Introduction
グルタミン酸は網膜1における主要な興奮性神経伝達物質です。双極細胞2からのグルタミン酸作動性シナプス入力を受けた網膜神経節細胞（RGCを）は、脳に視覚情報を送信する網膜の出力ニューロンです。生理学的研究は、RGCのシナプスの励起がNMDA受容体（NMDARを）およびAMPA受容体（AMPA受容体）3,4,5によってシナプス後部媒介されることを示しました。網膜神経節細胞における興奮性シナプス後電流（EPSCs）はAMPA受容体とNMDARを3,5,6,7,8によって媒介されるが、RGCを上の自発的なミニチュアEPSCs（mEPSCs）が唯一のAMPA受容体媒介成分4,5,9を示します 。しかし、グルタミン酸の取り込みを低減することがRGCの樹状突起上のNMDARをが興奮性シナプスの外側に位置することができることを示唆し、自発EPSCs 5 NMDAR成分を明らかにしました。膜関連グアニル酸キナーゼなどPSD-95など（MAGUKs）はグルタミン酸受容体およびイオンチャネルを含むクラスタの神経伝達物質受容体、シナプス部位でのsが、また明確なシナプス下発現パターン10,11,12,13,14を示します 。
最近の数十年にわたって、共焦点免疫組織化学およびプレ埋め込み電子顕微鏡（EM）免疫組織化学は、膜受容体の発現を研究するために使用されてきました。共焦点免疫染色は、受容体の発現の幅広いパターンを明らかにしているが、その低解像度は、それが不可能な細胞内位置を区別するために使用することができます。哺乳動物の網膜の前埋め込 むEM研究は、NMDARサブユニットはコーン双極細胞のリボンシナプス15,16,17でのシナプス後要素に存在していることを示しています。これは、生理学的証拠には明らかとは対照的です。しかしながら、反応生成物の拡散は、プレ埋め込み免疫法における周知のアーチファクトです。したがって、このアプローチは、通常、統計的に信頼性の高いデータが得られていないとシナプス外膜18,19,20,21対シナプス膜への局在化との間の区別を除外することができます。に一方、生理学的および解剖学的データは、RGCを3,5,7,9,22上のAMPA受容体のシナプス局在と一致しています。したがって、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体とMAGUKsは、シナプス後にもperisynapticまたはシナプス外膜区画にだけでなく、ローカライズされています。しかし、網膜リボンシナプスにおけるこれらの膜タンパク質の高分解能定量分析が依然として必要とされています。
ここでは、NMDARサブユニットのシナプス下局在を調べるために、包埋後のEMの免疫技術を開発し、ラットのRGCにシナプスでのこれらのタンパク質の数、密度および変動性を推定することによって、続いAMPARサブユニットとPSD-95は、コレラ毒素サブユニットB（CTB）を用いて標識逆行性トレーシング方法。
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Protocol
お手入れと動物の取り扱いは、NIH動物実験委員会のガイドラインに従いました。 12時間の明：暗サイクル上丘を介して、左右1から1.2パーセントCTBを注射生後日（P）15-21 Sprague-Dawleyラットは、12で維持しました。
1.網膜組織固定
- 解剖顕微鏡、非常に微細な先端、はさみ、セルロース濾紙、プラスチックピペットと顕微鏡スライドと2鉗子：以下の材料と道具を組み立てます。
- 2.0ミリリットルハロタン（吸入麻酔薬）との密室でラットを麻酔。つま先のピンチの後に後足の撤退の欠如、または瞬目反射の欠如：これらの方法で十分な麻酔を決定します。そして、ギロチンですぐに首を切ります。 pH7.4の0.1Mリン酸緩衝液（PB）に4％パラホルムアルデヒドを含有するガラス皿の中アイリスハサミと場所で目を削除します。
- 解剖顕微鏡を使用して、コーンを除去眼球の前部を切断することにより、EA。鉗子で内網膜面からレンズと硝子体を除去します。
- 網膜は、眼杯から特定されるまで2鉗子で強膜を剥離。
- カミソリで厚さ200μmのストリップ、およびpHシフト固定の対象に - 100にすぐに網膜をカット。
- 室温で20分 - 10のためのpH 10.5で30分間、その後、4％パラホルムアルデヒドを加えた0.01％のグルタルアルデヒド - 20のためのpH6.0の0.1 M PB中4％パラホルムアルデヒドで網膜ストリップを修正しました。
- （4℃でpH7.4）に0.15 mMのCaCl 2をPBで数回洗浄した後、0.1で（30％でO / N、次に、10％、20％、30％、各60分）Mグリセロール網膜ストリップcryoprotect PB置換を凍結する前に。
2.凍結置換
注：この凍結置換法は、以前公開されたプロトコル19,20から変更されています。また、機器が（手袋を着用）非常に冷たいことが重要です。 O楽器で触れたときtherwise、組織が部分的に解凍することがあります。これらの工程の全ては、AFSチャンバー内で行われ、器具は、チャンバの縁の上に移動することができることはありません。同様に、AFSで使用されるすべての化学物質の適切な冷却が必要です。
- EMの凍結保存器（CPC）で-184℃の液体プロパンにおける網膜ストリップをプランジ凍結。細かいブラシを使用して、（ブラシを使用して、余分なバッファをオフに吸い上げる）急落棒の端に行く金属スタブに取り付けられた両面テープの小片にサンプルを置きます。
