宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Abstract

嫌気性細菌は、これまで、このような腸、口、膣などの多くのヒトのニッチで好気性菌数を上回ります。また、嫌気性感染は一般的であり、しばしば先住民起源のものです。ヒトの細胞に侵入するためにいくつかの嫌気性病原体の能力は、彼らに先天性免疫を逃れるためだけでなく、宿主細胞の挙動を調節するために、適応策を提供します。しかし、嫌気性細菌は、イベントの実験的調査中に生きていることを確保することが課題を提起することができる。 ポルフィロモナス・ジンジバリス 、グラム陰性嫌気性菌は、真核生物の非食細胞の多様な侵入が可能です。この記事では、成功した文化とは、Pの能力を評価する方法について説明ジンジバリスは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を浸潤します。宿主細胞と相互作用する細菌を可視化するために成功裏に侵入し、宿主内で生存することができる細菌を測定するためのものを、その他：2つのプロトコルが開発されました。これらの技術はanaeの使用を必要とP.を供給する robic室最適な成長のための嫌気性環境でジンジバリス 。

第一のプロトコルは、主に細菌に​​よる宿主細胞の浸潤を研究するために使用される抗生物質保護アッセイに基づいています。しかし、抗生物質保護アッセイは限られています。抗生物質処置および宿主細胞の溶解後に培養可能である唯一の細胞内細菌が測定されます。生と死の両方の宿主細胞と相互作用するすべての細菌を評価するために、我々は、宿主 - 病原体相互作用を調べるために、蛍光顕微鏡を使用するプロトコルを開発しました。細菌は蛍光2 '、7'-ビス - （2-カルボキシエチル）-5-（および-6） - カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（BCECF-AM）で標識し、嫌気性条件下で真核細胞を感染させるために使用されます。 0.2％トリトンX-100で透過処理し、パラホルムアルデヒドで固定した後、宿主細胞は、それぞれ、細胞骨格と細胞核を標識するためのTRITCファロイジンおよびDAPIで標識されます。複数のIMA異なる焦点（Zスタック）で撮影されたGESは、細菌の時空間視覚化のために得られます。本研究で使用した方法は、任意の培養可能嫌気性菌及び任意の真核細胞型に適用することができます。

Introduction

嫌気性細菌は、人間の体のほぼすべての面にコロニーを形成します。酸素濃度が低い腸管および尿生殖路の細菌叢において優勢が、それらはまた、皮膚、口、鼻、喉¹上に高レベルで存在します。嫌気性細菌は、内因性感染症の一般的な原因であり、病気のサイトから頻繁に分離されています。しかし、その気難しい性質上、嫌気性菌が分離し、培養することは困難です。嫌気性細菌が関与する研究が制限された条件の下で行われなければなりません。現代嫌気培養技術は、研究者は、多くの嫌気性実験室株、あるいは臨床分離^{2,3を研究するために}必要な嫌気性の設定を模倣することができます。

病原性嫌気性細菌は、それらが存在する宿主細胞とのダイナミックな関係と共進化を開発しました。ほとんどの嫌気性菌はinfectiに到達する前に宿主免疫応答による殺傷に影響されやすいです組織単位（OU）レベル。しかし、いくつかの病原性細菌から逃れるか、宿主の免疫応答を破壊するメカニズムを開発しました。彼らは、 ポルフィロモナス・ジンジバリス 、両方の経口に関与し、グラム陰性嫌気性菌^{。4に信号を送る}ような免疫認識の回避、免疫メディエーターの中和、細胞性免疫の変化、宿主細胞の浸潤、および免疫の変更などのメカニズムを通じてこの目標を達成し、口外疾患、 ホスト^5-7の病原性の変化を引き起こすことができる非常に適合細菌性病原体の一例です。

歯と歯肉粘膜組織との間に形成された深い裂け目に計上バイオフィルムプラークのポケットには、大気中の酸素⁸から保護されている嫌気性細菌を抱くことができます。これらの歯周ポケットは、P.など、様々な嫌気性病原体のためのニッチとして機能ジンジバリス ^9。P.ジンジバリス改造が可能であるキーストン病原体であります歯周病¹⁰の発症と進行を促進する方法で、口腔微生物のコミュニティをる。これは、宿主タンパク質の広いスペクトルに対して活性である毒性因子を大量に生成し、宿主防御の回避¹¹ためのメカニズムを提供します。また、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、 および in vitro および in vivo ^{12-14 15} で歯根膜細胞に侵入することが可能です。効果的に宿主細胞に侵入することにより、P。ジンジバリスは、宿主の免疫を逃れることができます。宿主細胞の効果的な侵入だけでなく、細菌が宿主防御をエスケープすることを可能にするだけでなく、将来の再感染するためのリザーバとして働くだけでなく、宿主細胞を変化させます。宿主細胞が細菌の接着および内在化に関与する分子機構の研究が必要とされています。いくつかの研究室での研究は 、Pの内部に関連する分子事象を理解することに焦点を当てています宿主細胞によってジンジバリス同様に抑制し、免疫応答をハイジャックし、敵対的な宿主防御機構を生き残るために使用されるメカニズムとして。

