Introduction
Depuis son développement dans le milieu des années 1990, le modèle de souris transgénique SOD1 G93A a été le modèle animal le plus largement utilisé de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) 1. Ce modèle de souris transgénique a été génétiquement modifiée pour surexprimer une forme mutante du gène Cu / Zn superoxyde dismutase humaine 1 (SOD1) hébergeant la glycine SLA associé à une mutation alanine à l'acide aminé 93 (G93A). La mutation G93A est une des nombreuses mutations dans le gène SOD1 que le maquillage collectivement environ un cinquième des cas de SLA familiale 2.
Le modèle SOD1 G93A est devenu un cheval de bataille de la recherche de développement de médicaments de la SLA, car en plus de son lien génétique évident pour la SLA, il récapitule la plupart des caractéristiques pathologiques de la SLA chez les humains tels que perte de neurones moteurs, une faiblesse musculaire progressive et l'atrophie, avec éventuelle paralysie et la mort 3. Bien que, comme cela est souvent le cas avec des modèles animaux transgéniques, il est un bi inhérentegique variabilité associée à des souris SOD1 G93A-. Scott et al. ont déterminé que les cohortes d'au moins 24 souris équilibre entre les sexes litière appariés sont nécessaires dans la drogue efficacité plans d'étude en vue de surmonter le bruit créé par la variabilité biologique 4. Le grand nombre d'animaux requis dans ces études en association avec la progression de la maladie agressive et la nécessité d'un suivi quotidien interdit l'utilisation de techniques élaborées, chronophages et potentiellement stressantes pour mesurer la force et la fonction neuromusculaire (par exemple, l'électromyographie, la force de préhension, rotorod , etc.). Au lieu de cela, il met en évidence la nécessité d'un outil de dépistage in vivo qui évalue de façon fiable la fonction neuromusculaire de souris SOD1 G93A-une manière rapide.
Au ALS TDI un protocole a été développé qui permet l'évaluation fiable de la fonction neuromusculaire de souris SOD1 G93A-en moins de 30 secondes par souris en moyenne. Ce protocole de encompasses évaluation quotidienne de la fonction des membres postérieurs en utilisant un système simple neurologique de notation (NeuroScore) qui est décrit dans ce rapport dans la presse et en vidéo. NeuroScore est axé sur la fonction des membres postérieurs, car les déficits des membres postérieurs sont les premiers signalés signe neurologique de la maladie chez les souris SOD1 G93A-5,6. En outre, le protocole développé par ALS TDI fournit une évaluation impartiale de l'apparition de la parésie (paralysie partielle ou légère), la progression et la gravité de la paralysie et il est suffisamment sensible pour identifier les changements induits par les médicaments dans la progression de la maladie.
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Protocol
Toutes les expériences sont menées en conformité avec les protocoles décrits par les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par les soins des animaux et l'utilisation institutionnelle comité de ALS TDI (IACUC).
1. Les animaux, le logement, étude de conception et
Remarque: La colonie de souris SOD1 G93A-été dérivé de la haute copie B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur souche à l'origine produite par Gurney et al 7.. La colonie est actuellement maintenu en traversant transgéniques mâles C57BL / 6-SJL avec des femelles sauvages C57BL / 6-SJL F1. Les animaux de la F1 sont générées en traversant les mâles avec des femelles SJL B6. Les souris sont expédiés à ALS TDI hebdomadaire à 35-45 jours d'âge.
- Laisser souris au moins une semaine pour acclimater à l'animalerie (cycle lumière-12 h / obscurité à une température de 18-23 ° C et 40-60% d'humidité) avant d'attribuer une étude.
- Maison mâle SOD1 G93A microe une souris par cage, puisque le groupe occupe les hommes ont tendance à se battre. Maison souris femelle SOD1 G93A jusqu'à deux par cage. Fournir enrichissement de l'environnement, sous la forme de huttes en plastique. Fournir de la nourriture et de l'eau ad libitum, à moins que les souris font partie d'une étude nécessitant l'administration de médicaments dans l'eau potable / nourriture. Dans ces cas, la ration alimentaire et d'enregistrement et de l'eau.
