一种用于评估慢性因素可能诱导的DNA损伤水平及DNA修复能力变化的实验方案 体内 通过流式细胞术检测磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标志物），展示小鼠脾淋巴细胞中低剂量辐射的影响。
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本文内容
摘要
摘要
低剂量辐射暴露可能产生多种生物学效应，其效应在数量和质量上均不同于高剂量辐射所引起的效应。以恰当且科学合理的方式回答与环境、职业和公共健康安全相关的问题，在很大程度上依赖于准确测量低剂量污染物（如电离辐射和化学物质）生物学效应的能力。DNA损伤与修复是评估健康风险最重要的早期指标，因其具有潜在的长期后果，例如癌症。本文描述了一种研究慢性 体内 低剂量γ射线和β射线照射对小鼠脾细胞DNA损伤与修复的影响。利用一种广泛认可的DNA双链断裂标志物——磷酸化组蛋白H2AX（称为γH2AX），我们展示了该标志物不仅可用于评估DNA损伤水平，还可用于检测低剂量辐射可能引起的DNA修复能力的变化 体内 曝光。流式细胞术可对大量样本中免疫荧光标记的γH2AX进行快速、准确且可靠的检测。通过将分离的脾细胞暴露于2 Gy的挑战性辐射剂量，可诱导足够数量的DNA双链断裂以启动修复过程，并通过检测辐射后1小时的诱导性DNA损伤和辐射后24小时的残留DNA损伤来评估DNA双链断裂修复能力。残留DNA损伤提示修复不完全，可能带来长期基因组不稳定性和癌症风险。结合其他可在此类样本中轻松测量的检测方法和终点指标 体内 研究（例如染色体畸变、骨髓网织红细胞微核率、基因表达等），该方法能够对低水平应激源的生物学效应进行准确且具有生物学背景的评估。
引言
关于低剂量或极低剂量电离辐射可能产生的有害效应，一直存在重大争议。公众对辐射的恐惧主要源于广岛和长崎原子弹爆炸的画面以及罕见的核电站事故（媒体的大肆报道加剧了这种恐惧），这导致了极为严格的辐射防护法规和标准，而这些标准可能缺乏充分的科学依据。在过去三十年中，大量研究报告指出，低剂量辐射不仅未表现出有害效应，反而可能诱导出潜在的有益生物学效应1-4。辐射对健康的主要风险因素是致癌概率，该概率是基于接受高剂量或中等剂量辐射的原子弹幸存者的流行病学研究估算得出的。目前采用将这些数据线性外推的方法（即所谓的“线性无阈”模型，LNT模型）来估计低剂量辐射下的癌症风险。然而，这种方法并未获得全球科学界的普遍认可，且仍存在激烈争论5。
显然，需要开展更多研究来阐明这一问题，并可能改进辐射防护标准。此类研究应包括慢性处理（对环境和职业暴露的最佳模拟）、体内动物模型（最适用于将效应外推至人类）以及DNA损伤率、DNA修复和诱变等终点指标。已知DNA是辐射损伤效应的主要靶点，修复不完全或错误修复可能导致诱变和癌症的发生6。
DNA 双链断裂（DSB）是最具危害性的 DNA 损伤类型之一，可能导致细胞死亡和肿瘤发生7。因此，能够可靠且准确地测量低剂量辐射和/或化学污染物等其他应激因素暴露后 DSB 的水平显得尤为重要。目前最敏感且特异的 ....
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方案
所有小鼠的操作和处理程序均应遵守立法机构和/或动物护理项目制定的规定，并经当地动物护理委员会批准。本方案中描述的所有方法均按照加拿大动物护理委员会的指南进行，并获得当地动物护理委员会的批准。
警告：所有涉及放射性物质的工作（包括但不限于氚的处理、外部γ射线照射、放射性动物组织的处理、垫料废弃物的处理）均应遵守立法机构和/或辐射防护主管部门制定的规定，并由经授权的人员在经过认证的实验室和/或设施中进行。
1. 动物实验
- 动物分组
- 若小鼠来自外部机构，需在动物设施中至少适应环境10天。如果研究包含多个处理组，应确保动物供应商能够将所有动物作为同一批次送达。
- 将小鼠随机分配至处理组，每组10只。若使用C57BL/6品系的雄性小鼠，建议由动物供应商在其设施内预先对年轻的C57BL/6雄性小鼠进行随机分组，以减轻攻击性问题。
- 小鼠长期暴露于内源性β射线辐射
- 通过稀释原始HTO和OBT（氚标记的脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸氨基酸混合物）溶液，配制小鼠饮水中氚的工作浓度（10 kBq/L 和 1 MBq/L）。
- 使用液体闪烁计数器测量放射活性，验证饮水中氚的最终浓度；必要时调整浓度。
- 通过自由饮水方式对动物进行为期一个月的处理。若在两周内处理用水量减少，需补充更多水；否则每两周更换一次水瓶。
- 对照组小鼠同样进行相同操作....
