Summary
La stimolazione del nervo vago (VNS) è emerso come uno strumento per indurre mirato plasticità sinaptica nel proencefalo di modificare una serie di comportamenti. Questo protocollo descrive come implementare VNS per facilitare il consolidamento della memoria paura dell'estinzione.
Introduction
Classica paura condizionata fornisce un modello animale ampiamente usato per studiare le basi biologiche dei disturbi d'ansia. Durante la paura condizionata, uno stimolo avversivo (lo stimolo incondizionato, US, ad esempio, un footshock) è presentato in combinazione con uno stimolo neutro, quale un tono e / o di un contesto (stimolo condizionato; CS). Durante la paura condizionata, si formano associazioni tra il CS e gli Stati Uniti. Alla fine la presentazione del CS sola provoca una risposta di paura (la risposta condizionata; CR). In timore estinzione, la CS è presentato ripetutamente in assenza degli Stati Uniti, causando il CR a diminuire gradualmente 1. Così, l'estinzione della paura condizionata è un processo attivo in cui le risposte comportamentali a stimoli paurosi neutri vengono attenuate quando si prevedono più esiti avversi. Estinzione di risposte condizionate richiede il consolidamento di nuovi ricordi che competono con le associazioni apprese. Un tratto distintivo di disturbi d'ansia è impaestinzione ired 2-4. Così, l'estinzione della paura condizionata in modelli animali costituisce un paradigma importante sia per l'apprendimento inibitorio e come modello di terapia comportamentale per i disturbi d'ansia umani 5,6.
Perché vi sia una stretta corrispondenza tra la paura e l'ansia umana, si pensa che questi studi possono fornire informazioni sulla natura biologica dei disturbi d'ansia legati come il disturbo da stress post-traumatico e contribuiranno a sviluppare strategie per il trattamento di loro. Un importante obiettivo di ricerca preclinica è quello di aiutare l'apprendimento estinzione e di indurre la plasticità mirato nei circuiti di estinzione a consolidare l'apprendimento estinzione. Stimolazione del nervo vago (VNS) è un approccio neuroprosthetic minimamente invasiva che potrebbe essere utilizzato per fornire stretto modulazione temporale e specifico circuito di aree cerebrali e sinapsi impegnati in un compito permanente. Una serie di studi recenti del gruppo di Michael Kilgard presso l'Università del Texas a Dallas averedimostrato che l'abbinamento VNS con stimoli sensoriali o motorie discreti (per esempio, un tono o un pull leva) è altamente efficace nel promuovere la plasticità corticale per trattare il tinnito 7, o per superare i deficit motori dopo l'ictus 8-10. Inoltre, non contingente VNS che avviene all'interno di una breve finestra temporale dopo l'apprendimento promuove simile plasticità corticale e migliora consolidamento della memoria nei ratti e negli esseri umani 11-13.
Considerando il ruolo del nervo vago nel percorso parasimpatico, non è sorprendente che poteva partecipare nella modulazione memorie e la plasticità sinaptica. Altamente eventi emotivi tendono a produrre memorie più forte di memorie non-emozionali. Ciò è probabilmente dovuto all'influenza degli ormoni dello stress sul consolidamento della memoria. Posttraining somministrazione di adrenalina ormone dello stress aumenta il consolidamento della memoria in animali umani e non umani, ma l'adrenalina non attraversa la barriera emato-cerebrale-barriera 14, 15 16 hanno trovato che la somministrazione sistemica di adrenalina è aumentata vagale cottura dei nervi, e aumento dei livelli di noradrenalina nell'amigdala 17. La somministrazione sistemica di adrenalina non aumenta il consolidamento della memoria quando i recettori β-adrenergici sono bloccate nell'amigdala 18 suggerendo che il nervo vago ha un ruolo nel percorso che trasforma le esperienze emotivamente suscitando in memoria a lungo termine.
Così, l'associazione SNV con la formazione ha il potenziale per migliorare i cambiamenti del cervello che supportano il consolidamento della memoria e l'esposizione ai segnali condizionati in assenza del rinforzo migliora il consolidamento dell'apprendimento estinzione in ratti 19,20. Qui si descrive l'uso di un VNSstrumento sa per promuovere la plasticità corticale e facilitare l'estinzione di una risposta di paura condizionata.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato istituzionale di L'Università del Texas a Dallas.
1. Costruzione di VNS polsini
- Creare uno strumento di perforazione per segare la punta di un ago 22 G ½.
- Eseguire la fine ormai smussata del 22 ½ G ago su un file di metallo più volte per appiattirla. Tenere l'ago con un angolo di 45 ° per il file ed eseguirlo più volte il file mentre ruotandola. Questo farà sì che il metallo a diventare più sottile e furl verso l'interno. ATTENZIONE: inserire la punta del bisturi nell'estremità tagliata dell'ago e ruotare con una certa forza verso il basso a spiegare il metallo.
- Utilizzare binocolo ingrandimento per i passaggi rimanenti nella sezione 1.
- Usando un bisturi (10 o 15 lame) tagliato 4 segmenti mm di tubo.
- Inserire un Segmento 4 mm su unapiccola punta o un altro strumento di forma simile. Questo per tenere il tubo in posizione mentre viene manipolato.
