Introduction
En oftalmología, terapia génica ha emergido como la modalidad de tratamiento de retinopatías hereditarias monogénicas. Hay retinopatías hereditarias asociadas con genes en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) incluyendo Leber amurosis congénita 1,2, la retinitis pigmentosa 3 y 4 coroideremia. El campo de la investigación de la terapia génica se está expandiendo en ambos estudios preclínicos y ensayos clínicos utilizando vectores virales como el virus adeno -Associated (AAV), lentivirus (LV) y adenovirus (Ad) 5. Diferentes vectores virales tienen diferente tropismo en la retina. Para una terapia génica seguros y eficaces, vectores virales deben ser seleccionados cuidadosamente de acuerdo con las células diana y los genes diana.
La ruta de administración de genes también es importante para la administración de genes eficaz a las células diana, por lo tanto, debe elegirse cuidadosamente, también. Los dos métodos más comunes para la entrega intraocular de vectores virales se subretinal inyección y la inyección intravítrea 6. Este último, inyección intravítrea, ha sido ampliamente utilizado para la administración de fármacos para el tratamiento de la neovascularización coroidea en la degeneración húmeda macular relacionada con la edad (AMD) y edema macular en la retinopatía diabética 7. Ruta intravítrea proporciona una exposición de vectores virales a retina vítreo e interior, pero la difusión de los vectores de retina externa es limitado. Por otra parte, la ruta subretinal proporciona la entrega directa de vectores virales para el espacio potencial entre la retina y RPE, induciendo una ampolla localizada. Por lo tanto, la inyección subretiniana se considera actualmente una ruta más eficiente para atacar a las células fotorreceptoras y RPE. En términos de abordaje quirúrgico, pars plana es elegido como un lugar seguro para la inyección intravítrea de evitar daños a la retina en pacientes humanos. Simplemente modificando este enfoque a los ratones, podríamos inyectar vectores virales subretinally o intravireally través enfoque del limbo.
En este videoartículo, demostramos un método fácil y conveniente de la inyección subretiniana de vectores virales en ratones RPE. Después de la punción única en posterior a limbo con un medio de aguja 30 G, 33 una aguja roma G microlitro equipado jeringa se inserta en el espacio subretiniano a través del sitio de la punción limbal. Los vectores virales de 1,5-2 l de volumen se inyectan al espacio potencial entre la retina y el RPE inducir ampollas subretinianas. Este procedimiento se puede realizar bajo visualización directa usando microscopio quirúrgico. La práctica repetida garantiza resultados reproducibles incluso sin la visualización directa de la formación de la ampolla. Esto ayudará a los investigadores a realizar experimentos precisos y de ahorro de tiempo para la entrega de genes en ratones subretiniano RPE.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Comité Nacional de Seúl Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad Nacional de Seúl y Universidad Comité de Bioseguridad del hospital.
1. Preparación Kit de inyección y virales Vectores
- Prepare la jeringa microlitro equipado con una aguja roma 33 G esterilizada utilizando gas de óxido de etileno. Diluir los vectores virales en PBS durante la titulación adecuada en el tubo micro (es decir, 1 x 10 6 TU / l). Enjuague la jeringa varias veces con vectores virales para eliminar cualquier espacio muerto en la jeringa.
2. La inyección subretiniana de vectores virales
- Anestesiar los ratones adultos (es decir, 6 - 8 semanas de edad) con una inyección intraperitoneal de la mezcla de tiletaminane y zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg de peso corporal) y clorhidrato de xilazina (0,7 mg / kg de peso corporal) o un régimen de anestesia adecuada alternativa.
- Dilatar los alumnos con un colirio de fenilefrina al 0,5% y tropicamida 0,5%.
- Prepare la jeringa microlitro cargando con 1,5-2 l de vectores virales.