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结果
图2 展示了使用本方法制备的脾细胞预期的流式细胞术图表示例。细胞首先根据前向散射光和侧向散射光进行设门 <电子体积-侧向散射> 散点图图 2A 和 二维；电子体积相当于前向散射）。FL3/碘化丙啶直方图（图2B 和 2E）证实细胞周期分布正常。使用FL1通道计算的平均γH2AX信号证实了 > 2 Gy 照射细胞中 DNA 双链断裂增加 2 倍（图 2F）与未经处理的对照组相比（图2C接下来，我们检测了通过流式细胞术测量免疫荧光标记的γH2AX在小鼠脾细胞中所述方法的敏感性。 图3A 显示小鼠脾细胞在处理1小时后的γH2AX水平，提示DNA双链断裂（DSB） 离体 与未处理的对照组相比，暴露于低剂量（0.1 Gy）或高剂量（2 Gy）γ辐射后，均可观察到DSB水平的变化。可见0.1 Gy诱导DSB水平轻微升高，且该升高具有统计学显著性。.......
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讨论
本文所述方案适用于开展大规模的小鼠体内研究，以检测各种化学和物理因素（包括电离辐射）在低剂量水平下的遗传毒性效应。我们独特的无特定病原体动物设施配备有GammaBeam 150辐照仪和一条长达30米的辐照通道，可支持对数百甚至数千只小鼠进行终生、低剂量率或极低剂量率的长期辐照研究。在大学或医院环境中，若常规开展放射生物学研究并遵循辐射防护指南/法规，则可建立规模较小的慢性低剂量辐照设施。然而，对于涉及放射性核素（如氚）操作的动物体内辐照设施，通常适用更严格的监管规定。尽管此类经认证可开展体内辐射暴露研究的实验室较为罕见，但在全球多个研究机构中仍存在，其独特的技术能力可用于本方案所述的研究工作。
在本实验方案中，我们采用γH2AX的免疫荧光标记来准确评估实验暴露所诱导的DNA双链断裂（DSB）水平。更重要的是，通过对分离出的脾细胞进行体外（ex vivo）挑战性照射，可以评估DNA双链断裂应答的完整性（挑战后1小时的γH2AX水平）以及DNA双链断裂修复能力（24小时与0小时相比的γH2AX水平）。需要注意的是，通过荧光显微镜对每个细胞中γH2AX.......
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披露
作者声明不存在任何已知的相互竞争的财务利益。
致谢
作者谨此感谢法国巴黎辐射防护与核安全研究所（Institute of Radioprotection and Nuclear Safety，法国巴黎）的同事 Sandrine Roch-Lefevre 和 Eric Gregoire 所做出的贡献。本工作得到了加拿大政府科学技术项目在加拿大核实验室（加拿大安大略省查尔克河）、CANDU 所有者集团（加拿大安大略省多伦多）、加拿大核安全委员会以及法国巴黎辐射防护与核安全研究所的资助和支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HTO：氚水，[3H] | 从本地核反应堆获取 | 储备液活度为 3.7 GBq/mL； 可用 Perkin Elmer 的 HTO 替代 | |
| OBT：丙氨酸，L-[3-3H]：有机结合氚（OBT） | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT：甘氨酸，[2-3H]：有机结合氚 | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT：脯氨酸，L-[2,3-3H]：有机结合氚（OBT） | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| 氚水，[3H]（HTO） | Perkin Elmer | NET001B005MC | 可替代本地来源的 HTO |
| GammaBeam 150 照射仪 | 加拿大原子能有限公司 | 本地制造 | 可用活度足够低的其他 γ 辐射源替代 |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640，含 L-谷氨酰胺和 HEPES，500 mL |
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| 抗 gH2AX 抗体，克隆株 JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa Fluor-488 山羊抗小鼠抗体 | Life Technologies（原 Invitrogen） | A21121 | |
| 碘化丙啶 | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| 乙醇 | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml 瓶装无水乙醇 |
| 1.5 ml 离心管 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 2682550 | 微量离心管 |
| 15 ml 离心管 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 05-539-5 | 无菌聚丙烯离心管 |
| 液氮 | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm 未封口玻璃管 | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | K60B1496126 | 一次性硼硅酸盐玻璃管，平口端 |
| T25 培养瓶 | VWR | CA15708-120 | Nunc 组织培养瓶 25 ml（供应商编号 156340） |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner 剪刀，12 cm，尖头/尖头 |
| 直头镊子 | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken 镊子，13 cm，直头 |
| 弯头镊子 | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern 镊子，12 cm，弯头 |
| 60 mm 培养皿 | VWR | CA25382-100 | BD Falcon 组织培养皿 60 x 15 mm |
| 细胞筛，70 mm | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | 08-771-2 | Falcon 细胞筛，每箱 50 个 |
| PBS 配方：1 片溶解于 200 ml 去离子水中，必要时调节 pH 至 7.4。 | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | 磷酸盐缓冲液片剂 |
| TBS 配方：配制 10x 储备液 | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma 盐酸盐 |
| 88 g NaCl | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | S271-500 | 氯化钠 |
| 2 g KCl | 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific） | P217-500 | 氯化钾 |
| 溶于 1 L 去离子水中，调节 pH 至 7.4 |
参考文献
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
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