- Commencer un médicament de l'étude d'efficacité autour du jour de 50 ans et comprendra 64 souris équilibre entre les sexes litière appariés (32 par cohorte). Enfin, veiller à ce que les chercheurs qui effectuent des études sont aveuglés aux conditions expérimentales.
Remarque: Il est recommandé qu'une étude typique drogue efficacité commence au jour d'âge 50 mais sur la base du type d'intervention thérapeutique, il serait peut-être préférable de commencer l'étude tôt ou plus tard.
Remarque: Une étude avec 32 souris par cohorte est alimenté pour détecter la drogue effets sexospécifiques. En l'absence de comparaisons sexospécifiques sont nécessaires, 24 souris par cohorte devrait suffire pour détecter les effets de la drogue ensemble.
2. Poids corporel
- Les poids corporels de la fiche pour toutes les souris dans les études quotidiennement avec une précision d'un dixième de gramme. Remarque: Le poids corporel est un indicateur sensible de la progression de la maladie et de tout malaise qui pourraient résulter d'un traitement chronique de drogues.
- Poids corporel de souris varient considérablement au cours d'une journée, étant plus élevé le matin, donc les enregistrer dans le même temps chaque jour.
3. neurologique Scoring System (NeuroScore)
- Évaluer les scores neurologiques (NS) pour chaque souris tous les jours en observant la souris sous les trois conditions suivantes effectuées successivement: a) la souris est suspendu par sa queue, b) la souris est autorisé à marcher, et après l'apparition de la parésie c) le la souris est placé sur le côté.
- Pour le test de suspension caudale, tenir la souris environ 1,5 "à partir de la base de la queue sur le dessus de fil de leur maison cage pour 1-2 sec, loin du bassin de la nourriture, tandis que obsErving les membres postérieurs. Répétez le test de suspension 3 fois et enregistrer le résultat le plus cohérent.
- Pour le test de marche, placez la souris sur une surface propre qui fournit une certaine traction et à une distance de marche de 25 cm (par ex., Une serviette en papier collé vers le bas pour éviter de glisser). Laisser la souris pour marcher un total de 75 cm (longueur 3X de la serviette en papier) tout en observant sa démarche.
- Pour le test des «réflexe de redressement", placez la souris sur le côté gauche ou à droite et en utilisant un chronomètre mesurer le temps qu'il faut pour se redresser sans aide des deux côtés. Remarque: Un seul essai de ce test est nécessaire.
- Déterminer la NS de chaque patte arrière (gauche ou droite) indépendamment sur une échelle de 0 à 4. Note: Par exemple, un score de 0, 1 indique que la patte arrière gauche NS est 0, tandis que la droite est postérieur NS 1.
- Attribuer des notes (0-4) neurologiques correspondant à l'ensemble des observations (sommaires fournies dans le tableau 1) suivante:
- Attribuer NS 0 (pré-symptomatique), si l'on observe ce qui suit: Lorsque le souris est suspendu par la queue, le membre postérieur présente un évasement normale-à-dire, il est complètement sorti loin de la ligne médiane latérale et il reste dans cette position pendant 2 secondes ou plus long. Lorsque la souris est autorisé à marcher, la marche normale est observé.
- Attribuer NS 1 (premiers symptômes) si les conditions suivantes est observée: Lorsque la souris est suspendu par la queue, le membre postérieur présente un évasement anormale, à savoir, il est effondré ou partiellement effondré vers la ligne médiane latérale ou elle tremble lors de la queue suspension ou il est escamoté / serré. Lorsque la souris est autorisé à marcher, la marche normale ou légèrement lente est observée.