- Abra el párpado y el ojo sobresalga para exponer el ecuador para inyección conveniente y centrarse en bajo el microscopio operativo. Mantener la posición del ojo sobresalía hasta terminar la inyección, o el desplazamiento de la aguja puede ocurrir durante la inyección. Para mantener el globo ocular con firmeza, coloque los dedos fuera del reborde orbitario.
- Aplicar una gota de solución oftálmica viscoelástica a la superficie corneal.
- Coloque un pequeño tobogán cubierta redonda en la parte superior de la córnea para visualizar la retina.
- Perforar un pequeño agujero en ligero detrás del limbo utilizando un estéril 30 G 1/2 aguja para la inyección subretiniana más. Hacer el agujero inferior for el ojo derecho, y superior para el ojo izquierdo por la comodidad.
NOTA: Si el agujero se hace en temporal o nasal, es difícil ser cubierto por el párpado después de la inyección. Punción inicial debe hacerse ligeramente por detrás del limbo para evitar los vasos del limbo que se ejecutan a lo largo del limbo y se pueden reconocer fácilmente. Tenga cuidado de no golpear el objetivo con la aguja al hacer la punción inicial. No inserte todo el bisel de la aguja para evitar la punción de la lente. - Coloque la aguja roma 33 G de la jeringa microlitro a través del orificio pre-perforado y acercarse a la aguja en el espacio subretiniano, hasta el punto en que se sienta resistencia leve.
NOTA: Para la inyección subretiniana, el mejor ángulo de aproximación de la aguja es de unos 45 grados contra plano del iris, y la aguja roma debería ser empujado posteriormente hacia el área peripapilar. Cuadrada punteada indica la vía aguja sugerido a través de la cavidad vítrea para el injectio subretinianan en la Figura 1.
NOTA: No habrá resistencia sintió cuando la perforación (o paso) las capas de la retina, ya que son muy suaves. Así, el primer sentimiento de resistencia leve indica que la aguja ya ha tocado la capa de RPE y la inserción de la aguja debe ser detenido. Tener cuidado de no penetrar en el tejido escleral con una presión excesiva debido a que la aguja debe ser colocado en el potencial espacio subretiniano. Si la aguja perfora el tejido de la esclerótica por potencia excesiva, entra en los espacios orbitales extraoculares sin resistencia. (Este paso es crítico)
Figura 1. Esquema de la inyección subretiniana. H & E manchadas sección transversal del ojo del ratón que representa las estructuras con una vía de aguja para la inyección subretiniana marcada (un cuadrado de puntos). Ampliación: 40X, barra de escala: 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Inyectar los vectores virales (por ejemplo, 1 x 10 6 TU / l) suavemente en el espacio subretiniano sin temblor de evitar daños en el tejido no deseado y retirar la aguja suavemente. Sostenga firmemente el globo ocular durante la inyección como se describe en 2.4.
- Observar la formación de la ampolla subretiniana después de la inyección bajo microscopio quirúrgico para asegurarse de que no hay hemorragia retiniana.
Figura 2. Subretinal BELB Formación sin retiniana Hemorragia. Vista microscópica de BELB subretiniana después de la inyección subretiniana bajo microscopio quirúrgico muestra la formación de vesículas éxito sin hemorragia retiniana.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Cierre suavemente el párpado para cubrir el lugar de la inyección para la auto-sellado. Devolver los ratones para jaula y mantenerse con vida hasta la evaluación.
NOTA: Después de que los investigadores se acostumbran a los procedimientos, que pueden obtener los resultados repetibles con procedimientos rápidos saltarse estos pasos por (2.5, 6 y 10)
3. Evaluación de la eficacia de la entrega de genes en el epitelio pigmentario de la retina
- Sacrificar los ratones en la cámara de CO 2. Enuclear los ojos con unas tijeras.
- Fijar los ojos en la solución de paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante un mínimo de 1 hora a varios días.
- Coge la córnea con unas pinzas finas y perforar la córnea con micro-tijeras. Retire la córnea después de tijera a lo largo del limbo. Retire la lente con unas pinzas.