宿主細胞に侵入することができる病原体を同定し、特徴付けることが可能な多くのアッセイがあります。これは、酸素の不存在下でかさばる器具に依存して研究を行うことが困難であるためしかし、嫌気性病原体によるインビトロ研究は、主に研究者のために多くの実験的な問題を引き起こします。これは、真核細胞が増殖するために酸素を必要とし、従って、組織培養インキュベーター中で別途用意しなければならないという事実によって悪化します。このような障害物を回避する一つの方法は、大気中の酸素の下で研究を行うことであろうが、それは、嫌気性細菌の増殖を不可能にするであろう。別の方法は、感染して宿主細胞の相互作用を研究するために加熱殺菌細菌を使用することであろう。しかし、違いは、ホスト病原体interactiの関連性を低下させる熱殺菌し、生菌の間に存在します¹⁶に。これは、宿主細胞との相互作用変更のない表現で生菌を研究するために中央です。 Pを培養するため、方法嫌気性環境におけるジンジバリスが与えられます 。また、2つの簡単なコスト効率の高いプロトコルがPの能力を評価するための実証されヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）によって内在するジンジバリス 。最初のプロトコルは、人気のある抗生物質保護アッセイに基づいています。アッセイは簡単であるが、嫌気性微生物を用いた検討事項が挙げられます。第二プロトコルは、相互作用可視化する蛍光顕微鏡の使用を必要とし、Pを内在化ジンジバリス 。各アッセイは、制限および嫌気性細菌の侵襲性を研究するための研究者に概要を提供するために説明される利点を有します。現在の原稿は 、P を研究しているがジンジバリス及びHUVECを、これらのプロトコルは、他の多くの嫌気性細菌のために使用することができます宿主細胞の他のタイプのように。

Protocol

以下のプロトコルは、Pを嫌気性種による侵入を培養し、研究するための方法を説明しますジンジバリス ;しかしながら、これらのプロトコルは、嫌気性病原体の数のために使用することができます。たHUVECを用いているが、このプロトコルは、免疫および非免疫の両方の他の真核細胞のために使用することができます。

1.嫌気性チャンバーを使用するとメンテナンス

注意：ポルフィロモナス・ジンジバリスは、周囲の空気中に遭遇酸素の正常なレベルに敏感嫌気性菌です。制御嫌気性環境は、Pの栽培のために不可欠ですジンジバリス 。

1. ここで、（80％N _{2、10％H 2、10％}のCO _2）ビニール嫌気性チャンバー（ 図1A）内の混合嫌気性ガスとして指定された人工的な雰囲気を維持します。嫌気性チャンバーに実験室環境から項目を転送するためのエアロック（ 図1B）を使用します。エアロックは、手動でTWを運営混合嫌気性ガスを導入する前に、N ₂ガ ​​スと氷のパージ。
2. 望ましくない硫化水素のメンテナンスフリーを除去するための硫化水素除去カラム（ 図1C）を使用します。触媒によって作成されたH _{2 O}を除去し、汚染の拡大を促進するエアロゾルを回避するために、チャンバ内の除湿器を置きます。
   注：硫化水素は、多くの嫌気性細菌の天然の代謝副産物であり、その蓄積は細菌に有毒であり、電子機器に損傷を与えると、触媒の寿命を低下させることができます。
3. 水素の存在下（ 図1D）中の酸素を除去し、パラジウム触媒、を介してチャンバの雰囲気を循環させるためにファンボックスを使用してください。
   注：再循環の大気（HEPA）フィルターは0.22ミクロン以上の大きさで空気中の汚染物質を除去します。
4. 嫌気性の内側に位置する37℃のインキュベーターで培養嫌気性細菌室。嫌気性チャンバー内で作業するときは、標準的な無菌技術を使用してください。

図1.嫌気性ビニル室およびその構成要素（A）大気中の酸素から完全に密封されたビニール嫌気性チャンバーは、一度に（32×78でに）二人の個人のためのワークスペースを提供します。これは、（バック中央）37℃に設定したインキュベーターが含まれています。 （B）は、嫌気性チャンバーエアロックのラボ環境からのアイテムの転送に使用されます。 。写真は自動的に嫌気性環境を作成するために必要な真空及びパージ手順を実行するようにプログラムすることができるコントローラを介して操作する自動エアロックです。 （C）硫化水素除去カラムは、望ましくない硫化水素のメンテナンスフリーの高容量の除去を提供します。 （D）2つの触媒ファンボックスであります水素の存在下で、酸素を除去し、パラジウム触媒を介してチャンバの雰囲気を循環を助けるために嫌気性チャンバー全体に置きました。嫌気性チャンバーは、製造元の指示に従って設定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

