Abstract
低剂量的辐射暴露可能产生多种生物效应是在由高辐射剂量所产生的影响的数量和质量不同。处理适当和有科学依据的方式与环境，职业健康和公共卫生安全问题在很大程度上依赖于准确测量低剂量的污染物，如电离辐射，化学物质的生物效应的能力。 DNA损伤和修复是健康风险最重要的早期指标，由于其潜在的长期后果，例如癌症。在这里，我们描述了一种协议来研究慢性体内暴露于低剂量的γ-和β射线对DNA损伤和修复在小鼠脾细胞中的作用。采用DNA双链断裂的一个普遍接受的标记，磷酸化组蛋白H2AX被称为γH2AX，我们展示它如何被用于评估DNA损伤的不仅是水平，而且还改变在DNA修复能力可能通过体内暴露低剂量制备。流式细胞仪允许在大量样品的免疫荧光标记的γH2AX的快速，准确和可靠的测量。 DNA双链断裂修复可以通过暴露提取脾细胞的2戈瑞一个具有挑战性的剂量以产生足够数量的DNA的破坏触发修理和通过测量诱导（1小时后照射）和残留的DNA损伤进行评估（24小时照射后）。残余DNA损伤将指示不完全修复和长期的基因组不稳定和癌症的风险。结合其它测定法和最终点，可以很容易地在这种被测定体内研究（ 例如 ，染色体畸变，在骨髓的网织红细胞微核频率，基因表达等），这种方法允许的生物效应的准确和上下文评价低水平压力。
Introduction
显著争论低或非常低剂量的电离辐射和公众的恐惧辐射，由广岛和长崎原子弹爆炸和珍稀核电站事故的图像驱动的潜在有害影响（通过大众媒体加剧），导致了很严格的辐射防护监管和有潜在不能科学合理的标准。在过去的三十年中，许多报告已经证明了两者的不足和有害诱导低剂量辐射1-4潜在有益的生物效应的存在。主要辐射的健康危险因素是癌症的概率，根据对原子弹爆炸幸存者接受高或中等剂量的辐射流行病学研究估计。这些数据（所谓的线性无阈值或LNT模型）的线性外推来估算的癌症风险在低剂量。然而，这种方法并没有收到世界通用的科学验收并被大量辩论5。
很明显，更多的研究来澄清这一问题，并可能提高辐射防护标准。这些研究应当包括（最好为外推效果对人类）和这样的最终点作为DNA损伤率，DNA修复和诱变慢性治疗（环境和职业暴露最佳逼近）， 在体内动物模型。已知的是，DNA的是用于破坏性辐射效应和不完整或错误修复可导致诱变和癌发展6的主要目标。
DNA双链断裂（DSB）是最有害类型的DNA损伤之一，并且可能会导致细胞死亡和肿瘤发生7。据，因此，重要的是能够可靠地和精确地测量DSB暴露于低剂量辐射和/或其他压力，如化学污染物后的水平。其中最敏感和特异的标记物的DNA DSB的是磷酸化组蛋白H2AX，称为γH2AX8，但其他标记物和方法已被建议9,10。据估计，数千H2AX分子，在诱导的DSB的附近，是参与γH2AX的形成可进行个体的DSB的通过免疫荧光标记的检测与抗γH2AX抗体和荧光显微镜11。该反应是非常快的，分30至60达到其最大值。有证据表明γH2AX利于修复DNA DSB通过吸引其他修复因子来休息的场所，并通过改变染色质结构来断锚定DNA末端，并提供访问其他修复蛋白（12综述）。在修复DNA DSB的完成，得到γH2AX去磷酸化和/或发生退化，新合成的分子H2AXγH2AX替代染色质10的受灾地区。监测γH2AX的形成和损失，因此，提供的DNA DSB修复动力学的精确估计。这种方法已被用于研究修复DSB在照射高剂量的辐射和其速率和残留的DSB水平的各种人肿瘤细胞系已被证实与放射敏感性13-15。