- Attribuer NS 2 (début de la parésie) si l'on observe ce qui suit: Lorsque la souris est suspendu par la queue, le membre postérieur est partiellement ou complètement effondré, ne se prolongeant pas beaucoup. (Il peut-être encore le mouvement des articulations). Lorsque la souris est autorisé à marcher, le membre postérieur est utilisé pour mot de l'avantCependant les ions Replier les orteils vers le bas au moins deux fois au cours d'un 90 cm à pied ou d'une partie du pied est traînait fond de la cage / table. Lorsque la souris est placé sur le côté gauche et à droite, il est capable de se redresser dans les 10 secondes des deux côtés.
- Attribuer NS 3 (paralysie), si l'on observe ce qui suit: Lorsque la souris est suspendue par la queue, la paralysie est rigide dans la patte arrière ou un mouvement de joint minimale. Lorsque la souris est autorisé à marcher il ya mouvement vers l'avant mais le membre postérieur est pas utilisé pour la marche avant. Lorsque la souris est placé sur le côté gauche et à droite, il est capable de se redresser dans les 10 secondes des deux côtés. Remarque: Rarement, après l'apparition de la paralysie, de l'urine de l'humidité peut apparaître sur les membres postérieurs. Gauche urine brute d'humidité peut entraîner à l'urine "Graver" et des lésions de la peau. Traiter l'urine humidité par clipsage les cheveux, appliquer de l'eau chaude absorbe pour enlever l'urine, et sécher délicatement sec. Se lésions cutanées sont présents appliquer antibiopommade tic.
- Attribuer NS 4 (Humane point final), si l'on observe ce qui suit: Lorsque la souris est suspendue par la queue, la paralysie est rigide dans les membres postérieurs. Lorsque la souris est autorisé à marcher, il n'y a aucune motion. Lorsque la souris est placé sur le côté gauche et à droite, il ne parvient pas à se redresser dans les 10 sec de côté non plus. Ie, absence de redressement réflexe.
4. Saisie de données et analyse
- Au cours d'un médicament à l'étude d'efficacité, entrer des données recueillies pour chaque souris dans une Laboratory Information Management System (LIMS) ou dans un tableur disponible dans le commerce.
Remarque: Le logiciel LIMS ALS TDI-développé est un référentiel central pour toutes les données recueillies à partir d'études internes, rendant ces données facilement accessibles au fil du temps pour les enquêteurs ALS TDI. LIMS suit toute souris individuelle, avec son ID unique, de retour à sa lignée, le poids corporel ou le score neurologique tous les jours de l'étude,et comprend toutes les autres observations notées au cours de sa durée de vie. LIMS génère finalement une feuille de calcul qui est utilisée pour des analyses ultérieures. - A l'issue d'une étude de l'efficacité des médicaments, à savoir, lorsque toutes les souris atteignent le point final humaine, utiliser un logiciel de feuille de calcul (voir le tableau des matériaux) pour calculer la NS combinée pour chaque souris, pour chaque jour de la moyenne de la patte arrière gauche et à droite NS . Ensuite, calculer l'âge médian à chaque NS pour chaque souris et le nombre de jours chaque souris passe à une NS particulier.
- Analyser l'évolution globale des NS au fil du temps en important les données du tableur pour le logiciel statistique (voir le tableau des matériaux). Monter ces données en utilisant un modèle de régression logistique ordinale qui estime la NS attendue, avec l'âge médian à la NS et traitement de la toxicomanie que les effets de la régression. En utilisant le test de chi carré du log-rank estimer la probabilité effet de probabilité et de déterminer si l'effet traitement de la toxicomanie sur la progression NS est statistiqueLy significative (voir le fichier de code supplémentaire pour les instructions étape-par-étape).
Remarque: Une valeur de p <0,05 est considérée comme statistiquement significative.