- Praticare 4 fori nel tubo (Figura 1A). I fori dovrebbero rendere i quattro punti di 2 mm di 2 mm quadrati e devono essere pulite e senza spigoli.
NOTA: Lo strumento di perforazione deve essere riaffilata (passo 1,2) ogni 2 o 3 fori. Difficoltà con questo passo è quasi certamente dovuto ad un utensile di perforazione che non è abbastanza affilato. - Con il tubo ancora sulla punta, utilizzare un bisturi per tagliare il tubo longitudinalmente tra i fori in modo che due fori di estremità su entrambi i lati del taglio (Figura 1B).
- Usando un ago da cucito e filo di sutura, sutura passare attraverso i fori per creare il sartiame per il collocamento finale del bracciale intorno al nervo vago. Iniziare con l'ago all'interno del bracciale e farla passare attraverso uno dei fori, per poi tornare attraverso il foro adiacente dall'esterno (Figura 1C). Legare il Filettod insieme ~ 2 cm dalla plastica in modo che il tubo e filo fanno un triangolo. Lasciare ~ 8 centimetri di filo dopo il nodo e tagliare. Ripetere il processo per i fori sul lato opposto del taglio. Il tubo è ora pronto per essere cablato.
- Preparare i fili per i polsini.
- Tagliare filo platino iridio in 70 segmenti mm.
- Utilizzando la punta migliore per la torcia gioielli, creare un forte fiamma blu centro che sia il più raffinato possibile e usarlo per togliere ~ 1 cm di rivestimento di plastica dal filo. Applicare il blu centro della fiamma al fine spelata del cavo per creare una pallina. Applicare il blu centro della fiamma a vari punti della parte spelata di fondere le sette trefoli insieme. Apparirà il filo di queste macchie a piegare.
- Sul lato opposto del filo, applicare il blu centro della fiamma al fine di creare una pallina. Minimizzare nudo la plastica in questo fine.
- Cablare il bracciale (Figura 1D).
NOTA: Steps al punto 1.10 deve essere fatto sotto un binocolo di ingrandimento.- Nastro il manichetta utilizzando i fili in modo che è orientato con il taglio corre orizzontalmente. Tirare i fili stretto in modo che il bracciale sia aprì e poi nastro adesivo lungo i fili.
- Afferrare l'estremità appallottolato del lato spellata del filo preparato con # 5 pinze e spingere attraverso il foro in basso a destra. Estrarre la pinza dal foro, lasciando l'estremità del filo nel mezzo del bracciale.
- Re-afferrare l'estremità appallottolata del filo spelato (ora al centro del bracciale) e spingerlo attraverso il foro superiore destra. Estrarre la pinza dal foro, lasciando il filo passato completamente attraverso il bracciale e sciolto sul lato superiore del gambetto.
- Re-afferrare l'estremità appallottolata del filo spelato (ora fuori del bracciale sul lato superiore) e spingerlo indietro attraverso il foro superiore destra dall'interno. Continuare a farlo finché il filo è saldamente in posizione: Test tirando sull'estremità opposta del filo.
NOTA:Durante questo processo è fondamentale per differenziare le porzioni spelati / isolati del filo. Il filo che è posizionato in definitiva nel 'trogolo' del bracciale deve essere denudato, ma tutto sotto i fori inferiori (fuori il bracciale sull'estremità inferiore) deve essere isolato. Questo garantisce la consegna di corrente solo al nervo vago. - Afferrare l'estremità appallottolata del lato isolante e spingerlo attraverso il foro in basso a destra dall'interno del bracciale, avvolgendolo intorno volta.
- Ripetere i punti 1.10.2 - 1.10.5 sul lato sinistro del bracciale in modo che due fili finiscono fissato al tubo, una sul lato destro ed una sul lato sinistro.
- Inserire una spilla d'oro nel braccio della mano con il foro rivolto verso l'alto. Riempire il buco con il flusso.
- Saldare l'estremità isolata del filo (ormai attaccato al bracciale) nel perno.
- Lasciare che la saldatura raffreddare, e poi sciogliersi nuovamente. Questo garantisce un buon collegamento tra l'estremità del filo e la iabitacolo del perno. Applicare più saldatura, se necessario. Ripetere l'operazione per il secondo filo.
- Con i cavi in esecuzione sulla destra, contrassegnare la parte superiore del bracciale con pennarello indelebile. Contrassegnare anche il perno oro collegato all'elettrocatetere superiore.
2. Costruzione di Cuffia per VNS sito Input
- Tagliare 30 millimetri segmenti di filo di rame 26 AWG. Striscia una piccola porzione su ciascuna estremità.
- Tagliare la parte più stretta via pin dorati sciolti e saldare l'estremità spellata del filo fino alla fine taglio della spilla d'oro. Creare due composti filo / pin per ogni sito di ingresso desiderata. Inserire un connettore nelle mani aiutare e saldare l'estremità del cavo di un composto fili / pin a ciascuno dei due denti flussati del connettore (figura 2G).
- Mark uno dei fili con pennarello. Durante l'intervento, posizionare l'impianto con la rostrale conduttore contrassegnato al filo marcato.
3. VNS Chirurgia
- Creare strumenti di vetro su misura per la gestione di vagus nervi durante l'intervento chirurgico.
