Abstract
不同于哺乳动物，昆虫例如果蝇有多个味觉器官。在腿部，长鼻，翅膀和果蝇的产卵的化学感受神经元表达味觉受体1,2，离子通道3-6，和所涉及的检测易失性和非易失性的感官提示的离子型受体7。这些神经元直接联系促味剂，如食品，有毒物质和信息素，因而影响许多复杂的行为如摄食，产卵和配合。电极录音和钙成像已被广泛用于在昆虫量化这些促味剂诱发的神经元的反应。然而，电需要从单一口味感器专用设备和获取测量值可以根据细胞类型，大小和位置在技术上具有挑战性。此外，在果蝇单个神经元分辨率是很困难的，因为味觉感受器后实现本身多于一种类型的化学感受神经元。此处描述的活钙成像法允许测量在活蝇单味觉神经元的响应。这种方法特别适用于成像脂质信息素和其他配体类型的具有在水基溶剂的溶解度低神经元的反应。
Introduction
动物依靠嗅觉和味觉的信息，以调解的生存和繁衍至关重要的决定。理解暗示如何化学感受检测和由神经系统处理要求感官受体（S）和相应的化学配位体的识别。 果蝇检测了惊人的各种挥发性和非挥发性化合物，并且在其中，研究生理极好模型机制的基本chemosensation。而嗅觉器官感知挥发性分子，味觉器官是专门用于检测低挥发性化合物。在这里，我们提出了直接测量果蝇的味觉器官低挥发性，亲脂性配体神经元的反应的方法。
苍蝇的味觉器官包括前腿，喙，和翅膀。分发的味觉器官的表面上是称为感器毛发状结构，其为s响应ugars，苦味，盐，水和费洛蒙8。该感受器已形态分为刷毛的味道和口感钉9。有关于被分类为长（l型）唇瓣约31味刷毛，短（S型）和中间体（i型）的形态。在'L'和'S'是生理糖回应感器房子4感觉神经元（在S细胞），低盐（L1细胞），高盐和苦味化合物（二级电池）和水（在W单元）10 ，11。的“i”感器房屋2的感觉神经元，其中的一个响应既低盐和糖，而其他响应高盐12。有男性约41的味道感受器和分布在每个前肢女26感器。对于男性和女性中，有21感器上midleg，并在后腿13约22感器。由味道感器上腿包围的味觉神经元还包含classified成L1，L2 W和S的类型。
从单个神经元测量电活动的一种标准方法使用外或细胞内的电极来记录离子流。电极测量允许非模式生物进行研究，例如果蝇 ，蛾，和缺乏神经标记广泛的遗传工具蜜蜂神经功能。然而，尽管电生理方法已被经常使用从果蝇味觉测量活动感器4,13,14，运用这种方法存在一些技术挑战。首先，味道刷毛需要基于形态学和空间位置被识别。经鉴定，电测量可通过感受器的尺寸小的阻碍，限制无障碍由于位置，以及难以应用化学刺激的控制卷味道塞得满满的。另外，感器的刺激可以产生一个以上的信号神经型15。其次，电信号检测可以通过从电子设备的机械振动和噪声产生的背景噪音混淆。三，使用锋利的电极会损坏飞行准备，如果使用不当，14。最后，组装电钻机需要刺激递送，信号记录，和数据分析的专门的电子元件，并且可以是昂贵的。
在D.果蝇的基因编码工具的可用性提供了便利的成像技术，使神经元的小种群的反应进行研究开发。一种这样的方法是使用CaLexA记者16。在此方法中，编码的LexA-VP16转录因子和钙敏感蛋白NFAT基因序列融合在一起。的蛋白磷酸酶钙调磷酸酶的钙活化催化NFAT的去磷酸化，并反过来，facilitaTES其导入到细胞核。在细胞核内时，LexA的结构域结合到其引导绿色荧光蛋白（GFP）报道分子的表达，从而使功能性激活的神经元的持续识别LexAop DNA结合基序。该方法已成功地用于测量以下的活苍蝇暴露于臭剂16具体嗅小球中的触角叶的响应。近日，IR52c味觉受体神经元的生理反应，从使用CaLexA 7活苍蝇测量。然而，对于本研究，这是必要的，以年龄苍蝇为长达6周，以提高GFP转录。同时用抗GFP抗体免疫染色可以用于促进CaLexA信号，这种方法将需要组织固定，从而排除了活细胞成像的可能性。