Remarque: Cette méthode d'analyse statistique respecte la nature ordinale des données NS et la nature variable des trajectoires NS pour les souris individuelles. Il est préférable parce que les trajectoires individuelles NS peuvent être sensiblement différente entraînant NS moyennes de groupe le temps associé qui ne sont pas suffisamment réfléchissante des réponses NS. En outre, dans certains cas, NS peuvent fluctuer, surtout quand dans la gamme de zéro à un. - Enfin, utiliser un logiciel graphique (voir le tableau des matériaux) pour générer "ordinale attendus NS vs Âge médian au NS» graphiques pour les animaux traités avec le médicament et de contrôle (figure 2; voir code supplémentaire fichier pour obtenir des instructions étape-par-étape). Utilisez ces graphiques pour estimer convenablement les changements entre les groupes traités par le médicament et de contrôle par interpolation partir de l'axe-y l'âge médian de l'apparition de maladies (i.e., NS 2) sur l'axe des x.
Remarque: La différence d'âge médian entre les deux groupes représente un changement induite par le médicament et est assimilée à une mesure pratique de l'ampleur de l'effet.
Remarque: déplacements vers la droite dans le NS rapport à la courbe de l'âge médian prévu indiquent ralenti la progression de la maladie symptomatique. Inversement, les déplacements vers la gauche dans le NS rapport à la courbe de l'âge médian prévu indiquent accéléré la progression de la maladie symptomatique.
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Representative Results
Les données de partition neurologiques pour 90 mâles et 94 souris SOD1 G93A-femme non traité étudié à ALS TDI pendant 2014 ont été évalués. Les résultats montrent que les souris mâles ont généralement une progression de la maladie plus agressive que les souris femelles, comme en témoigne une plus grande proportion de leur durée de vie au NS 1 par rapport aux femelles. NS 2 et 3 NS surviennent avec une fréquence pratiquement égale entre les sexes. NS 0 a été exclu de l'analyse parce que ce phénotype est considéré comme une "normale". NS 4 a également été exclu parce que, par définition, il ne peut se produire une fois dans la vie d'une souris SOD1 G93A-(tableau 2 et figure 1).
NS données est présentée à partir d'une étude de l'efficacité de la pharmacologie SLA de progression de la maladie du composé essai TDI173 chez la souris SOD1 G93A-(n = 16 par sexe / traitement; 64 souris total). Sur la figure 2, le taux de progression de la maladie neurologique est présenté comme capturée par l'analyse de régression des données ordinale captured en utilisant le protocole détaillé ici NeuroScore. Souris TDI173 traités ont été comparés à un véhicule témoin traité. Aucune différence statistiquement significative n'a été observée lorsque les sexes ont été analysés séparément, mais la signification statistique a été atteint lorsque les sexes ont été fusionnés. L'analyse de Kaplan-Meier de la survie, même si montrant des tendances similaires que l'analyse statistique logistique ordinale, était pas assez sensible pour révéler des différences significatives même lorsque les sexes ont été fusionnées (figure 3).
| NS 1 | La patte arrière présente un évasement anormale, à savoir, il est effondré ou partiellement effondré vers la ligne médiane latérale ou elle tremble lors de la queue suspension ou il est rétracté / jointes. | La marche normale ou légèrement plus lent. | N / A |
| NS 2 | Le postérieur est partiellement ou complètement effondré, ne se prolongeant pas beaucoup. Il pourrait stmal-être le mouvement des articulations. | Le postérieur est utilisé pour la marche avant mais les orteils se recroquevillent vers le bas au moins deux fois au cours d'un 75 cm à pied ou d'une partie du pied est traînant fond de la cage / table. | La souris est capable de se redresser dans les 10 secondes des deux côtés. |
| NS 3 | Paralysie rigide dans le membre postérieur ou d'un mouvement de joint minimale. | Mouvement vers l'avant mais le membre postérieur est pas utilisé pour la marche avant. | La souris est capable de se redresser dans les 10 secondes des deux côtés. |
| NS 4 | La paralysie dans les membres postérieurs rigide. | Pas de mouvement vers l'avant. | La souris est pas capable de se redresser dans les 10 secondes à partir de côté non plus. |
Tableau 1: Sommaire des observations phénotypiques utilisés pour attribuer des notes neurologiques.
| Fréquence de NS1 | Fréquence de NS2 | Fréquence de NS3 | ||||
| Mâle | Femelle | Mâle | Femelle | Mâle | Femelle | |
| Nombre de Souris | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| Minimum | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25% | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| Médiane | 37 | 27,5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75% | 44 | 37,5 | 7.5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| Maximum | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
Tableau 2: Une analyse de la fréquence des données NS à partir de souris non traitées SOD1 G93A marqués par jour du jour de 50 ans jusqu'à la mort. Les distributions ont été calculés pour NS 1, 2, et 3.