- Utilizzare vetro borosilicato per tirare una micropipetta in modo che abbia una punta affusolata lunga. Se nessun estrattore pipetta è disponibile, rompere il vetro per creare un bordo più lungo.
- Tenere l'estremità non rastremata della pipetta con un panno spesso (per evitare ustioni) e premere il rastremata / fine spezzata in una superficie resistente al fuoco liscio durante l'applicazione della fiamma blu dalla torcia gioielli alla fine conica. Il vetro si piegherà come viene premuto sulla superficie. Applicare fiamma fino a un gancio o forme di forma J.
- Procedure chirurgiche VNS
- Raccogliere e sterilizzare tutti gli strumenti. Preparare una sanitario, area chirurgica riscaldata.
- Anestetizzare animale con ketamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Valutare la profondità del piano anestetico monitorando vocalizzazioni degli animali e di astinenza-riflessi in risposta ai piedi e / o coda pizzicare.
- Shave parte superiore della testa e lato sinistro del collo dell'animale. Proteggere gli occhi dell'animale con minatoreAl olio o pomata occhio. Applicare la soluzione di iodio detergente con garza e poi alcool con garza per le zone rasate. Ripetere una volta.
- Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea sulla sommità della testa e consentire il bolo disperdere pur ponendo l'animale nello strumento stereotassico.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione nella pelle sul cranio per esporre sia lambda e bregma. Preparare un percorso per il bracciale utilizzando pinze smussate a tunnel sottocutanea dal sito di incisione lungo il lato sinistro di fronte l'orecchio sul lato sinistro del collo.
- Tirare il sito di incisione aperta con emostasi. Utilizzando tamponi di cotone, applicare il perossido di idrogeno al cranio esposto per rimuovere eventuali residui di tessuto.
- Usando un bisturi, praticare due fori iniziali poco profondi nel cranio di inserire viti di ancoraggio. Essi devono essere collocati una distanza sufficiente per lasciare spazio per l'impianto, ma non troppo vicino al tessuto circostante. Evitare di posizionare le viti direttamente sulla linea mediana.
- Con forzaps e cacciavite, guidare una vite ossea in entrambi i fori. Le viti devono essere a tenuta nei fori, con i tappi 2 - 3 mm dalla superficie del cranio per lasciare spazio per acrilico compilare sotto e intorno le viti.
- Riempire lo spazio sotto, intorno, e tra le viti con una piccola quantità di acrilico, evitando il tessuto circostante. Poi posto una maggiore quantità di acrilico in mezzo al cranio tra le due viti.
- Afferra l'impianto in modo che il filo segnato è orientata rostrale al filo non marcato e posizionare rapidamente l'impianto in acrilico, facendo attenzione a non entrare in acrilico nei perni oro, l'area chiusura, o il sito di ingresso sulla parte superiore. Una volta posizionato permette di impostare ~ 5 minuti fino a secco. Questo può anche essere eseguita utilizzando il braccio della stereotassico per il supporto. Riempire eventuali crepe o fessure tra l'impianto e il cranio con una miscela a bassa viscosità di acrilico. Lasciare asciugare.
- Utilizzare binocolo ingrandimento per i passaggi rimanenti nella sezione 3.2.
- Rimuovere the animale dallo strumento stereotassico. Posto l'animale sul lato destro, ruotando leggermente verso la posizione ventrale.
- Fai una piccola incisione di circa sopra la vena giugulare sinistra. L'osso della mascella e clavicola dovrebbero essere equidistante al sito di incisione. Ampliare l'incisione mediante dissezione smussata fino a raggiungere lo strato muscolare. I Sternocleidomasioideo, sterno-ioideo e omoioideo muscoli dovrebbero essere visibili. Utilizzare divaricatori muscolari per mantenere il sito aperto.
- Proseguire dissezione smussato lungo i solchi naturali tra i muscoli. Cercare la pulsazione della carotide. Rubrica attraverso il muscolo verso il pulsare rivelerà la carotide. Tirate i muscoli della schiena con il divaricatore muscolo. La guaina contenente carotide contiene anche il nervo vago. Smussare attenzione sezionare la guaina con le forbici.
- Identificare il nervo vago. E 'il nervo più grande nella guaina carotidea e di solito è al lato sinistro dell'animale dell'arteriama si possono trovare su qualsiasi lato. Passare agli strumenti di vetro personalizzati e separare il nervo vago dalla carotide. Il nervo deve essere esente da qualsiasi altro tessuto per almeno 5 mm.
- Dall'incisione sulla testa, utilizzando i filetti sul lato della cuffia opposta i cavi, tirare il bracciale attraverso il tunnel sottocutaneo precedenza tramite una pinza o piccoli emostatiche. Spingerlo attraverso il tessuto nel sito di incisione sul collo.
- Sollevare delicatamente il nervo usando gli strumenti di vetro e spingere i fili sul lato della cuffia opposta conduttori sotto il nervo. Tirare i fili tutto il percorso attraverso, facendo attenzione a non sfregare contro il nervo. Il bracciale deve essere immediatamente adiacente al nervo.
- Assicurarsi che il bracciale è orientato con il 'top' lato contrassegnato superiore. Eliminare il nervo al centro del bracciale. Il nervo dovrebbe trovarsi attraverso entrambi i fili nel trogolo del bracciale (Figura 2B). Legare i fili insieme per chiudere il bracciale.