- Recorte el cuerpo ciliar con mICRO-tijeras que permiten el desprendimiento de retina. Tire suavemente toda la retina de la / coroides / esclerótica complejo EPR. Cortar el RPE / coroides / complejo escleral radialmente desde la periferia hacia el centro, cerca del nervio óptico varias veces para asegurarse de 4 a 8 hojas para el montaje plana.
- Da la vuelta al RPE / coroides / complejo escleral para hacer lateral RPE abajo, y recortar todos los tejidos que quedan en la parte escleral incluyendo los músculos, la conjuntiva y el nervio óptico. Este paso es importante hacer una RPE / coroides / complejo escleral plana porque cualquier tejido restante hace que el complejo desigual.
- Incubar el complejo con el anticuerpo primario y secundario para sus fines específicos de investigación (opcional, consulte las referencias para los métodos detallados). Piso-montar las RPE / coroideo / complejos escleral en el portaobjetos de vidrio y absorber el PBS con una esponja absorbente.
- Añadir 30 l de solución de montaje y coloque la tapa deslizante. Observar la muestra de la eficacia de la prestación de vector bajo el microscopio fluoresceína. Mantener las muestras enel refrigerador para su posterior observación.
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Representative Results
Para evaluar la eficacia de la inyección subretiniana en viral transducción génica mediante este protocolo, hemos utilizado vectores LV disponibles en el mercado con el promotor CMV que expresa tanto las buenas prácticas agrarias y RFP para el indicador. Los ojos fueron enucleados después de que el período de tiempo adecuado de acuerdo con el propósito de la investigación. Para los resultados representativos, los ojos fueron enucleados 10 semanas y 20 semanas después de la inyección subretiniana. Después de la eliminación completa de la retina utilizando el método descrito anteriormente, el plano de montaje de RPE complejo / coroides / esclerótica fue evaluada bajo el microscopio de fluorescencia. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3A (buen ejemplo con la eliminación completa de la retina) y la Figura 3B (mala ejemplo con retina intacta). Aunque la existencia de retina neural remanente (especialmente segmento externo de fotorreceptores) sobre la capa de RPE no interfirió para analizar el área de entrega de genes en RPE, bloqueó la fluorescencia de GFP / RFP y visua directa inhibidolización de la capa de RPE para otros análisis. Por lo tanto, la eliminación completa de la retina neural del complejo / coroides / esclerótica RPE proporcionaría mejores resultados.
Figura 3. El ejemplo de RPE / coroides / esclerótica Complejo plana de montaje de acuerdo con la eliminación completa de la retina. Veinte semanas después de la inyección subretiniana de Lentivirus con GFP / RFP génica. (A) Buen ejemplo de RPE plana montar con la eliminación completa de la retina muestra la expresión clara y discreta de GFP / RFP en las células del EPR. (B) Mal ejemplo de RPE plana de montaje debido a la no eliminación de la retina muestra el área de administración de genes con señales RFP que es inadecuada para analizar la patología RPE. Ampliación: 40X, Barra de escala:. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(es decir, 2 l). Esto ayuda a ajustar título viral apropiada para el experimento.
Los resultados representativos de RPE / coroides / escleral plana complejo de montaje 10 semanas después de la inyección subretiniana se muestra en varios de ampliación en la figura 4 (40X) y la Figura 5 (400X). Las imágenes con bajo aumento son suficientes para evaluar el área de las buenas prácticas agrarias expresión / RFP. Por otro lado, las imágenes con alta magnificación son necesarios para otra patología RPE con respecto a los propósitos específicos de los investigadores. Estas imágenes ingenioh diversas ampliaciones ayudan a comprender el patrón de expresión viral en RPE (Figura 4 y 5). También hemos comprobado la expresión de GFP / RFP hasta 36 semanas después de la inyección. La expresión de GFP / RFP todavía se observó después de la inyección 36 semanas post (datos no mostrados).