Figure 1. Représentation graphique du nombre de jours passés à chaque NeuroScore anormale pour chaque souris à partir de la population non traitée souris SOD1 G93A dans notre colonie pendant 2014 (mâle n = 90, femelle n = 94). Les fréquences de point pour le même souris sont représentés pour chaque NS possibles. NS 4 a été omis parce que l'événement ne peut se produire une fois dans la vie de chaque souris par définition. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande versio n de ce chiffre.
Figure 2 Un type ordinal logistique statistique analyse graphique comparant la progression de la maladie neurologique de souris TDI173-traitée (ligne rouge) à des souris témoins traités avec le véhicule appariés litière.. (Ligne bleue; Rapporté valeurs p représentent test log-rank de chi carré) S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 3 Un type Kaplan-Meier analyse graphique comparant la durée de vie des souris TDI173-traitée (ligne rouge) à des souris témoins traités avec le véhicule appariés litière (ligne bleue; p-valeurs rapportées représentent test log-rank).jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un protocole vidéo simple et rapide qui, si elle est correctement appliquée, est capable d'évaluer de façon fiable la progression de la maladie chez les souris SOD1 G93A-et identifier les changements induits par les médicaments. Alors que les différents groupes ont développé des systèmes de notation phénotypiques pour les souris SOD1 G93A-8-10, ils ont souvent ne fournissent pas suffisamment de détails sur la procédure et sont insuffisantes pour la réplication. En conséquence, les systèmes de notation sont rarement utilisés en dehors du groupe spécifique qui les développe. Dans ce rapport, la combinaison d'un manuscrit détaillée avec vidéo minimise ambiguïtés notation et la variabilité inter-expérimentateur permettant ainsi pour le protocole doit être adopté par d'autres laboratoires et permettant des comparaisons entre les études qui se déroulent à différents paramètres.
Le système de notation neurologique décrite dans le présent rapport, dénommé NeuroScore, génère des données ordinales où les valeurs numériques exactes attribués à des ensembles de signes et symptoms ont pas de sens au-delà de l'établissement de gravité de la maladie classé. Dans ce cas, NS 0 est l'état de la maladie moins grave et signifie une souris avec la fonction de membre postérieur normale tandis que NS 4 est l'état de la maladie la plus grave avec la souris à l'approche ou la morbidité secondaire à une maladie neuromusculaire. Même si le système de notation rend l'utilisation de seuils symptomatiques, chaque valeur ordinale NS englobe un large spectre de présentations cliniques possibles dont beaucoup ont été capturés sur la vidéo et inclus dans le présent rapport.
NS 1 englobe le spectre de symptômes précoces de la maladie chez les souris SOD1 G93A-, qui peuvent varier considérablement d'une souris à. Certaines souris présentent un évasement anormale avec les membres postérieurs effondrement vers la ligne médiane tandis que d'autres montrent des tremblements des membres postérieurs et certains ont même montrent la rétraction des membres postérieurs ou enserrement. En outre, dans les premiers stades de la maladie, les NS de certaines souris peuvent fluctuer pendant plusieurs jours entre 0 et 1 NS Invariablement cependant, dans SOD1 G93A-souris fréquence lade NS 1 augmente avec temps et il comprend de plus en plus des différents phénotypes décrits. En moyenne, les souris mâles et femelles SOD1 G93A passent généralement 37 et 28 jours respectivement à ce stade.