我们修改了这个实验方法并将其应用到小鼠体内研究，探讨低剂量慢性γ-和β辐射对DNA DSB水平和维修（图1）的影响。首先，我们展示了一个方法来执行的小鼠的长期慢性暴露于β辐射由氚或者发射（氢-3）中氚化水（HTO）的形式或作为有机结合的氚（OBT）溶解在饮用水。这两种形式都预期累积和/或分发不同的机构，因此，产生不同的生物学效应。这两种形式是核工业的潜在危险。这种治疗方法由长期暴露于γ射线在等效剂量率并联以允许正确比较的两个辐射类型，这对于它们的相对生物学有效性的评价是至关重要的。的β-辐射是由电子的，使得它从γ射线，高能光子非常不同。由于这种差异，Β辐射表示主要是内部的健康危害和可能产生较γ射线不同的生物学效应。这种并发症导致曝光过度的监管，β射线通过HTO发出显著争议。因此，HTO在饮用水的公共管理水平各不相同，从100贝可/ L的欧洲至75,000贝可/ L，在澳大利亚。它是，因此，重要的是要比较HTO生物效应等效剂量γ射线的。其次，DNA DSB的速率是使用免疫荧光标记的γH2AX检测完成慢性暴露后测定分离的脾细胞通过流式细胞仪主编。这允许通过在体内暴露造成DNA损伤的程度的评价。然而，这是明智的预期，这些低水平暴露可能不会产生DNA DSB任何检出率;相反，一些隐藏更改/应答可以预期这将影响到细胞的修复DNA损伤的能力。这些变化中，如果发现，可以是刺激（产生有益的影响）或抑制（产生有害的影响）。该协议允许通过用高剂量的辐射，产生一个显著量损坏的挑战所提取的脾细胞揭示这样的变化（ 例如 ，2戈瑞产生每细胞约50的DNA DSB或3 - 5倍，增加总的γH2AX水平） 。接着，形成与γH2AX的损失，这反映了DSB修复的起始和结束时，通过流式细胞术监测。以这种方式，不仅基底和DNA DSB的治疗引起的水平可以被测量，但还对细胞的能力的潜在影响作出回应和修复DNA损伤诱导的高得多的水平应激。
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Protocol
所有的鼠标操作和处理程序应遵循规定由立法机关和/或动物保健计划，并批准由当地动物保护委员会的规则。在这个协议中描述的所有方法均按照加拿大理事会关于动物保护与当地动物保护委员会批准的指导进行。
注意：有放射性的所有工作（包括但不限于处理氚，γ外照射，放射性处理的动物组织，床上用品废物）要坚持规定由立法机关和/或辐射防护部门的规则，并授权执行人员经过认证的实验室和/或设施。
1.动物工作
- 动物分组
- 如果小鼠从外部组织到达，适应环境的动物在动物设施至少10天。如果研究包括多个治疗组，保证了动物的供应商可以发送人升动物单批。
- 随机分配小鼠到10只小鼠每组的治疗组。如果使用雄性小鼠C57BL / 6株，有动物的供应商预先安排的非常年轻的C57BL / 6雄性随机在他们的设施，以缓解侵略的问题。
- 慢性暴露小鼠对内部β射线
- 通过稀释HTO和OBT溶液（氚化脯氨酸，丙氨酸和甘氨酸的氨基酸的混合物）的原始库存制备氚在小鼠的饮用水工作浓度（10 kBq / L和1活度/ L）。
- 通过用液体闪烁计数器测量放射性验证在饮用水的最终浓度的氚。调整浓度，如果需要的话。
- 通过提供自由采食的氚水对待动物一个月。如果处理水在两周内变低，多补充水分。否则，两周改变瓶。
- 对待假照控制小鼠相同。让他们在一个单独的“干净”的房间或在正气压以避免氚交叉污染从空气中一个单独的“干净”的架子。
- 慢性暴露小鼠对外部γ射线
注意：γ-辐照装置/设备将根据位置而变化。 - 使用剂量的可利用的方法，确定从γ射线源，其具有产生所要求的剂量率的辐射场的距离。确保涵盖了动物笼舍的范围内辐射场的均匀性。
注意：1.7μGy/小时相当于1活度/在物L氚产生的剂量率。 - 通过将鼠标笼在一个月步骤1.3.1确定的距离暴露的小鼠。减少γ射线的每日中断30分钟。用热释光剂量计来测量总吸收剂量。