- Sul headcap, collegare i perni fissati al bracciale nei perni oro sul sito di ingresso stimolazione. Inserire il piedino contrassegnato nel perno oro attaccato al dente più anteriore sul posto ingresso simulazione.
- Per verificare che il bracciale correttamente stimola il nervo vago, effettuare una cessazione di respirazione test, collegando lo stimolatore al sito di ingresso stimolazione sulla paletta e esecuzione stimolazione (0,2 mA, 60 Hz, fino a 10 secondi). La respirazione deve fermarsi brevemente e la frequenza cardiaca dovrebbe cadere, verificando funzione polsino.
- Fissare i perni sul sito di ingresso stimolazione con acrilico. Coprire i fili e verificare che pin e cavi esposti non portano a cortocircuiti. Utilizzare acrilico per appianare eventuali urti o per colmare le eventuali lacune. Lasciare asciugare.
- Sutura chiuso entrambi i siti di incisione. Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea nei pressi del sito di incisione collo. Applicare una pomata antibiotica a INCISIONE siti. Facoltativamente, lasciare un connettore maschio in luogo sul posto ingresso stimolazioneevitare danni o ostruzioni durante il processo di guarigione.
- Trattare con antibiotico e seguire le cure post-operatorie standard compreso adeguata analgesia. Animali Ritorno a struttura alloggiativa animale dopo che riprendano la mobilità. Lasciare 5 giorni per il recupero. Per garantire la massima durata e la funzione del headcap, animali casa singolarmente per il resto dell'esperimento.
NOTA: ratti Sham-VNS subiscono lo stesso intervento, ma il circuito è progettato per short a livello della headcap (cioè, un headcap è impiantato ed il nervo vago è separato dalla carotide, ma senza polsino elettrodo viene posto intorno nervi).
4. uditiva paura condizionata
NOTA: Questo protocollo condizionata paura è più intenso rispetto alla maggior parte 21 perché l'obiettivo di questi esperimenti è quello di migliorare l'estinzione. Con lieve condizionamento alla paura che può essere facilmente spenta, un effetto pavimento può oscurare questo miglioramento.
- Seguire le presentazioni toni iniziali con 8 tono footshock (1 sec, 0,5 mA) abbinamenti su ciascuno dei 2 giorni consecutivi. Ripetere gli abbinamenti tono footshock il secondo giorno. Variare l'inter-stimolo intervallo (ISI) tra 2 e 4 minuti, con una media di 3 minuti per ogni prova. Randomize il punto in cui l'ammortizzatore si verifica durante il tono.
- Inserire i ratti nella stimolatore inserendo i connettori maschio dal stimulator nel sito di ingresso stimolazione. Posizionare animali nella camera (Figura 2A, 2C). Impostare lo stimolatore a 0,4 mA, 500 ms larghezza di impulso a 30 Hz. Impostare stimolazione per una durata totale di 30.15 sec, partendo 150 msec prima dell'inizio del tono. Gioca animali 4 toni (come al punto 4.6) e associare ogni presentazione tono con VNS o Sham VNS.
- Inserire l'animale come normale e dividere l'uscita dallo stimolatore all'oscilloscopio.
- Impostare l'intervallo sull'oscilloscopio -20 V a +20 V ed eseguire la stimolazione. La forma d'onda della stimolazione 30 Hz deve essere visibile sull'oscilloscopio. Stimolazioni superiore a 10 V in formato indicano alta impedenza e una cuffia non funziona correttamente o il collegamento al sito di ingresso stimolazione.
5. In Vivo registrazioni di Evocati campo Potenziali
Nota: Questo passaggio è facoltativo. Potenziali di campo evocati (EFP) sono registrate 24 ore dopo che i test di ripristino (5 ° giorno) in ratti anestetizzati isoflurano-montati in un apparato stereotassico, seguendo le procedure standard 23,24.
- Raccogliere e sterilizzare tutti gli strumenti.
- Indurre anestesia con isoflurano (5% in 100% di ossigeno, portata 1l / min) in una camera di plastica trasparente. Valutare la profondità del piano anestetico monitorando vocalizzazioni degli animali e di astinenza-riflessi in risposta ai piedi e / o coda pizzicare. Usare olio minerale o pomata oculare per proteggere gli occhi.
- Iniettare 0,05 ml Marcaine sottocutanea sulla sommità della testa e consentire il bolo di disperdersi. Utilizzare un bisturi e pinze emostatiche per rimuovere il headcap dal cranio. Utilizzare come poca forza possibile per evitare oscurando bregma.
- Posto l'animale nello strumento stereotassico. Utilizzare un bisturi per ampliare l'incisione per esporre sia lambda e bregma. Mantenere aereo anestesia con isoflurano (3% in ossigeno al 100%, portata 1 L / min) con un musetto.
- Praticare dei fori nel cranio sopra la corteccia prefrontale infralimbica (IL) e l'amigdala basolaterale (BLA). Inferiore A microelettrodi vetro (2M KCl; 1-2 MOhm resistenza) nella BLA (D / V: 7.2, A / P: 2.7, M / L: 4.9 da bregma) e stimoione elettrodo nella regione IL della corteccia prefrontale mediale (D / V: 4.6, A / P: 3.0, M / L: 0.7 da bregma) (Figura 4A).