NS 2 représente le début de la parésie (paralysie partielle ou légère) et fournit la preuve indéniable de la présence de la pathologie. Alors qu'il est pas rare pour une souris de type sauvage à parfois présent comme NS 1, NS 2 ne se produit que chez les souris SOD1 G93A-. De même à 1 NS, NS 2 capte un spectre de signes et de symptômes. Dans une présentation à un stade précoce de la souris NS 2 est ambulatoire et énergique. Une présentation plus avancée de NS 2 révèle une souris avec une capacité très limitée de se déplacer. Parésie des membres postérieurs avancée dans la souris peut empêcher d'atteindre la nourriture et de l'eau dans la partie supérieure de la cage, de sorte que les granulés de produits alimentaires doivent être placés au bas de la cage ou de la nourriture hydratés doivent être fournis. En outre, les tubes Sipper plus longs doivent être placés sur des bouteilles d'eau. SOD1 G93A souris typically passer 5 jours à ce stade.
NS 3 signifie une paralysie complète des membres postérieurs, et par tous les comptes est le phénotype plus faciles à identifier et le score. Les symptômes de paralysie englobés par NS 3 peuvent être soit flasque ou spasmodique, mais sont généralement spastique. En ce point, les souris sont très malades et doivent être surveillés fréquemment. En moyenne, les souris SOD1 G93A-passer 1 à 2 jours à ce stade.
NS 4 désigne l'absence de "réflexe de redressement" qui ne dépendent pas exclusivement sur la fonction des membres postérieurs comme NS 0-3 mais il reflète l'ensemble bien-être du corps de la souris. La capacité d'une souris à démontrer un «réflexe de redressement" normale exige de la motivation, de l'énergie, mais aussi la fonction de plusieurs groupes musculaires, y compris les membres postérieurs, membres antérieurs, et l'abdomen. Il est important de noter que la progression de la maladie chez ces souris est souvent symétrique et une souris qui peuvent mener à bien le réflexe de redressement lorsqu'ils sont placés sur un côté may être incapable de le faire lorsqu'il est placé sur l'autre côté. Il est donc important, pour le traitement sans cruauté des animaux et de l'intégrité de l'étude, pour effectuer des tests sur les deux côtés et euthanasier la souris si elle ne parvient pas à se redresser de chaque côté.
NS 4 définit la date de l'euthanasie et par défaut aligne directement avec les données de survie. Toutefois, la progression de la maladie dans l'ensemble, telle que définie par l'analyse de régression ordinale de NS, pourrait ne pas se chevaucher complètement avec les courbes de survie de Kaplan-Meier et les données de poids corporel. Certaines interventions thérapeutiques peuvent influencer l'apparition des symptômes ou la maladie, mais ne parviennent pas à un impact sur la durée de vie globale.
Bien que pas discuté en profondeur dans le présent rapport, le poids corporel peut être une autre mesure qui peut être utilisé en combinaison pour NS pour évaluer apparition de la maladie et la progression dans SOD1 G93A mais il peut être faussée par des différences dans les régimes alimentaires et en produits thérapeutiques qui provoquent un œdème ou d'influence le métabolisme des graisses 11,12.
13 et non membres postérieurs déficits moteurs, un phénotype qui ne sont pas capturés par NeuroScore. Une autre limitation de ce protocole est le fait qu'il a été conçu et applique uniquement à des souris SOD1 G93A copies élevé. Dans notre expérience, la présentation clinique de la maladie dans d'autres modèles murins de la SLA, comme le faible nombre de copies SOD1 G93A souris 14 ou le TDP-43 souris 15,16, est différent de celui dans le haut copie de souris SOD1 G93A et ce système NS pourrait être mal adapté pour ces modèles. Ainsi, il est important de déterminer le nombre de copies du transgène de souris avant de les affecter à des études et de vérifier qu'elle est égale à celle de souris positif de commande de copies élevé. Peu importe, les avantages de nousing ce système de notation neurologique emportent sur ses limites et ce protocole vidéo peut servir comme un excellent outil de formation pour les chercheurs de la SLA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
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