2.牺牲和采样
注意：提取脾脏，可以保持60毫米培养皿与媒体（长达2小时），而小鼠的其余部分是sacrificED。取决于参与，第5和15只小鼠之间的人数可以在一天之内进行处理。
3.准备脾细胞培养的
- 通过切碎细胞过滤用无菌镊子一弯曲端内均匀脾。
- 除去细胞过滤并收集从60mm培养皿的过滤细胞悬液到15毫升管。
- 冲洗细胞过滤用5ml介质收集所述细胞的剩余部分。
- 离心管，在300×g离心5分钟，在RT。
- 倒出上清液并重新悬浮沉淀在10ml的RPMI。
- 离心管，在300×g离心5分钟，在RT。
- 倒出上清液并重新悬浮沉淀在5毫升的RPMI。
- 传输4 ml的细胞悬浮液加入25毫升组织培养烧瓶中，并转移到CO 2培养箱（37℃，5％CO 2，80％湿度）
4.挑战照射和修复
- 转移剩下的1 ml的细胞悬浮液从步骤3.8到1.5毫升管在冰上和离心机在300×g离心5分钟，在4℃。此样品中测量DNA损伤将代表两个治疗诱导损伤和t = 0的数据点的DNA修复曲线的构造。
- 小心吸用真空泵上清液。轻轻在1ml TBS缓冲液（20mM的Tris pH值7.4，150 mM氯化钠，2.7毫摩尔KCl）中重新悬浮沉淀。
- 离心管，在300×g离心5分钟，在4℃。小心吸用真空泵上清液。轻轻在300微升TBS的重新悬浮颗粒。
- 在混合的同时在涡流在低速，加入700μl-20℃的100％乙醇。盖上盖子，倒转几次混合。
- 储存的样品在-20℃。脾细胞固定在乙醇可以储存在-20℃至少12个月没有在γH2AX信号中的任何明显的损失。
- 照射步骤3.8的脾细胞培养与一个具有挑战性的γ-RAD 2戈瑞iation剂量在使用可用照射装置的剂量率≥200毫戈瑞/分。
注意：该照射的目的是诱导的DNA DSB挑战修复机制。 X射线，也可以用于此目的。 - 立即返回培养到CO 2培养箱。
- 具有挑战性的2戈瑞照射后1小时，取出从孵化器文化的一个生物安全柜。收集有代表性的样品等分试样，轻轻重新悬浮使用移液器和细胞悬浮液转移1ml至1.5ml试管在冰上的细胞。返回的细胞培养在CO 2培养箱中培养。
- 离心管，在300×g离心5分钟，在4℃。小心吸用真空泵上清液。轻轻在1ml TBS中重新悬浮沉淀。
- 重复步骤4.3 - 4.5。
- 24小时的具有挑战性的2 Gy的γ射线照射，收获后按照步骤4.8中所述的= 24小时采样修复 - 4.10。
注意：通常情况下，15 - 每天30个样品，可免疫荧光标记的和由在单个运行流式细胞仪测定。以确保治疗组之间的精确比较，包括从每组样品（多个）。请参阅参考16的进一步细节。
- 制备管的样本数的在冰上的标记集进行处理和地点。使用12×75mm的无上限的玻璃管。不需要这个工作无菌。包括与二级抗体标记只有一个额外的历史对照样品（“第二只抗体”）。使用此历史对照样品中每一个流式细胞仪的一项研究中运行。
- 加入0.5毫升冰冷的TBS中至每个管。
- 为-20℃，涡流除去固定的脾细胞5秒和0.5毫升等分用TBS转移到准备好的试管中。将样品的剩余部分返回到-20℃的储存和保持作为备用样品。
- 离心机的脾细胞在300×g离心5分钟，在4℃。滗上清液轻轻在1ml冰冷的TBS中含1％FBS的重悬浮沉淀
- 离心细胞，在300×g离心5分钟，在4℃下。滗析出上清液并轻轻在1ml TST缓冲液（0.05％的Triton X-100，在TBS 2％FBS）中重新悬浮沉淀。孵育在冰上20分钟。
- 离心细胞，在300×g离心5分钟，在4℃下。滗析出上清液并轻轻在200μl初级抗γH2AX抗体的稀释1重新悬浮沉淀：150中TST缓冲器。用200微升TST为“第二只AB”对照样品。