- Stimolare la IL a evocare EFP nella BLA. I dati mostrati in figura 4 è stata acquisita con le seguenti impostazioni: Un impulso di stimolazione di 0,3 msec durata, utilizzando una intensità di stimolazione che corrispondeva al 40% dell'intensità minima corrente che evoca una risposta massima del campo (sulla base di una curva di input-output determinato prima raccolta dei dati di base), consegnato ogni 15 secondi.
- Raccogliere dati di base per un minimo di 10 - 15 minuti prima di indurre la plasticità sinaptica.
NOTA: Il protocollo utilizzato per evocare la plasticità sinaptica varierà con le esigenze degli esperimenti e devono essere attentamente selezionati da ciascuno sperimentatore. I dati in figura 4C mostra cambiamenti nel EFP seguente 3 raffiche di 100 impulsi a 50 Hz (2 sec), con intervalli tra loro scoppiare 20 sec alla intensità minima corrente che evocanod la risposta massima del campo. - Misurare l'ampiezza della EFP come differenza tra la media di una finestra msec 5 prima del manufatto stimolazione e la media di una finestra 5 msec intorno 20 - 25 msec dopo l'artefatto stimolazione, corrispondente al picco negativo del potenziale di campo. Normalizzare i dati al basale e impostare la media di un 10 min basale come 100%. Utilizzare le ampiezze EFP medi di un altro periodo di 10 minuti dopo l'induzione della plasticità (ad esempio, 40 - 50 min dopo induzione) per valutare i cambiamenti a lungo termine nel EFP ampiezza.
- Dopo la fine della registrazione decapitarlo l'animale anestetizzato ed estrarre il cervello. Preparare il tessuto per la verifica istologica di posizionamento degli elettrodi.
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Representative Results
Questa sezione illustra esempi di risultati ottenibili utilizzando SNV in combinazione con l'apprendimento estinzione per ridurre l'espressione della risposta di paura condizionata in ratti. Per giorni 1 e 2 (Auditory paura condizionata), ratti sono stati addestrati su un compito condizionamento alla paura uditivo in cui footshocks sono stati associati con un tono. Il giorno 3 (Pre trattamento Test), i toni sono stati presentati, in assenza di footshocks per misurare i livelli di congelamento e dedurre la paura condizionata acquisizione risposta. Il giorno 4 (di trattamento) ratti hanno ricevuto una formazione specifica per l'estinzione di gruppo e di trattamento: 4 presentazioni di tono sono stati associati sia con VNS o sham-stimolazione o, nel gruppo di estinzione esteso, presentazioni 20 tono con sham-stimolazione. Livelli di congelamento sono stati testati nuovamente il giorno 5 in risposta a 4 presentazioni del solo CS (test post trattamento) (diario cf nella Figura 3A). Gli animali che hanno ricevuto un numero limitato (4) delle esposizioni non rinforzata per la cotono nditioned durante la fase di estinzione mostrano solo una piccola riduzione nella paura condizionato il successivo giorno ripristino (Figura 3B). Al contrario, i ratti trattati con VNS dimostrano una significativa riduzione congelamento dopo una singola sessione di formazione estinzione (Figura 3B). L'importo della riduzione della risposta di paura condizionata di animali VNS trattati è paragonabile a quella osservata negli animali sham trattati che hanno ricevuto 5 volte la quantità di esposizioni non rinforzata (20 toni) durante l'estinzione formazione (gruppo EE nella Figura 3B). Con le procedure specifiche sperimentale di cui sopra, VNS può anche facilitare l'estinzione al contesto. Come mostrato in Figura 3C, animali VNS anche mostrato ridotta comportamento di blocco fuori della presentazione del tono condizionata, suggerendo che la formazione di estinzione anche generalizzato al contesto. Mostriamo anche che l'associazione VNS con formazione estinzione altera il metaplasticity nel betwe percorsoen corteccia infralimbica (IL) e basolaterale (BLA) in animali anestetizzati (Figura 4). Negli animali, di paura condizionata che non hanno subito la formazione di estinzione, la stimolazione breve raffica (HFS) del LTD IL indotta di campo locale evocato nel BLA (Figura 4). Se sono stati dati formazione estinzione estesa o VNS durante una singola sessione di estinzione, questa depressione sinaptica è stata invertita in animali che presentano significative estinzione della paura condizionata; Tuttavia, la somministrazione di SNV durante estinzione promosso induzione di LTP mentre gli animali del gruppo di estinzione estesa mostrato alcun cambiamento in risposta a HFS. Questo risultato è stato anche osservato in animali che sono stati sham-stimolati nel gruppo di estinzione a quattro toni. È importante sottolineare che, VNS modificato solo la plasticità nel percorso tra l'IL e il BLA quando ci è stato consegnato in un contesto di estinzione. Al contrario, VNS consegnato agli animali non addestrati nelle loro gabbie a casa ha avuto alcun effetto sulla synaptic plasticità nella via IL-BLA (Figura 4B).