遗传编码的钙指示剂蛋白GCaMP也被广泛用于研究在一些神经元的反应种17。蛋白质GCaMP前神经元的刺激荧光强度低。刺激的应用程序触发的神经元的动作电位，从而导致钙离子的流入。 GCaMP，势必钙 ，经历构象变化，导致它与亮强度（ 图1）发出荧光。最近开发的单神经元钙成像方法被用于鉴定葡萄糖作为配位体的前腿特定Gr61a味觉神经元18。在这项研究中，从转基因果蝇中Gr61a味觉神经元表达GCaMP解剖前肢上覆盖成像之前琼脂糖层。然而，使用解剖组织可引起GCaMP表达的最终破旧，从而限制了测量时间和检测灵敏度。此外，琼脂糖可以限制灵敏度由于荧光的高背景水平及其光散射特性。
ŧO地址一些弊端，我们描述了使用GCaMP介导的钙成像的记录从前肢和长鼻完整的动物的味觉神经细胞的生理反应。我们表明Gr68a的表达遗传编码GCaMP5G 19至果蝇脂质信息素的生理反应和ppk23神经元，（3 的R，11 Z，19 Z）-3-乙酰氧基11,19-octacosadien -1-醇（CH503）20， 21。神经元的反应是通过量化信息素的刺激过程中GCaMP5G信号的荧光增加测量。在这个协议中，神经元被成像为120秒，这足以区分在各个细胞神经元激活模式中的一个总的持续时间。
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Protocol
1.样品制备
- 穿过与GAL4 3,22驱动线UAS-GCaMP5G 19苍蝇（W 1118，P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40）。允许跨在25℃生长。
注：生成与Gal4的或UAS-GCaMP转基因的多个拷贝苍蝇可有助于增强荧光信号的强度。当Gr68a-GAL4驱动程序的控制下表达的UAS-GCaMP转基因（UAS-GCaMP3）的早期版本中表现出非常微弱的荧光强度。- 收集和性别新eclosed成蝇分开，在25℃的提高。
注：GCaMP5G花期的基线水平在14-28岁之间的日子过得最佳。按性别隔离苍蝇排除可能影响神经反应社会互动的可能性。
- 收集和性别新eclosed成蝇分开，在25℃的提高。
- 麻醉下的 CO 2的轻微流一只苍蝇。
- 安装在F立法院通过第一把指甲油一小滴在0.17毫米盖玻片中心的玻璃盖玻片。轻轻地放在透明指甲油的滴在其侧面一只苍蝇，并确保整个降由飞覆盖。
- 执行步骤1.5和1.6解剖立体显微镜，在8倍放大下使用。
- 用湿画笔延长苍蝇的前腿。通过将胶带的两个薄条带在第一和第五跗节（ 图2A）固定在位置上的前腿。这将暴露跗节T2-T4用于成像（ 图2B）。
- 要在长鼻图像的神经元，将磁带薄带过长鼻揭露唇瓣（ 图2C，D）的主席台。
- 周围绘制飞疏水屏障用PAP笔，以防止在盖玻片表面流动的解决方案。安装的30分钟内进行测量。
2.刺激的制备解
- 稀释的亲脂性配体（如CH503，本研究中使用）在PBST溶液：137mM的氯化钠，2.7mM的氯化钾，10毫的 Na 2 HPO 4，1.8毫摩尔KH 2 PO 4，0.1％的Triton X-100（V / V ）; pH值7.4。
- 使用PBST配体的1毫克/毫升储液。准备使用PBST原液的所有后续稀释液。
注意：根据感兴趣的配体的溶解度，可能需要不同的溶剂以溶解配体。 CH503的在各种溶剂中的溶解性在表1中说明。不同的其它溶剂，PBST没有产生荧光的增加。
- 使用PBST配体的1毫克/毫升储液。准备使用PBST原液的所有后续稀释液。
3.味觉神经元和图像采集的刺激
- 使用10微升移液器，将10微升PBST搬上跗节。
注意：这一步滋润腿部，防止跗节漂流。 - 使用具有苏相机的光学系统fficient速度和灵敏度，实现高时间分辨率良好的荧光信号。
注：在本研究中，我们采用了旋转盘共聚焦显微镜和SCMOS相机（见材料清单 ）。 - 选择特定的跗段和神经元要被成像。收购三家刺激前期共聚焦Z-栈。