- 在旋转振荡器上在45°角位置管 - 60°和摇1.5小时，在300×g离心在RT。
- 而管温育，准备在一个1缀合有Alexa-488山羊抗小鼠二级抗体的足够体积（200微升/样品）：200稀释在TST缓冲器。
注：所有涉及的Alexa-488的工作缀合抗体（步骤5.10至5.16以下）应该光线昏暗的条件下完成，并且标记的样品应当通过包装管在铝箔避光。 - 一旦1.5小时温育完成后，加入1毫升的冰冷的TBS含有2％FBS的每个试管和离心机在300×g离心5分钟，在4℃。滗析出上清液并轻轻于1ml含有2％FBS的TBS中重新悬浮沉淀。
- 离心机在300×g离心5分钟，在4℃。滗上清液轻轻从步骤5.8重悬沉淀在200μl第二抗体溶液。
- 孵育1小时的摇动平台上的样品如在步骤5.7。
- 加入1毫升的冰冷的TBS中含1％FBS中。
- 离心机在300×g离心5分钟，在4℃。滗上清液轻轻在1ml冰冷的TBS重悬沉淀。
- 离心机在300×g离心5分钟，在4℃。滗析出上清液并轻轻在0.5含有50微克/毫升的TBS毫升重新悬浮沉淀碘化。
- 孵育5分钟，在室温避光。
- 在流式细胞仪上使用仪器专用协议16分析的样品。读每个样品至少10,000个细胞。
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Representative Results
图2示出流的例子术预期脾图形使用此处描述的方法制备。根据<电子音量侧散射>散点图细胞被第一选通（ 图2A和2D;电子体积相当于前向散射）。 FL3 /碘化丙直方图（ 图2B和2E）确认正常细胞周期分布。意味着使用FL1通道计算γH2AX信号证实了> 2倍的增加的DNA DSB在2-戈瑞照射细胞（ 图2F）相比于未处理的对照（ 图2C）。接着，我们研究了通过流式细胞术在小鼠脾细胞测定免疫荧光标记的γH2AX所描述的方法的灵敏度。 图3A示出的γH2AX水平，指示的DNA DSB的，在小鼠脾细胞体外暴露后1小时或低（0.1戈瑞）或高（2戈瑞）的剂量相对于未处理对照γ射线的。它可以看出，0.1戈瑞诱导DSB的水平略有增加，而增加在统计学显著。强3倍的诱导预期和2戈瑞曝光后检测。来验证的γH2AX免疫荧光标记的特异性在协议中描述的，标记的细胞进行了检查用荧光显微镜。所观察到的显着的灶状图形表示该荧光信号从染色质中的单个的DNA DSB（ 图3B）起源。
的DNA DSB率的评估以及它们在小鼠脾细胞暴露一个月至非常低的浓度的氚化水（10 kBq / L）的修理的代表性结果示于图4中 。可以看出（ 图4A），尽管处理导致在基底γH2AX水平增加10％，变化为无吨统计学显著（N = 5，单样本t检验）。此外，所测量的形成和γH2AX的损失有挑战性2Gy辐射后，代表DNA DSB修复的动力学，是不是从控制和HTO处理的小鼠（ 图4B）的小区之间的不同。
图1.实验图，以评估慢性体内照射对DNA损伤和DNA修复的效果。后体内治疗小鼠慢性照射的所需时间的，处死小鼠和脾细胞培养物被建立并暴露于一个具有挑战性的照射。脾细胞的等分试样被收集和具有挑战性的剂量后固定在不同的时间。 γH2AX水平，然后利用免疫测定拉贝林格和检测用流式细胞仪。在图的底部的情节是预期的数据的示意图。伽马-H2AX水平急剧具有挑战性的照射量也随之下降回到控制值后早期增加，如果DNA修复完成。 DNA损伤Δ表示由于实验小鼠的治疗和DNA修复Δ所产生的伤害表示小鼠DNA DSB修复能力的治疗效果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.代表性流式细胞仪的原始数据。 （A，D）散点图和门控区的脾细胞和细胞碎片和红细胞。（B，E），代表细胞周期分布直方图的DNA。