嫌気性菌の調製

注：P。ジンジバリスは耐気で、好気的条件で保存することができますが、それは^6％17,18よりも高いレベルで酸素の存在下で成長しません。嫌気性チャンバーは、Pの適切な培養のために必要ですジンジバリスおよびその他の嫌気性の種（ 図1）。嫌気性チャンバーの使用に関する適切な研修や教育がmicroanaerobes ¹⁹を使用する前に必要とされます。

1. 嫌気コンディットにすべての液体培地、プレートを平衡化残留酸素を除去するために、実験前に少なくとも12時間のイオン。
2. Pを転送嫌気性チャンバーに-80℃の冷凍庫からジンジバリスは 、解凍してみましょう。
3. ストリークP.トリプチケースソイ血液寒天プレート上ジンジバリス （5％ヒツジ血液とTSA II）。 4-7日間嫌気培養器中で37℃でパラフィルムや店舗でプレートを包みます。
4. Pを接種3ミリリットルブレインハートインフュージョンにジンジバリスは （BHI）培養液は、滅菌ループを使用して、ヘミンおよびメナジオン、嫌気性および選好性微生物の単離および培養のために濃縮された非選択液体培地を補充しました。
   注意：長期保存のため、-80℃の冷凍庫にグリセロールまたはDMSO（10〜20％の最終濃度）と場所をBHIで製造した細菌培養物を混ぜます。
5. Pのスターターカルチャーを準備1:10希釈を作り、細菌が対数中期まで増殖させることによってジンジバリス 。

注：BACの光学密度をterial懸濁液が決定され、検査されるべき各株のための細菌濃度が調整されています。 Pのジンジバリス対数中期および〜7×10 ⁸細胞/ mlに相当する0.7のOD ₆₆₀でサスペンション。上記プロトコルに記載の成長条件は 、Pに対して特異的ですジンジバリスおよび他の細菌株に適合させることが必要になる場合があります。

3.内皮細胞の培養

注：購入は、製造業者の説明書に従って、5％CO ₂中、37℃で、血管内皮増殖因子（VEGF）を含む基本培地中での一次HUVECを培養をプールしました。

1. 15ミリリットルのVEGF培地中に2.5×10 ^5細胞 /フラスコでT-75フラスコ内の種子のHUVEC。
   注：4.0％トリパンブルーで1希釈：1を介して実行可能性を確認してください。双眼光顕微鏡下で見たときに、トリパンブルーを保持します妥協膜を有する細胞は、無傷の膜を有する健康な細胞は、白い表示されます。 COUN100 T細胞は、細胞の80％が生存し²⁰であることを確認してください。
2. 細胞は〜80％の集密度に達するまで予め温めておいた新鮮なVEGF培地で2日ごとにメディアを交換してください。
3. 予め温めておいたPBSで細胞を1回洗浄します。 2 mlのトリプシン中和溶液、続いて5分間、2 mlのトリプシン-EDTA（0.25％）を用いてインキュベートすることにより、T75フラスコから細胞を遊離させます。
4. 50mlコニカルチューブ中の浮遊たHUVECを収集します。 PBSでT-75フラスコから余分な細胞を洗浄し、50mlコニカルチューブに移します。
5. 10分間200×gで遠心細胞。
6. 上清を除去し、予め温めておいた10ミリリットル中のVEGFメディアを細胞ペレットを中断。
7. 血球計または類似の細胞計数装置を用いて細胞濃度を決定します。
8. カバースリップで6ウェルプレート（40万/ウェル）または12ウェルプレートのいずれかに追加する細胞懸濁液の量を計算し（50,000 /ウェル）。 HUVECを、次の日の実験のための準備が整います。

4.生存アッセイ侵攻/インタラクション（メッキ）

注：このアッセイを行う場合、/ウェル40万細胞で播種した内皮細胞の2つの6ウェルプレートを準備します。一方のプレートは、細菌に取り付けられ、宿主細胞によって内在化を評価するために使用されます。他方のプレートは、細胞内細菌を占めることになります。 6ウェルプレートの1つの実験において実行される2つのサンプルの三連を可能にします。このプロトコルの概要については生存アッセイのフローチャート（ 図2）を参照してください。