Figura 1. Costruzione di Vagus polsini nervose. (A) Posizionamento del pezzo 4 mm tubo sulla punta per la stabilità, che mostra l'uso di un ago modificato per forare la tubazione. (B) fori sono stati realizzati nel tubi, e il tubo è stato tagliato a metà. (C) Posizionamento del filo di sutura attraverso i fori del bracciale. Si noti che il filo passa oltre il bordo del bracciale. (D) Inserimento dei fili di platino iridio al bracciale. Principali spettacoli completato il cablaggio, inferiore mostra il cablaggio in corso. (E, F) Il bracciale completato con i perni oro fissati all'estremità dei fili. Vedi inserire nella (F) per la scala. (G) Mostra il corresponding piece headcap che viene collegato al cranio durante l'intervento di cui al punto 3. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. stimolazione del nervo vago e set-up sperimentale. (A) Schema del set-up utilizzato per la stimolazione del nervo vago (VNS). Gli animali sono collegati ad una unità di isolamento stimolazione tramite un headcap da cui 2 fili di platino Iridum portano via sottocutanea al bracciale elettrodo misura che è avvolto intorno al nervo vago. (B) Posizionamento del bracciale elettrodo intorno al nervo vago. Photomicrograph di incisione chirurgica e il nervo vago esposta prima l'elettrodo bracciale si sutura intorno ad esso. (C) Fotografia della configurazione utilizzata peruditivo condizionamento alla paura, con l'animale collegata allo stimolatore. (Figura modificata da riferimento 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. VNS migliora estinzione della uditiva condizionamento alla paura. (A) temporale sperimentale. Giorni 1 e 2: Auditory paura condizionata, 8 tono (CS) / abbinamenti shock (US) al giorno. 3 ° giorno: condizionata Paura test Pre, congelamento misurato durante 4 presentazioni di tono spaiati. 4 ° giorno: trattamento, 3 gruppi: 4 presentazioni di tono in coppia con VNS, 4 presentazioni di tono in coppia con sham-stimolazione, presentazioni 20 toni in coppia con sham-stimolazione (EE). 5 ° giorno: condizionata Paura test Post, congelamento misurata durante 4 presentazioni di tono spaiati (B). (C) Percentuale di tempo trascorso il congelamento durante gli intervalli tra toni (ITI) Il giorno 3 (D3, barre bianche ) e 5 ° giorno (D5) per gli stessi gruppi mostrati in animali B. VNS anche mostrato una riduzione comportamento di blocco fuori della presentazione del tono condizionata. (* P <0.05, barre di errore rappresentano errore standard della media). (Figura modificata da riferimento 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. VNS altera metaplasticity nel percorso di IL-BLA. (A) stimolazione Rappresentante e siti di registrazione nella IL e BLA e tracce rappresentative di una curva input-output di potenziali di campo registrati nel BLA dopo stimolazione dell'IL. (B ) la plasticità sinaptica nel pathway di IL-BLA in risposta alla stimolazione raffica breve in 4 gruppi di ratti. In alto a destra: Nel ratto-paura condizionata breve stimolazione scoppio della IL induce LTD in BLA. Medio sinistra: ratti che hanno ricevuto formazione estinzione 4 tono con la stimolazione simulata mostrano anche LTD. Basso a sinistra: i topi che hanno ricevuto una formazione estinzione estesa con stimolazione simulata mostrano alcun cambiamento, o di un recupero della srl che è stato indotto nel timore condizionata unico gruppo e il gruppo stimolazione sham. Destra Medio: in ratti trattati con VNS durante una singola extsessione inction, forza sinaptica viene ulteriormente potenziato, che porta a LTP. In basso a destra: VNS consegnato nella gabbia di casa provoca alcun cambiamento nella plasticità. Abbreviazioni: IL, corteccia infralimbica; PL, corteccia prelimbic; BLA, nucleo basolaterale dell'amigdala, LA, il nucleo laterale dell'amigdala; CE, nucleo centrale dell'amigdala. (* P <0.05, barre di errore rappresentano errore standard della media). (Figura modificata da riferimento 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Schema semplificato della innervazione tronco cerebrale dal nervo vago e il secondo o superiori proiezioni di ordine. Attraverso la sua modulazione indiretta dei nuclei delle monoamine nel tronco cerebrale, tra cui il locus coeruleus (LC) e il nucle rafei (DRN), il nervo vago possono modulare componenti importanti del circuito di estinzione, tra cui la corteccia prefrontale (PFC), l'amigdala (AmyG), l'ippocampo (Hipp) e il nucleo accumbens (NAC). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo qui un protocollo utilizzato per facilitare l'estinzione della paura condizionata durante una singola sessione di esposizione a stimoli condizionata 19 e per modulare la plasticità nel percorso tra la corteccia infralimbica e basolaterale che possono mediare estinzione apprendimento 20. Un passo cruciale per il successo di questo protocollo è la corretta consegna dei VNS durante l'allenamento estinzione. Pertanto, particolare attenzione deve essere data alla costruzione degli elettrodi gemelli e il posizionamento del bracciale intorno al nervo vago. Nel processo di costruzione dell'elettrodo bracciale è importante garantire che la parte esposta dei fili sono nel posto giusto. Analogamente, durante l'intervento, particolari sforzi dovrebbero essere fatti per posizionare il bracciale in posizione corretta e ancorarlo sufficientemente posto in modo che il circuito tra il gambetto e lo stimolatore rimane intatto nel corso dell'esperimento. Il corretto funzionamento del bracciale deve be controllato dopo l'intervento chirurgico (come descritto al punto 3.2.20) e di nuovo dopo la prova comportamentale (come indicato al punto 4.8).