Figura 4. El ejemplo de RPE / coroides / esclerótica Complejo plana de montaje en 10 semanas después de la inyección subretiniana de Lentivirus con GFP / RFP Gen (Ampliación: 40X). (A) canal verde para GFP (B) canal rojo para el PP. Barra de escala:. 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. El ejemplo de RPE / coroides / esclerótica Complejo plana-Mount 10 semanas después de la inyección subretiniana de Lentivirus con GFP / RFP Gen (Ampliación: 400X). (A) canal verde para GFP (B) canal rojo para el RFP. Barra de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo de vídeo, describimos la técnica de inyección subretiniana limbo-enfoque en detalle con resultados representativos de RPE / coroides / esclerótica de montaje plana. Esta es una técnica fácil y conveniente para la inyección subretiniana de vectores virales en RPE. La visualización directa de la formación de la ampolla durante la inyección es un paso importante para la entrega exacta para los principiantes. Hay algunas técnicas subretinianas inyección introducidos en Journal of experimentos visualizados 8-10. Espacio subretiniano es el espacio potencial entre la retina y el EPR, por lo tanto, hay dos rutas posibles de abordar el espacio subretiniano. Uno de ellos es un enfoque interior hacia el espacio subretiniano a través de vítreo y la retina y el otro es un enfoque exterior a través de RPE y la esclerótica. Esta técnica de inyección subretiniana limbo-enfoque es la anterior a través del espacio intravítrea y la retina. Esta técnica tiene la ventaja de proporcionar más formación de ampolla posterior en comparación con el último debido a este último unaENFOQUE hace una ampolla desde el lado periférico a través de un túnel escleral o incisión, lo que se debe hacer sobre la retina periférica. Además, simple punción del limbo es más fácil que un túnel escleral sin penetración de la retina. Para los ratones recién nacidos, sin embargo, sería más apropiado utilizar el enfoque fuera 9. Debido a que el globo ocular del ratón neonatal es muy pequeño y lleno de la lente, la técnica del limbo-enfoque puede causar la formación de cataratas no deseado o incluso bulbi tisis.
Hay algunos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la punción inicial debe ser lugar ligeramente posterior al limbo porque punción demasiado anterior a la córnea hace iris encarcelamiento, o punción demasiado posterior hace agujero directa en la retina periférica. En segundo lugar, se recomienda tener cuidado para evitar golpear a la lente con la aguja al hacer la punción inicial. Es mejor no para insertar todo el bisel de la aguja para evitar la punción de la lente. En tercer lugar, la best ángulo de aproximación de la aguja es de aproximadamente 45 grados contra plano del iris, y la aguja roma debe ser empujado posteriormente hacia el área peripapilar. Finalmente, la aguja debe ser colocado en el espacio subretiniano durante la inyección, lo que resulta en formaciones de ampollas uniformes, de lo contrario la aguja desplazada provoca la inyección intravítrea.
El ojo es un órgano pequeño con características únicas que lo convierten en un objetivo atractivo para la terapia génica 11. Específicamente, es un compartimiento cerrado con pequeñas-privilegio inmune que permite que la terapia génica con una toxicidad relativamente baja y las reacciones inmunes en el ojo y efectos sistémicos adversos. Visualización Fácil y fácil accesibilidad a los enfoques quirúrgicos son otras ventajas de la ojo para la terapia génica. La retina tiene una estructura laminar altamente organizada con 10 capas distintas. Por lo tanto, precisa la entrega de genes espacial sólo puede lograrse mediante los métodos apropiados de inyección intraocular. Los dos métodos más comunes para intrentrega aocular de vectores virales son la inyección intravítrea e inyección subretiniana 6. En general, la inyección intravítrea es la ruta preferida para la retina interna atacar a las células ganglionares de la retina y las células de Müller. Inyección subretiniana es la ruta preferida para la retina externa atacar a las células fotorreceptoras y las células del EPR. Para una transducción eficiente en RPE, es necesario para entregar vectores virales subretinally a pesar de la potencial de daño a la retina.