1. 彼らは中期対数増殖（OD ₆₆₀ 0.5から0.7）に達するまで（セクション1を参照）は、上述したように、嫌気性細菌を準備します。
2. 10分間5000×gで遠心分離菌。
   注：遠心外部嫌気性チャンバーである場合に、密封15mlチューブ中の細菌試料を運ぶ、酸素の漏れを防止するためにパラフィルムで蓋を包みます。
3. ペレット化したPを配置しますバックチャンバー内ジンジバリス 、上清を捨てます。 VEGF私の中で再懸濁する前に再度、PBSでペレット細菌を洗浄DIA。すべての菌株は対数中期（〜7×10 ⁸細胞/ ml）に相当する0.7のOD ₆₆₀でテストされるために懸濁液を準備します。細菌は現在、感染のための準備が整いました。
4. 嫌気性チャンバー内に組織培養インキュベーターからのHUVECを含むトランスファー6ウェルプレート。メディアを削除し、嫌気性PBSで3回洗浄します。各ウェルに嫌気VEGFメディアの2ミリリットルを追加し、感染の温度を平衡化するために20分間嫌気培養器で37℃でプレートを配置します。
   注意：感染のために使用されるものを確実にするために、血液寒天プレート上にプレート細菌が均一で感染時に汚染されていません。
5. 1：100の：感染の多重度（MOIホスト細菌）で細菌を宿主細胞に感染。
   注：HUVEC細胞の数は、感染の前に単一のウェルにトリパン排除試験を実施することによって決定されます。細菌細胞の数を光学密度（0.5 = 5×10 ⁸細胞/ mlの、例えば、OD）を介して決定されます。 Bacterial濃度は、HUVECを濃度²¹に基づいて、適切なMOIに調整されます。
6. 嫌気性インキュベーターに感染したHUVECで6ウェルプレートを置き、細菌は30分間の宿主細胞と相互作用することを可能にします。
7. 嫌気性チャンバー内BHI（w / vの1.0％）でサポニンを準備し、0.2μmのフィルターでろ過します。
8. 両方が結合し、内在化細菌の生存。
   1. 、インキュベーター、吸引メディアからプレートを取り外し嫌気PBSで3回洗浄し、2ml（ステップ4.8に記載のように調製）1.0％のサポニンを濾過加えます。宿主細胞の溶解を可能にするために15分間インキュベートします。
   2. セルスクレーパーで各ウェルの底をこすり。各ウェルからの細胞混合物を収集し、1にする：BHIで1希釈。
   3. サンプルの連続希釈液を作るために進んでください。細菌種および濃度に応じて、連続希釈液を調整します。 100または1：1,000希釈液1で開始します。
   4. 血液寒天プレート上の所望の希釈液200μlをプレート。ラップトン37℃の嫌気性インキュベーターでパラフィルムと場所で彼のプレート。
   5. 37℃でのインキュベーションの7日後、プレートを取り外し、手動でコロニーをカウントするライトボックスを使用してコロニー形成単位（CFUの）を数えます。
      注：のCFUが列挙されています。 CFUの大量のため、画像を撮影することができ、コンピュータソフトウェアは、のCFUの計数を容易にするために使用することができます。
9. 内在化細菌の生存。
   1. インキュベーターからプレートを外します。嫌気性PBSで3回洗浄し、補足し、抗生物質（ゲンタマイシン300μgの/ mlのメトロニダゾール400μgの/ mlの）で2 mlのVEGFのメディアを追加。
   2. 1時間インキュベートします。それらが所望の細菌株を殺すで100％効果的であるように、抗生物質をテストし、それらが宿主細胞^{22,23を貫通し}ていないことを確認するようにしてください。
   3. 培地を吸引は、フィルター1.0％サポニンの2ミリリットルを追加します。宿主細胞の溶解を可能にするために15分間インキュベートします。
   4. 各WELの底をこすりセルスクレーパーでリットル。各ウェルから細胞混合物を収集し、1にする：BHIで1希釈。
   5. （：100、1：1,000 1）試料の連続希釈液を調製します。
   6. 血液寒天プレート上の所望の希釈液200μlをプレート。嫌気性インキュベーターにパラフィルム、所定の位置にプレートを包みます。
   7. 37℃でのインキュベーションの7日後、プレートを取り外して、CFUの数をカウントC。

図2.真核細胞での嫌気性細菌の生存のために使用されるプロトコルの概略図。全細菌の生存および内在化細菌の生存のための両方のアッセイを同時に行うことができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ホストのCeへの細菌の5内在LLS（蛍光顕微鏡）

注：P。ジンジバリスは -カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（BCECF-AM）、2 'で標識7'-ビス- （2-カルボキシエチル）-5-（および-6）されます。 BCECF-AMは非蛍光膜透過性色素です。細胞内エステラーゼの作用を介してフルオレセインBCECFへの変換は、細胞の生存率を示すことができる。P.をジンジバリスは、BCECF-AM色素で標識した後、真核生物細胞を感染させるために使用されます。感染後、細胞を固定し、DAPIおよびTRITCファロイジンで標識しました。真核細胞の核を染色するために使用DAPI染色はまた、代謝的に切断するのBCECF-AMできない非生存細菌を同定するための対策を提供する細菌の細胞核を標識します。宿主細胞はTRITCファロイジン、赤アクチン染料で強調表示されます。