- 理想的情况下，利用采集设置的足够快，以允许最大的时间分辨率，同时还拍摄了整个细胞的体积。例如收购设置为：200毫秒曝光，分档2×2和6×0.5微米2光学切片，捕捉每2秒。
注意：固定化的腿已被成功地成像为至多10分钟，在30秒的时间间隔，用GCaMP信号的没有明显的漂白效果。对于更长的记录时间，确保腿举行非常牢固就位盖玻片上。 - 优化激光功率为最高的信号 - 噪声整个伊马期间以最小的光漂白实现晋政权。对于这里描述的实验中，在30％的透射率使用491纳米二极管激光器（100毫瓦），用于成像的腿和吸管两者Gr68a和ppk23味觉神经元。用2×2像素合并以允许较短的曝光时间，同时仍实现充分的空间分辨率。
注意：激光功率设置进行了优化，使荧光的变化范围从1.2〜4.5倍的检测。
- 理想的情况下，利用采集设置的足够快，以允许最大的时间分辨率，同时还拍摄了整个细胞的体积。例如收购设置为：200毫秒曝光，分档2×2和6×0.5微米2光学切片，捕捉每2秒。
- 移取10微升的刺激解到跗节。对于控制实验中，再添10微升的PBST。立即获取117刺激后的图像。
注：获得刺激后的图像数是基于其中在荧光最大变化达到的时间量（约2分钟）。- 关键的一步：虽然在准备吸取溶液，不碰飞枪头，因为这将导致前腿搬出位置。
注：另外，用一个显微精确定位含有刺激接近跗段玻璃毛细管将被成像。递送根据制造商的说明使用的细胞内微注射分配器刺激控制卷。
- 关键的一步：虽然在准备吸取溶液，不碰飞枪头，因为这将导致前腿搬出位置。
4.图像处理与分析：响应的定量分析
- 打开使用斐济（一系列共聚焦Z-栈http://fiji.sc/Fiji ）23或ImageJ的（ http://imagej.nih.gov/ij/ ）24图像分析与处理软件。
- 使每个120的时间点的所有六个ž切片的总和强度投影。
- 在选择“图像”的“堆栈”选项。此外，选择“Z投影”选项，输入“1”作为起始片，“4”为停止片。对于投影类型，选择R20;总和切片“，从下拉菜单中，选择”所有时间框架“。
- 通过使用徒手选择工具绘制一个周围细胞体或神经元投射的边界定义感兴趣区域（ROI）的区域。单击“分析”标签，并选择在“工具”下的“投资回报率管理”选项。
- 通过选择“设置测量”选项，“分析”菜单下并检查盒集成密度，面积量化的投资回报率的荧光，平均和最大灰度值和标签。然后，选择投资回报率经理菜单下的“更多”选项，并进一步选择“多措施”选项。
注意：这将产生与每个所选参数的值的弹出框。 - 检查最大灰度值，以确保没有象素已达到饱和（ 例如 ，65,535为一个16位的相机）。
注：有关实验表明在T要么从根据观察到ΔF/ F中的最大增幅，其中细胞体或神经元的预测，衡量他的论文，反应。 - 在时间点t计算荧光（ΔF/ F）的最大相对变化如下：
- 从每个F（单元）值中减去背景荧光。量化背景荧光，从前腿（或吸管）不含可检测的神经元的面积测量等效尺寸和形状的ROI的集成密度。
- 量化的刺激后的荧光，F（细胞）T，测量在刺激后的时间点“t”的细胞体或过程的ROI的集成密度。
- 量化刺激前期荧光，F（细胞）t = 0 时 ，分析细胞体或工艺的刺激前的图像中的方式相同的刺激后信号。使用3个图像的平均积分密度来确定F（细胞）T = 0。
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Representative Results
使用Gr68a-GAL4或ppk23-GAL4司机GCaMP钙指标进行了基因表达。前脚神经元和非神经细胞支持的不同的种群由每个驱动器（ 图3A-C）标记。在Gr68a-Gal4的观察到亲脂性信息素CH503配体特异性反应和ppk23-Gal4的细胞中表达GCaMP（ 图3D）。在GCaMP5G信号（ΔF/ F）的荧光强度的相对变化，用较高浓度CH503（ 图3E）的增加。有趣的是，CH503的5毫微克剂量可抑制神经反应。