图3.检测γH2AX通过流式细胞仪的灵敏和特异性的。 （A）的脾细胞从雄性的CBA小鼠新鲜分离的照射用0.1或2戈瑞γ射线，或假治疗和任其发展γH2AX响应1小时的。然后将细胞固定，免疫荧光用抗γH2AX抗体和流式细胞仪分析。标准化的平均值±SD显示（N = 12）。 *和***表示具有p <0.05 和p <0.001，尊称（单样本学生t-检验 ）的统计学差异。（B）的未处理的对照的代表性显微照片（UT）或2戈瑞照射的脾细胞免疫荧光标记的抗γH2AX抗体。绿色荧光的灶状图案为确认的γH2AX免疫荧光标记的特异性。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.代表性的结果显示，缺乏效应小鼠1个月暴露于氚化水：生产R（HTO）的DNA DSB水平和维修。 （A）的脾细胞从10 kBq / L的HTO的饮用水和对照动物处理的小鼠中分离。 γH2AX水平使用免疫荧光标记和流式细胞仪如在协议中所述。平均数相对于那些控制±SD的γH2AX荧光水平显示（N = 5）。从t = 0的时间点被用于在图3B为DNA DSB修复评价生成这些数据。（B）中查出脾细胞暴露于γ射线的一个具有挑战性的2戈瑞剂量和细胞的等分试样固定在时间t = 0时，具有挑战性的照射后1小时和24小时。 γH2AX的平均相对于其自己的T = 0的控制荧光显示±SD（N = 5）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文提出的协议是用于进行大规模的老鼠体内研究审查低水平各种化学和物理因素，包括电离辐射的遗传毒性作用是有用的。我们独特的无特定病原体动物设施配备了150 GammaBeam辐射和一个30米长的照射大厅允许进行涉及低或非常低剂量率照射在数百甚至数千老鼠终身学习。较小的辐照设施慢性低剂量照射，可设置在一所大学或医院的环境，放射生物学的研究进行例行和辐射防护指导方针/法规落到实处。然而，更严格的规定通常适用于设计用于内部动物辐照处理，其中的放射性核素，如氚，进行设施。虽然罕见，但实验室对这种内部的辐射暴露的研究证明在各种存在重和搜索机构世界各地的独特的功能，可用于在本议定书中所描述的研究。
在该协议中，我们使用γH2AX的免疫荧光标记，以准确评估实验所产生的风险的DNA DSB率。更重要的是，引入一个具有挑战性的照射递送体外对提取脾细胞使得有可能的DNA DSB修复以评价DNA DSB响应（γH2AX水平在攻击后1小时）的完好和（γH2AX水平在24小时时相比0小时）。应当指出的是，每个小区γH2AX灶的荧光显微镜量化可以提供更高的灵敏度相比流式细胞仪。例如，剂量可低至0.001戈瑞据报道产生显著增加每个细胞的γH2AX灶的数量。然而，使用流式细胞仪为基础的检测γH2AX的超过荧光显微镜分析贝科提供的优点使用它需要用于测量时间少，它不要求高度专业化的/经过培训的人员，并避免了主观决策相关γH2AX灶识别和计数。这些优点对于大规模动物研究是至关重要的。一个典型的动物实验用10治疗组和每组10只，将导致在100×3 = 300脾样品，如果该方法建议（ 图1）之后。从样品中的这个数生成数据，约100小时将用流式细胞仪是必需的。另外，如果做手工显微分析，同样的任务至少需要300小时，使用40分钟，每个样品的要求极高显微镜时间的保守估计。虽然企图自动化分析γH2AX灶和得分已17-19，它们都有许多限制。具体地，圆形和小鼠脾细胞和淋巴细胞小尺寸使得它不切实际解决所有逐张idualγH2AX灶显微镜。当贴壁细胞已成功打进自动显微镜系统γH2AX灶，没有成功已经证明了无论是小鼠脾细胞或淋巴细胞。