1. オートクレーブカバースリップ。無菌/ウェル5×10 ⁴個の細胞で内皮細胞を播種する前に、12ウェルプレートにカバースリップを追加します。 （実験前に準備日）
2. セクション1で説明したように対数期中期（OD ₆₆₀ = 0.5〜0.7）まで増殖させ、嫌気性細菌を準備します。
3. ウォッシュ細菌は5,000×gで遠心分離し、5-7×10 ⁸細胞/ mlでPBSにペレットを懸濁させることによって、嫌気性PBSで2倍。
4. 2μmのBCECF-AMの最終濃度になるように細菌懸濁液（5-7×10 ⁸細胞/ ml）の2 mlに0.2 mMのBCECF-AMの20μLを加えます。
5. 暗所で30分間37℃でインキュベートします。
6. 内皮細胞での転写プレートを嫌気性チャンバー内に18ミリ（＃1.5厚さ）の組織培養インキュベーターから円形のカバースリップ上に播種しました。 PBSおよび嫌気性のVEGFメディアとの交換で洗浄します。
   注：HUVECを、光顕微鏡下で健康であることを確認します。 HUVECSは形態がメーカーに匹敵する必要があり、〜80％コンフルエントにする必要があります。
7. で遠心ラベル細菌残留BCECF-AM色素を除去するために10分間、5,000×gで。 2ミリリットル嫌気VEGF培地に懸濁します。
8. 1（細菌：ホスト）100のMOIで標識細菌を宿主細胞に感染。
9. 30分間、37℃で嫌気性チャンバー内でインキュベートします。
10. そしてPBSで3回感染洗浄後、細胞を10分間、新たに調製した4.0％パラホルムアルデヒド中で固定します。
    注：細胞を固定した後、実験を嫌気性チャンバーの外で行うことができます。
11. 洗浄は、PBSで3回カバースリップ。
12. 10分間、0.2％トリトンX-100の1ミリリットルを追加します。
13. 洗浄は、PBSで3回カバースリップ。
14. 45分間カバーガラスにTRITCファロイジン（50μg/ mlの）の50μLを追加します。
15. 洗浄は3回カバースリップ、DAPIを含むソフトセット封入剤でスライド上で12ウェルプレートと場所から削除します。マニキュアと側面をシール。
    注意：スライドは、暗所で数ヶ月の​​ために保存することができます。光退色を防止するために、光の露出を避けてください。
16. 表示スライド共焦点顕微鏡を使用して。
    1. ここで、（反転）AxioObserver周りに構成された34チャンネル分光システム（32チャネルアレイ検出器と両サイドのPMT検出器に加えて、透過光検出器）、電動XYステージとスタンドを使用しています。青色ダイオード（405 nm）で、マルチラインアルゴン（458、488、514 nm）で、緑ダイオード（561 nm）で、赤のヘリウムネオン（633 nm）を440 nmのパルスレーザー：システムは、5つのレーザーを持っています。 （FRET-FLIM用）2ハイブリッドのGaAsP検出器と蛍光寿命イメージングシステムを装備。
    2. 340から380 nmおよび540〜560 nmでの励起波長、それぞれ435から485 nmおよび570から590ナノメートルの発光フィルターとデュアルバンドフィルタを使用して、1つのチャンネルにDAPIおよびTRITCからの蛍光を検出します。 440から500 nmでの励起波長および510から590ナノメートルの発光フィルターを用いてフィルターを用いBCECF-AMからの蛍光を検出します。
       注意：BCECF-AMのコントロールは、生菌に関する表示の適正化を確保するために研究されているすべての細菌株に行われるべきです。まずそのnonviabを検証ル細菌は、DAPI陽性およびBCECF-陰性です。第二に、生きた細菌はフルオレセインBCECFにBCECF-AMを代謝できることを確認します。細菌やBCECF-AM色素の種々の濃度は、最適なラベル付けをテストする必要があるかもしれません。