Gr68a和ppk23神经元表现出不同的反应模式。 Gr68a神经元呈神经元反应的补品图案（ 图3F），而神经元ppk23呈现出阶段性，振动响应（ 图3G）。从长鼻ppk23神经元的反应是一LSO使用这种制剂测量，显示出阶段性和振荡反应（ 图3H）的组合。
图1：在GCaMP钙成像技术的基本原理 GCaMP5G在Gal4的基因表达标记的细胞并用低强度之前的神经元的刺激荧光。刺激的应用触发的神经动作电位，引起钙内流。 GCaMP5G，一旦结合到的 Ca 2+，经历构象变化，从而提高荧光（ΔF），其随时间而改变。基线荧光（F）是指刺激前的荧光信号的强度。
图2：安装现场飞前腿或吸管神经元的成像。（A）安装前腿：活男性苍蝇的3.2倍的图像，显示出固定用胶带盖玻片前腿。 （ 二 ）飞行的40X图像，显示每个跗节（T1-5）和磁带上面的第一个跗节段，第5跗节的安置。 （C）安装长鼻：一块胶布放置在讲台上暴露喙的末端。 （D）的吸头，为刺激加法飞略高于举行，不会与准备直接接触。
图3：在GCaMP表达神经元信息素诱导的神经反应 （A）的果蝇的雄前腿表示Gr68a-Gal4的的空间位置的原理图上标记跗节T2-4细胞。非神经细胞（基于大小和形状确定的）是共lored黄色。 （B）中示出了由Gr68a-Gal4驱动子标记神经和支持细胞的雄性前腿的原始荧光图像。比例尺= 50微米。 （C） 果蝇的前肢男性显示的空间位置示意图ppk23-GAL4标记的跗节T2-4细胞。 （如上所示的化学结构）（D）Gr68a-和ppk23表达T4神经元响应CH503。响应于CH503平均ΔF/ F的相比，平均的ΔF/˚F以下的PBST应用单独溶剂;学生的有不等方差（对于Gr68a）或Mann-Whitney检验（对于ppk23）t-试验：* P <0.05，*** P <0.001。误差棒描绘SEM统计功率= 0.93。 （ 五 ）ΔF / F A剂量依赖性变化在T4 Gr68a神经元是观察。学生t检验与方差不等：** P <0.01，*** P <0.001。统计功率= 0.86-0.96。 （F （G），显示振荡颜色编码的时间进程，继ppk23表达神经元的刺激CH503（500毫微克）在GCaMP荧光阶段性反应。对前腿的神经元的位置中示出的原始荧光图像（左）英寸比例尺：10微米;时间尺度：0-96秒。所附线图显示从ppk23神经刺激500纳克CH503的爆破响应。红色箭头表示在其中加入刺激的时间。峰值respoNSE在76秒发生。 （H）上表示从电池主体一晚发补药响应和来自轴突突起以下CH503刺激（500毫微克）的振动性响应的长鼻ppk23表达的神经元的颜色编码的时间过程。细胞的位置被示出的原始荧光图像（左）英寸比例尺= 10微米;时间尺度：0-96秒。再生与来自香卡，S。， 等的权限。神经肽速激肽是一种用于在味觉神经电路的信息素的检测是必不可少的。 DOI：10.7554 / eLife.06914（2015年）， 请点击此处查看该图的放大版本。
| 溶剂1,2 | CH 5的溶解度0 3 3 | 是否单独用溶剂触发神经元的活动？4 |
| 0.1％PBST | 是 | 没有 |
| 100％乙醇 | 是 | 是 |
| 100％己烷 | 是 | 是 |
| 10％乙醇 | 没有 | （未测试） |
| 10％己烷 | 没有 | （未测试） |
| 100％DMSO中 | 是 | 是 |
| 10％的DMSO | 是 | 是 |
| 0.4％DMSO | 是 | 是 |
| 0.2％DMSO | 是 | 是 |
表1：在各种溶剂CH 5 0 3中的溶解度 1 DMSO：二甲基亚砜2乙醇，己烷，和DMSO溶液在DH 2稀释O（V / V）在0.2％DMSO中CH503的3溶解度是有限的。只有250毫微克/毫升在ΔF/的F，单独溶剂4增加相当于安装前后在与信息素刺激粘弹性阻尼器。