I meccanismi attraverso i quali VNS modula l'attività del sistema nervoso centrale non sono pienamente compresi. Il nervo vago cervicale è composto da fibre motorie e sensoriali afferenti efferenti in un rapporto di circa 4 a 1, rispettivamente, 25. Vagale afferenti trasmettono segnali al solitarius nucleo del tratto (NTS), che poi i progetti per parabrachiale nucleo, ipotalamo, talamo, amigdala, ippocampo e 26,27. È importante sottolineare che i nuclei delle monoamine nel tronco encefalico, il locus coeruleus (LC) e nuclei rafe, ricevono proiezioni dirette e / o indirette NTS (Figura 5). Così VNS può modulare la plasticità corticale e memoria tramite l'azione sinergica di più neuromodulatori. Effetti proposti relativi alla stimolazione vagale comprendono alterazione della norepinefrina (NE) rilascio da proiezioni dalle NTS alLC, elevati livelli di GABA inibitorio, e l'inibizione dell'attività corticale aberrante per l'attivazione del sistema reticolare 28,29,30. Ruoli importanti per l'acetilcolina, serotonina e fattore neurotrofico cerebrale hanno anche dimostrato 31-35. Per la modulazione di memorie paura ed estinzione in generale, gli effetti della VNS sul rilascio di trasmettitore nella corteccia prefrontale (PFC), l'amigdala e l'ippocampo sono suscettibili di essere particolarmente rilevante 36,37. VNS acuta aumenta noradrenalina e serotonina rilascio sia mediale PFC 33,38 e l'amigdala 39,30. Acuta VNS aumenta anche i livelli di noradrenalina 38 e migliora la trasmissione sinaptica nell'ippocampo 40-42. Norepinefrina è stato precedentemente dimostrato di essere coinvolti nella modulazione dell'espressione paura. Le lesioni delle proiezioni NE dalla LC per il prosencefalo compromettere l'estinzione di evitamento attivo senza alterare l'acquisizione o il mantenimento del originale apprendimento 43,44. Consolidamento della paura condizionata dipende attivazione β-adrenergico nel BLA 43, e diversi rapporti suggeriscono un ruolo per entrambi i recettori α- e β-adrenergici nel mediale PFC nel consolidamento della memoria sia di droga e di paura estinzione formazione 46-49. Così, quando l'associazione di formazione estinzione con VNS, il rilascio VNS indotta neuromodulatori come NE o 5-HT sembra facilitare la plasticità sinaptica che deriva dalla formazione da solo, portando a una maggiore consolidamento di estinzione.
Un vantaggio importante di SNV risiede nella sua specificità temporale e spaziale. A differenza sistemica o locale di droga, che spesso hanno un inizio lento e offset di azione, VNS può essere selettivamente accoppiato con comportamenti specifici per facilitare la plasticità sinaptica in quelle reti attive che regolano il comportamento di interesse. Descriviamo qui un protocollo VNS che utilizza parametri utilizzato clinicamente per lavornt dell'epilessia nell'uomo (0,4 mA, 500 ms larghezza di impulso a 30 Hz, ciclo di stimolazione di 30 sec acceso e 5 min off). Esperimenti di microdialisi dimostrano che VNS usando questi parametri porta ad una lunga durata, circa 2 volte maggiore di rilascio NE nell'amigdala 39. Questa grande e relativamente lento aumento NE può spiegare perché SNV abbinati formazione estinzione, a differenza di formazione estinzione estesa per sé, anche facilitato l'estinzione di congelamento comportamenti di fuori della presentazione dello stimolo condizionata (l'intervallo tra le prove). Poiché nei nostri esperimenti animali sottoposti formazione estinzione nello stesso contesto come la paura condizionata uditivo, la riduzione di congelamento comportamento durante l'ITI indica che VNS facilitato generalizzazione dell'apprendimento estinzione al contesto.
Tuttavia, nonostante gli effetti potenzialmente lunga durata sul rilascio NE, effetti della VNS sul comportamento o plasticità sinaptica sono solo apparenti quando sono accoppiati wesimo uno specifico comportamento. Applicazione di VNS a ratti nelle loro homecages poco dopo l'allenamento paura estinzione non ha facilitato l'estinzione 20, e allo stesso modo, VNS applicato al di fuori di un contesto comportamentale specifico non ha alterato la plasticità sinaptica nel percorso di IL-BLA (cf Figura 3C). D'altra parte, anche brevi applicazioni di VNS (ad esempio, 0,8 mA come un treno di impulsi 15, 100 msec larghezza di impulso a 30 Hz per 500 msec) causano alterazioni specifiche e duraturi a reti sensoriali o quando sono consegnati contingente con un comportamento in corso.