Representative Results

上記で概説したプロトコルはPとの間の宿主-病原体相互作用を研究に使用しましたジンジバリスおよび内皮細胞。P.ジンジバリス W83 と P. PG0228の欠失を保有するジンジバリス V3150を研究に使用しました。 PG0228は、最終的にPの相互作用に影響を与える可能性があるRNAおよびタンパク質のレベルを変化させることができるタンパク質をコードすることが予測され宿主細胞とジンジバリス 。 P上 PG0228の影響を調査するために、 ジンジバリスの宿主細胞と相互作用する能力、HUVECをと相互に作用する親および変異株の能力を比較しました。生存プロトコル（ 図2）は、この研究に適用しました。両方の株は、このように同じような成長曲線と感染する前に遭遇した細胞数の正常化と有意な問題を抱えて、ステップ2で説明したようにこのように、両方の株は対数増殖期まで増殖させました。インキュベーションの7日後、CFUのは、血液Aで観察されましたGARプレート（ 図3）。いくつかの希釈一時10（ 図3A）、1：100（ 図3C）および 1：1,000（ 図3B）は、血液寒天プレート上にプレーティングしました。 図3Aに見られるようにコロニー数を評価するのに高すぎました。コロニーは互いに視認できたと[TMTC] "カウントするにはあまりにも多くの"と指定。あまりにもいくつかのコロニーが得られるように、図3Bの希釈は低すぎました。 1の希釈：コロニーを識別可能であり、コロニーの数をカウントする管理可能であったように、図3（c）に示すように 100は、望まれました。同様の結果が変異株のV3150（ 図3D）について見出されました。 100：このためのCFUは、1の希釈率でプレートから数えました。

CFUの数と希釈係数を用いて、各株のために回収した生菌数の推定値を算出しました。 viablの数を割ますEの細菌が侵入効率として定義割合で細菌結果の最初の数により回収しました。 PG0228を欠く株は生存率の有意な減少（ 図4）を示しながら、両株の侵入効率を比較すると、野生型W83は、高効率でのHUVEC内で生存していました。

さらに欠陥が生存ではなく、細菌の減少内在によるものであることを確認するには、顕微鏡分析を行いました。 P.に感染したHUVEC ジンジバリスは、顕微鏡 （ 図5）の下で観察しました。この例では、1つのHUVECが提示されます。内在化細菌の数を決定するために複数の画像を内在化Pの時空間的識別を可能にZスタックを得るために、異なる焦点距離で撮影しましたジンジバリス 。また、少なくとも40細胞/実験（各生物学的反復のために）分析されるべきであり、それぞれの目のために列挙された内在化細菌の数雨。顕微鏡で見たときに内在細菌の数は、各菌株について同じである場合、両方の株が均等たHUVECに侵入。しかし、変異体は、抗生物質V3150保護アッセイに見られるように、宿主細胞内ながら生存する能力が低下しています。

細胞内細菌の生存のために図細菌生存アッセイの結果3。プロトコルは、野生型P.の能力を評価するために使用されましたジンジバリス W83と侵入したHUVEC内生き残るためにPG0228を欠損変異体V3150。内在生菌はHUVECs- Pのインキュベーション次のCFUの可視化によって決定されています嫌気条件下で7日間血液寒天プレート上でジンジバリス混合物 。血液プレートは、コントラストを向上させ、CFUをより容易にカウントすることが可能ライトボックスに配置されます。種々の希釈は、exましたamined。 P.に感染したHUVEC ジンジバリス W83希釈1：10（A）、希釈1：1,000（B）、希釈1：100（C）。 P.に感染したHUVEC ジンジバリス V3150の希釈1：100（D） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

親と変異菌株間の生存率の図4の比較。HUVECを、野生型P.に感染していましたジンジバリス W83とPG0228における欠損変異体V3150。 図2に概説されるように生存のためのプロトコールに従いました。実験は三連で3回行い、平均±標準偏差で示されています。侵略効率が生き残っ/初期細菌を表します。*変異株は、野生型W83株（P <0.05）と比較して統計学的に有意な減少し、生存している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Pの 顕微鏡分析の図5の例 HUVECを。HUVECをによって内在 ジンジバリスは BCECF-AMを感染させたPをラベル1（ ポルフィロモナス・ジンジバリス：HUVEC）100のMOIで30分間ジンジバリス 。細胞は、パラホルムアルデヒドで固定し、TRITCファロイジンおよびDAPIで標識しました。画像を示している、単一の核（A）とHUVECとF-アクチン（B）は、それぞれ 、青および赤の染色しました。矢印はPを示し、 ジンジバリスは （C）グリーンラベル。マージされたIMAGEはPを表示するために作成されますHUVECを、（D）にジンジバリスの浸潤 。画像は走査型共焦点顕微鏡を用いて製造した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

上記のすべての方法は、真核細胞で嫌気性細菌の相互作用を評価するために、特定のアッセイを設計することができます。しかし、成功した実験を行うには、いくつかの考慮事項があります。最初の研究で使用される菌株です。

それは彼らが同じような成長段階にあり、上記の違いと同様の細胞濃度を達成侵入効率^{13に影響を与えることができること}生存アッセイの両方を持つ2つの株の比較ならびに顕微鏡分析により、非常に重要です。成長曲線は、2つの細菌株の間で異なる場合、調整は最終的に一貫性のある濃度^{21を共有する}類似の成長パターンを達成するためになされるべきです。また、細菌は、細胞凝集を避けるために、均一に分散されるべきです。また、効果的に細胞外細菌を除去する抗生物質を選択することが重要です。選択された抗生物質は、宿主細胞に有害な影響を持っている場合、その後代替の抗生物質または溶菌酵素は^24,25を使用することができます。最後に、ひずみ不均一性が考慮されなければなりません。種は、宿主細胞に侵入するために識別することができるが、そこに別の²⁶への1株から病原性の主要な違いをすることができ、したがって、パイロット研究は、各菌株を検査するために行われるべきです。