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Discussion
我们在这里描述在2个不同的感觉器官进行果蝇外周神经元的活钙成像的方法。该钙 -evoked由信息素配体CH503呈剂量依赖性和定量诱导Gr68a神经元GCaMP荧光反应。它也可以辨别不同的神经反应模式，如阶段性和补品响应。
显示相位响应神经元被认为可以快速适应不断刺激。这种类型的响应的已用气味探测25和节奏运动活动图形26的生成有关。相比之下，神经振荡，这已在许多感觉系统进行了描述，被认为是多输入到一个单一的突触后站点同步，并传达关于刺激27特定功能。与ppk23神经元相关联的振动的分子基础尚未报道，我们千牛owledge。在其它类型的可兴奋细胞示出振荡响应的，振荡的频率已显示通过被称为钙诱导的钙释放28的过程来调节。在此过程中，钙是从内部存储该第二信使肌醇三磷酸的控制下释放出来，并且它的释放的频率是依赖于外部刺激的强度。洞察的滋补神经元的反应的分子基础已经从研究中获得的C.氧传感受体线虫 29。在神经元内钙水平长期升高，发现由L-型电压门控钙通道，兰尼碱，和三磷酸肌醇信号通路29介导的。这将是重要的，以确定类似机制是否发挥ppk23神经元的响应的作用。
活钙成像可适于以多种方式为其他人群的研究
几个技术求索口粮是势在必行，得到稳定的图像，并精确地测量的生理反应的时间过程。首先，前腿必须牢固地定位，因为飞在加入该溶液中，其可以是制剂之间变化的源呈现剧烈运动。虽然信息素溶液浴的应用程序允许所述配体以达到所有在暴露跗节味觉感受器的，一些解决方案的可朝向安装制备的其他部分流动。此外，前腿可能会渐行渐远的解决方案添加时。第二，要准确图像接近瞬时荧光的增加，它在加入的刺激后立即恢复的成像，因为一些神经元显示4秒刺激内迅速和最大应答是重要的。可替代地，一个连续的时间序列之前可加的刺激溶液，并在该刺激施用可以被标记的精确时间点开始。
姑娘=“jove_content”>观察到的假阳性反应两个来源。第一，溶剂本身可诱导甚至在没有配体的荧光响应。在PBST中溶剂造成一些ppk23-Gal4的标记的细胞这样的反应。此外，DMSO为极性和非极性分子的常用溶剂，也诱导在一些Gr68a-Gal4的标记的神经元的响应。确定溶剂本身是否诱导的荧光信号，并选择具有低背景活性的溶剂体系是必要的。第二，在非神经支持细胞强烈阶段性型应答中观察到溶剂PBST独自。所述Gr68a-Gal4驱动子是在出现以包围一些神经元的和一般神经元和支持细胞中表达，是较大的，amorphously形，并且缺乏明显的突起。它选择感兴趣区时，以区别于非神经元响应神经每个Gal4的线是重要的。
_content“>这种方法的一个主要限制是相同的飞制剂不能用于连续实验，以测试不同浓度或类型的配体，除非所施加的刺激首先彻底从盖玻片的表面上除去。此外，这种方法不能用于多种蝇高通量成像一次，由于所需要的果蝇神经元的可视化的高倍率，以及需要快速采集和高时间分辨率。最后，该方法需要的遗传工具，用于转基因的基因表达的可用性，从而限制了应用程序主要是为了主要模式生物。总之，这种方法是利用电极细胞的录音更容易替代，并不需要专门的仪器。此外，不同于其他遗传编码的记者如CaLexA，动物在整个成像允许的生理反应，更让在重新被测定AL-时间在所有年龄段的苍蝇，灵敏度高。此功能可能允许对配体或以下的社会条件或生殖状态变化的神经反应比较年龄依赖性反应筛选。此外，持续的录音可以为至少10分钟，没有明显的光漂白或GCaMP信号的纲要进行。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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