消除一天到一天的变异γH2AX信号通过流式细胞仪的测量值，最好的办法是包括在相同的运行试验组和对照样品，并计算出每一个运行中的相对γH2AX变化。其他建议包括：a）一个历史控制由未处理和2戈瑞照射样品是用在每次运行; B）一个人完成所有的抗体标记的程序;三）缓冲液和单批抗体，主要和次要的单一股票，用于在一个实验的整套样品。同样重要的是执行流式细胞仪的质量控制测试样品的每次运行推荐的仪器制造商经常和以前的。这是REQuired验证仪器的光学对准和流体系统，也有助于减少一天到一天的变化样品之间测量荧光γH2AX要比较或合并在一组。
应当指出的是，使用的时间点（ 例如 ，1，2，4，6小时）后有挑战性辐照可以帮助分析并且更详细地16测量短期DNA DSB修复动力学更大数目。然而，整体修复潜力和长期的健康影响的likeliness将由只在24小时测量和比较，一个是在初始时间点（t = 0时）13-15（ 图4）中观察到的残留损害来表示。
因为基底γH2AX水平是已知的使用所描述的方法中，第增加老的动物或衰老细胞20，在长期暴露小鼠研究（> 6个月）所获得的结果的更准确的解释E使用一个年轻的模型组，除了年龄匹配的控制，将是可取的。虽然一些报告表明γH2AX可能在增殖细胞，这将不相关的DNA DSB增加，这可以容易地通过测量S期和G2控制/ M期使用DNA直方图细胞级分（ 图2A中的D）。如果一定的实验条件下仍防止研究员使用γH2AX作为DNA损伤的标记物（由于以上或它们的组合中列出的原因），另一种蛋白质形成的DNA损伤病灶，如53BP1，可以使用21。
尽管我们没有使用这种方法对于非淋巴组织，如肌肉，心脏，脑和其他尝试，似乎难以处理它们用于流式细胞术。组织切片和显微镜对γH2AX灶数量将是选择的方法中，如果需要这样的组织的分析。然而，其他的淋巴样细胞，如外周血升ymphocytes，骨髓淋巴细胞或胸腺细胞，可用于测量γH2AX水平由所描述的方法。使用脾淋巴细胞的优点是细胞悬浮液的制备和大量细胞，它可以从一个脾脏中分离的相对简单性。如果附加的终点都包含在研究这变得更加有利。根据我们的经验，每只小鼠的脾细胞的典型产率允许至少10等份的集合，每个适合于任何以下测定的：流式细胞仪，RT-qPCR的用于基因或miRNA表达，免疫印迹，对CpG甲基化的基因组DNA检测。因此，收集在平行于那些对γH2AX终点附加脾细胞的等分试样可被用来测量参与DNA损伤信号和修复反应的基因的表达。这样的基因作为GADD45A和CDKN1A，即通常是转录上调响应于细胞毒素的治疗22，可以提供一个线索，磨她的细胞被正确地应对充满挑战的压力影响。同样地，蛋白水平和参与应激反应的翻译后修饰可以进行评估。最后，它是不期望任何的提取过程的步骤中，如果如这里所述进行，可以在脾细胞诱导的γH2AX。
这将是有益的，强烈推荐中牺牲，品尝更多的器官和组织，以补充脾按照协议，提出与其他端点获得的DNA损伤与修复数据。例如，我们例行收集骨髓细胞的体内骨髓微核测定中，对衰老相关β半乳糖苷酶和DNA修复基因表达测量的各种组织。收集其他组织将取决于在牺牲现有的技术支持的能力;但是，它可以在结果的正确解释和一万亩的建设显著帮助沟道多种生物响应低电平治疗相关的全身图像正在研究中。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
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