第二の重要なステップは、プロトコルを設計する際（宿主細胞に感染するために使用される細菌の数は、感染の多重度[MOI]）最適なインキュベーション時間および細菌接種材料を確立することです。短いインキュベーション時間は、より長い時点で細菌の生存、ならびに細胞内複製^{27を決定するために}必要とされ得る一方で、宿主細胞によって内在化される細菌の能力を評価します。細菌の細胞内生存が使用されてMOIの影響を受ける可能性があるとして、それは、細胞へのダメージが細胞死またはpermeabilizにつながることに起因しなかったことを確認するために、複数のMOIをテストするのが最善ですedは細胞内細菌の抗生物質殺害へのアクセスを有する膜。 MOIと頼まれ、特定の質問に答えるために必要なインキュベーション時間を確立した後、実験プロトコルに従って実行されます。しかし、真核細胞、細菌の溶解混合物のいくつかの連続希釈液を行う必要があります。最適な希釈係数は、観察されたのCFUに基づいて決定されます。 50-200のCFUを有するプレートをもたらす希釈因子は、生存率を評価するのに最適です。 CFUカウントが高すぎる場合、コロニーは互いに視認でき、それは手動で各コロニーをカウントすることが困難となります。 CFUカウントが低すぎると、小さな偏差が検討されている系統間の倍の変化を誇張だけでなく、複製の間に大きな標準偏差を生成します。

第三の重要な点は、健康や​​細菌と対話する準備ができている宿主細胞を準備することです。上記のプロトコルでは、宿主細胞は、標準的な無菌テックを使用して、別々に培養されますhniques。組織培養における抗生物質や抗真菌薬の使用は、特に初心者の細胞培養生物学者のために、望ましいことがあります。しかし、生存アッセイを行う前に、宿主細胞は、嫌気性チャンバー内に細胞を移す前に少なくとも12時間、抗生物質を含まない培地中で培養されるべきです。感染の間に嫌気性細菌に衝突しないよういったんチャンバー内に、メディアが嫌気性抗生物質を含まない培地に交換する必要があります。問題は、プラスチック製の組織培養プレートに、宿主細胞の付着に存在するか、カバースリップした場合、それは、ポリ-L-リジンまたはゼラチンのような接着剤のコーティングを適用することが望ましいことがあります。また、天然に生成された基底膜様の細胞外マトリックス（ECM）で組織培養皿をコーティングするための技術は、条件^28,29のようなin vivoでの複数で研究者に提供することができます。宿主細胞を溶解することは、細菌の生存能力を変化させることなく、宿主細胞を開くことが可能なバランスのとれた界面活性剤を必要とします。サポニンは、kはしませんが、病気の細菌は、それがいくつかの種の成長を阻害することができます。 P上のサポニンの効果は、我々の研究に先立ってジンジバリスは、それらの増殖/生存に影響を及ぼさないことを確認した宿主-病原体の分析のために使用される菌株。細菌がサポニンを含む洗剤、に非常に敏感である場合は、凍結融解の繰り返し、または蒸留水は、細菌にはほとんど損傷に宿主細胞を溶解するために使用することができます。

第四の臨界点は、顕微鏡実験を行う際に取るべき考慮事項を含みます。最初顕微鏡プロトコルに使用される細菌を標識する蛍光色素の使用です。細菌のための多くの現行の標識方法は、一次抗体またはそのような毒性作用、したがって、高いバックグラウンドを与え、周囲への色素の浸出として重大な制限、との通例の細菌の色素が必要です。 BCECF-AMは、一般的に原核生物と真核生物の^30-32の両方における細胞内pHの蛍光指示薬として使用される膜透過性色素であります。これは、以前の研究^33-35に嫌気性細菌の範囲を標識するのに有効であることが見出されました。 BCECF-AMのみエステル化することのできる生菌にラベルを付けます。変換は、親化合物よりもはるかにゆっくりと細胞外に漏れる蛍光形で細胞内エステラーゼの結果によってBCECFします。 ^36を使用することができる多くの蛍光染料および染色技術があります。しかし、このプロトコルは、ほぼすべての微生物を使用することができ、簡単な固定/染色技術の概要を説明します。加えて、他の染料（TRITCファロイジンおよびDAPI）がより明確に、宿主細胞と相互作用する細菌のみのために、真核細胞およびアカウントの境界を区別するために使用されます。