Un documento seminale dal gruppo di Michael Kilgard 7 ha mostrato che l'abbinamento temporalmente precisa del SNV con la presentazione di un singolo tono conduce alla plasticità nella corteccia uditiva cartina di frequenza di tono. Questi effetti sono già stati utilizzati clinicamente per invertire la plasticità patologica nella corteccia uditiva per trattare il tinnito 50. Allo stesso modo, Ripetuta abbinamento di SNV con un comportamento motorio è stato dimostrato per riorganizzare corteccia motoria 8 e questa plasticità mirato è altamente efficace nel recupero della funzione in diversi modelli animali di ictus 9,10.
Tuttavia, in ritardo VNS consegnato 2 ore dopo allenamenti riabilitativi o più volte grandi quantità di VNS comportato relativamente meno miglioramento di precisione cronometrate VNS 51. Così, gli studi futuri devono ottimizzare sia la sincronizzazione e la quantità di SNV per massimizzare i benefici terapeutici. I nostri risultati mostrano che VNS, che è clinicamente approvato per il trattamento di epilessia e depressione resistente al trattamento multiresistente, potrebbe essere usato come trattamento aggiuntivo alla terapia di esposizione perché modula la plasticità specifico apprendimento per migliorare l'effetto dell'esposizione sulla estinzione paura condizionata rispondere.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | |||
| Atropine | Fisher | A0132-5G | |
| Betadine | Henry Schein | 69066950 | |
| Hydrogen peroxide | CVS | 209478 | |
| Ketamine | Henry Schein | 1129300 | |
| Marcaine | Henry Schein | 6312615 | |
| Mineral Oil | CVS | 152355 | |
| Neosporin | CVS | 629451 | |
| Oxygen | Home Depot | 304179 | |
| Pennicillin | Fisher | PENNA-10MU | |
| Propane | Home Depot | 304182 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4019308 | |
| Tools | |||
| Jewelery Torch | Smith Equipment | 23-1001D | |
| Sewing Needle | Walgreens | 441831 | |
| #5 Forceps (2) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Soldering Iron | Home Depot | 203525863 | |
| AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Circuit Board Boom Stereo Microscope + 144 LED | AmScope | SM-4TX-144A | |
| Helping Hands | A-M Systems | 726200 | |
| Scalpel Blade Holder | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Metal File | Home Depot | 6601 | |
| Ruler | Home Deopt | 202035324 | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 130009-12 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Spatula | Fine Science Tools | ||
| Small Screwdriver | Home Depot | 646507 | |
| Magnetic Fixator Retraction System | Fine Science Tools | 18200-04, 18200-01, 18200-05 | |
| Heating Pad | Walgreens | 30294 | |
| Clippers | Walgreens | 277966 | |
| Sharpie | Staples | 125328 | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Custom Micropipette Glass Tools (J shape and Straight) - Borosilicate glass | Sutter Instrument | B150-110-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Cuffs | |||
| Tubing | Braintree Scientific Inc | MRE-065 | |
| Platinum Iridium Wire | Medwire | 10IR9/49T | |
| Gold Pins | Mill-Max | 1001-0-15-15-30-27-04-0 | |
| Suture Thread | Henry Schein | 100-5797 | |
| 22 G needles | Fisher | 14-815-525 | |
| Paper Tape | Fisher | 03-411-602 | |
| Solder | Home Depot | 327793 | |
| Flux | Home Depot | 300142 | |
| Scalpel Blade, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm OD | Fisher | 508-002 | |
| Headcaps | |||
| Connector Pieces (male) | Omnetics Connector Corporation | A25001-004 | |
| Headcap pieces (female) | Omnetics Connector Corporation | A24001-004 | |
| Teets Dental Acrylic, Liquid and Powder | A-M Systems | 525000, 526000 | |
| 26 Gauge Solid Copper Wire | Staples | 1016882 | |
| Surgery | |||
| Bone Screws | Stoelting+CB33:C61 | 51457 | |
| Scalpel Blades, 10 or 15 | Stoelting | 52173-10 | |
| 1 ml syringes | Fisher | 14-826-261 | |
| 22 G Needles | Fisher | 14-815-525 | |
| 27 G Needles | Fisher | 14-826-48 | |
| 2" x 2" Gauze | Fisher | 22-362-178 | |
| Swabs | Fisher | 19-120-472 | |
| Puppy Pads | PetCo | 1310747 | |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666-A | |
| Chamber and Behavioral Setting | |||
| Husky Metal Front Base Cabinet (30WX19DX34H) | Home Depot | 100607961 | |
| Quiet Barrier HD Soundproofing Material (Sheet) (PSA) | soundproofcow.com | 10203041 | |
| Convoluted Acoustic Foam Panel | soundproofcow.com | 10432400 | |
| Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | A-M Systems | 720000 | |
| Digital Camera - Logitech Webcam C210 | Logitech | B003LVZO88 | |
| MatLab | Mathworks.com | ||
| Sinometer 10 MHz Single Channel Oscilloscope | Sinometer | CQ5010C | |
| OxyLED T-01 DIY Stick-on Anywhere 4-LED Touch Tap Light | OXYLED | B00GD8OKY0 | |
| 5k ohm potentiomter | Alpha Electronics | B00CTWDHIO | |
| Extech 407730 40-to-130-Decibel Digital Sound Level Meter | Extech Instruments | B000EWY67W | |
| DSCK-C Dual Output, scrambled shocker | Kinder Scientific Co |
References
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