 1640，含 L-谷氨酰胺和 HEPES，500 mL
胎牛血清Sigma AldrichF1051-100ML
抗 gH2AX 抗体，克隆株 JBW301Millipore05-636
Alexa Fluor-488 山羊抗小鼠抗体Life Technologies（原 Invitrogen）A21121
碘化丙啶Sigma AldrichP4864-10ML1 mg/ml
乙醇Commercial AlcoholsP006-EAAN500 ml 瓶装无水乙醇
1.5 ml 离心管赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）2682550微量离心管
15 ml 离心管赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）05-539-5无菌聚丙烯离心管
液氮LindeP110403
12 x 75 mm 未封口玻璃管赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）K60B1496126一次性硼硅酸盐玻璃管，平口端
T25 培养瓶VWRCA15708-120Nunc 组织培养瓶 25 ml（供应商编号 156340）
剪刀Fine Science Tools14068-12Wagner 剪刀，12 cm，尖头/尖头
直头镊子Fine Science Tools11008-13Semken 镊子，13 cm，直头
弯头镊子Fine Science Tools11003-12Narrow Pattern 镊子，12 cm，弯头
60 mm 培养皿VWRCA25382-100BD Falcon 组织培养皿 60 x 15 mm
细胞筛，70 mm赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）08-771-2Falcon 细胞筛，每箱 50 个
PBS 配方：1 片溶解于 200 ml 去离子水中，必要时调节 pH 至 7.4。Sigma AldrichP4417-100TAB磷酸盐缓冲液片剂
TBS 配方：配制 10x 储备液
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma 盐酸盐
88 g NaCl赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）S271-500氯化钠
2 g KCl赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）P217-500氯化钾
溶于 1 L 去离子水中，调节 pH 至 7.4

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