En este estudio, hemos utilizado vectores LV con las buenas prácticas agrarias y RFP para la visualización. Debido a que los vectores virales tienen tropismo por tipos de células específicos de la retina, los vectores virales deben ser elegido de acuerdo con tropismo de AAV, LV, y Ad 5 a las células objetivo. Por ejemplo, AAV2 / 2, AAV2 / 6 y AAV2 / 8 son la eficiencia de transducción más alta a las células RGC y Müller. AAV2 / 5, 2/7, 2/8 y 2/9 transducen eficazmente células fotorreceptoras y RPE con AAV2 / 8 siendo el serotipo más eficiente en ratones 5,12 5. Para los vectores LV, hay un alto nivel de expresión en las células RPE después de las inyecciones subretinianas, pero poca o ninguna expresión después de las inyecciones intravítreas 13.
Para la entrega de genes eficaz de RPE, promotores virales deben ser también considerados. Los promotores virales, tales como citomegalovirus (CMV), el promotor quimérico y pollo beta-actina / CMV promotor potenciador son promotores fuertes y ubicuos, por lo tanto, se utilizan en la mayoría de los estudios de terapia génica. En RPE, el promotor CMV se estima para expresar diez veces tanta proteína en comparación con el promotor RPE65 14. De importancia, la combinación óptima del promotor y vectores virales incluyendo serotipo debe lograrse para obtener mejores resultados como se demuestra por la expresión superior del RPE65 cuando el promotor humano RPE65 se empaquetan en serotipo rAAV2 / 4 de rAAV2 / 2 15. Centrándonos en la entrega de genes a las células del EPR, RPE-sppromotores ecific como el RPE65 o el promotor VMD2 reduce la seguridad fuera del objetivo emite 16.
AMD es una enfermedad compleja que tiene dos fases con una fase degenerativa que se refiere como AMD seca y una fase caracterizada por neovascularización coroidea se refiere como la AMD húmeda. Además, AMD es una enfermedad en la que numerosas susceptibilidades genéticas incluyendo el factor H del complemento (CFH), complementan C3, complementan el factor I (CFI), relacionada con la edad maculopatía susceptibilidad 2 (ARMS2) y ApoE se combinan con factores de riesgo ambiental 17. Debido a la naturaleza compleja de los factores de riesgo genéticos en AMD, no hay ningún gen candidato único para su terapia génica. Por lo tanto, la terapia génica actual en AMD se centra en la transferencia de genes para expresar proteínas antiangiogénicos dirigidos neovascularización coroidea en la DMAE húmeda 18. No hay todavía gen candidato para el tratamiento de la AMD seca con una terapia génica. Recientemente, hemos sugerido que la acumulación de beta amiloide intracelular podríaestar relacionada con secar características AMD en ratones transgénicos 19. Además, el beta amiloide subretinally inyectada fue tomada por RPE en ratones (datos no publicados). Podemos escindir beta amiloide intracelular con proteasa viral 20. Por lo tanto, hemos estudiado aún más la terapia génica en la DMAE seca con objetivos potenciales.
En conclusión, la terapia génica en la enfermedad ocular es más prometedor que en cualquier otro órgano. Además, la inyección subretiniana es una técnica fundamental para la terapia génica en enfermedades de la retina, especialmente en relación con las células fotorreceptoras y RPE. Por lo tanto, esperamos que esta técnica se hace más ampliamente utilizado y puede contribuir al avance de la terapia génica no sólo en monogénica heredó retinopatía, sino también en la degeneración macular relacionada con la edad.
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Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Universidad Nacional de Seúl Beca de Investigación (800-20140542), el Programa de Investigación de Pioneer NRF / MEST (2012-0009544), y el Programa de Bio-Signal Analysis Innovación Tecnológica de la NRF / MEST (2009-0090895), y la concesión de NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
References
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