蛍光色素は光退色に対して感受性である蛍光シグナル³⁷の弱体化を防ぐことができる利用可能ないくつかの商用antifadesと取付媒体があります。メディアAをマウントハードセットとの間の選択肢がありますNDソフト設定したもの。ハード設定のものはかなりの耐火率の変化だけでなく、収縮および組織損傷³⁸になることがありますが、ソフトの設定メディアがカバースリップを確保するために、このようなマニキュアのようなシーラントを必要とします。その後、感染した真核細胞の中で観察された変化に起因します。細胞間の内在化細菌の数は変更される場合がありますので、複数の真核細胞を、分析のために使用されるべきです。我々の研究では、少なくとも40の真核細胞は、実験^33,34ごとに列挙された細菌を評価し、内在化されます。最後に、明らかに単一細胞を可視化するために、感染のために使用される真核細胞がコンフルエンスに成長させることがないようにしてください。上皮細胞とプレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）感染の顕微鏡検査は、宿主細胞膜の特定の領域に対する好みを示し、細菌は上皮細胞が互いに接触しており、何の葉状仮足^{39を有していなかった}部位に付着しないであろう。

リットル顕微鏡の模倣は、低スループットである可能性があります。従って、細菌の侵襲的な性質に大規模な定量的データフローサイトメトリー^40をも使用することができます。この方法は、蛍光標識された細菌の使用を含む（顕微鏡検査に使用される細菌について記載したようにそれを達成することができる）と、いくつかの研究のために魅力的であり得る時に複数のサンプルを研究することを可能にします。

2つのプロトコルの改変は、細菌の宿主細胞の取り込みに関与する経路を同定するために行うことができます。 （1）添付ファイル（2）エントリ/内在化（3）人身売買（4）持続性及び（5）の出口^41：成功した細菌の侵入を5段階で発生します。このように、エントリ/内在化の際に、細菌が宿主に自分自身を見つけ、シグナル伝達を変更するを通じて内在化された宿主細胞を横取り。選択的な代謝の阻害剤は、成功した侵入につながるシグナル伝達の変化を決定するために宿主細胞に加えることができます。ためにアクチン重合を阻害する例ラトランキュリンは、Pの内部移行をどのように影響するか、細胞骨格再構成研究するために使用することができますジンジバリス 。特定の遺伝子をノックダウンすることができる細胞特異的受容体を標的とするsiRNAまたは抗体はまた、細菌の内在化に関与する宿主細胞のシグナル伝達事象のより良い理解のために使用することができます。すべての代謝阻害剤は1が検討されて除いて、宿主細胞に最小限の全体的な影響を持っている必要がありますが、それは阻害剤の治療は細菌の毒性効果を持たないようにすることが重要です。

今後の研究は、おそらく、これらの技術のいくつかを完全な状態のような生体内でより多くを達成することになります。現行品では、いずれかの細菌または宿主細胞は、過酷な環境にさらされています。生物、細胞株、実験の目的に応じていくつかの研究者は、CO _{2インキュベーター中で}上記のプロトコルを実行することを好む場合があります。しかし、歯周病変Sは、細菌がホストと相互作用する嫌気性微小環境を反映しています。嫌気的条件対好気性の下で口腔細菌に挑戦する細胞応答の変化を調べた研究では、下に還元することを酸素分圧（2％酸素）の細菌、 例えば、 タンネレラレンギョウ 、Pを報告しましたジンジバリス 、 および P. インターメディアは、好気的条件下⁴²に比べて、IL-8およびTNFαの高いレベルを誘発しました。嫌気的条件下で生存する真核細胞の能力は、ヒト間葉系幹細胞、ヒトの歯小嚢の幹細胞、ヒト歯肉線維芽細胞、歯肉癌細胞、およびヒト口腔上皮細胞^43,44,45の能力を調べた研究によって確認されました。 WST-1細胞増殖アッセイを使用して我々の研究は、HUVECを無酸素条件下で最大48時間生存することができることを示しました。 P.ので、決定は、嫌気性チャンバー内で細胞を感染させました。 ジンジバリスは、に敏感ですmospheric酸素レベルは、HUVECを嫌気条件下で長時間に耐えることができました。今後の研究は、他の^46で （動脈など）、単層および嫌気性条件の一方の面に酸素を提供するマイクロ流体細胞培養デバイスの実装を調査します。このように条件は、細菌や感染時にホストのいずれかのために犠牲にされることはありません。要約すると、嫌気性細菌のための宿主 - 病原体相互作用を調べるために使用できるいくつかの簡単なプロトコルが記載されています。これらのプロトコルは、タンパク質は、細菌⁴⁷に侵襲的な性質を付与するタンパク質を発現する細菌の侵入^40、ならびに代理非侵襲性細菌を促進し、細菌のインターナの効果を評価するために使用されています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200