- 液体プロパンにロッドを急落し、約5秒間そこに保持し、その後、液体窒素で満たされている小型の搬送室を使用した自動凍結置換楽器（AFS）に転送（ 'LN 2は、クライオ移送容器を冷却しました'）。
- AFSに凍結サンプルおよび器具（鉗子やメス）を配置した後、それ自体のためにチャンバ内の機器を冷却しますveral組織に触れる前に、分、または（液体窒素を充填（） 'LN 2は、クライオ移送容器を冷却'）小搬送チャンバ内に数秒間器具の先端を配置することによって、それらを冷却します。
- AFSでたら、細かいメスを使用して、スタブからのサンプルとテープを取り外します。また、窒素ガス流量制御を維持し、TFこれらの手順の間オープン（TFは「LN 2蒸発器のためのレギュレータ制御」と記載されています）。
- （AFSを設定する前に、 すなわち ）フラット埋め込 みホルダーに凍結組織を配置する前に、透明なプラスチックシートから薄い円をカットし、各ウェルの底部を裏打ちするようにホルダーの底部に配置します。これが終わっ重合試料ブロックの比較的容易に除去することができます。
注：以前、私たちはフラット埋め込み所有者に別の方法を使用し、二重ライヘルト+ゼラチンカプセルを採用（ペトラリーアとWenthold、1999を参照してください）。<SUP> 20。 - = 4°C /時間（11.3時間）、T2によって32時間、S1は=上昇温度のためにT1 = -90°C〜-45°Cで50時間、S2のために：AFS（楽器の用語を使用して）で、次の自動シーケンスを使用します。 =、5°C /時間（9時間）で40時間（合計= 142.3時間）のためのT3 = 0°Cの温度を上昇させます。前時限シーケンスを開始する（-90℃で）AFS内のサンプルを配置するために4時間 - それは2を取ることができます。
- AFSで> 32時間、-90℃でメタノール中1.5％酢酸ウラニルで凍結切片を浸し。フラット埋め込みアルミホルダー（AFSに3フィット）で7ウェルのそれぞれに組織の2個（一般的に）を配置します。
- ウェル中の酢酸ウラニル/メタノールへの組織+テープを置き、テープから組織を除去することが非常に困難である場合、直前に浸潤（例えばLowicryl HM20など）先頭包埋媒体に、後でテープを取り外します。
- 次いで、時間当たり-45℃（+ 4℃の温度を段階的に増加させます;自動シーケンスで）。
- 各フラット埋め込むホルダーから古い溶液を除去するために先の細いプラスチックピペットを使用して、その後、予備冷却新鮮なメタノールを追加するために、別の標準的なプラスチックピペットを使用することにより、予冷メタノール中のサンプルを3回洗浄します。
- 1および2：次に、同じ方法を使用して、例えば1で培地（HM20は/メタノールを埋め込むように、低温埋め込み樹脂と徐々にサンプルを浸透2時間、純粋な樹脂に続く2時間、1、それぞれ、その後樹脂を変更しますそして、）O / Nを保ちます。
- ただ、ウェルの上端に到達するために、樹脂のレベルを調整し、翌日再び樹脂を変更します。
- サンプルを重合（-45°C自動シーケンスで0℃まで、時間当たり+ 5℃）40時間、UV光で。
- その後、AFSからのサンプルを削除します。一般的に、サンプルブロックは、まだ色でいくつかのピンク色を示しています。 RT Oでの化学ヒュームフード内の蛍光灯に近いサンプルを、置き/ N以上彼らまでアプリ耳完全にクリア。
3.包埋後のEMイムノゴールド免疫細胞化学
注：23,24,25 に記載のように包埋後の免疫細胞化学を行います。
- 1％トルイジンブルーで1μmのウルトラミクロトームを持つセクション、染色切片を切断し、断面の向きのためにそれらを検討します。切片の最適な横断面を達成するために組織ブロックを向けます。
- ウルトラミクロトームで厚さ70nmの超薄切片をカットし、ホルムバール炭素でコーティングされたニッケルスロットグリッド上にそれらを収集。
- ウォッシュは、トリス緩衝食塩水3回（TBS、0.05 Mトリス緩衝液、0.7％のNaCl、pHは7.6）洗浄した蒸留H 2 Oで1時間をグリッド。
- 30分間、TBS中の5％BSAの20μlの滴でグリッドをインキュベートし、次いでヤギ抗CTB（1：3000）を含む混合物の20μlの滴内の1つのNMDARサブユニット（抗ウサギGluN2A 1時50分にし、抗体を、GluN2B 1：30）、または抗ウサギGluA2 / 3（1：30）2％BSAおよび0.02 MのNaN 3 O / NをRTで有するTBS-トリトン（TBST、0.01％トリトンX-100、pHが7.6）です。
- 5分間TBS（pHは8.2）、続いて10、10、および20分、のためのTBS（pHは7.6）の3つの別々の滴（20μlの）上のウォッシュグリッド。
- TBSTで18 nmの金粒子に結合された10 nmの金粒子とロバ抗ヤギIgG（1:20）に結合されたロバ抗ウサギIgG（1:20）を含有する混合物の液滴に2時間（20μL）のためのグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3で（pHは8.2）。
- 超純水で、その後、5、5、および10分間、TBSの20μlの滴液（pH 7.6）でグリッドを洗浄し、それらを乾燥させます。
- 対比は、それぞれ、暗条件下で8 5分間蒸留水で5％の酢酸ウラニルおよび0.3％クエン酸鉛で2 Oをグリッド。
- 三重標識実験のために、グリッドをインキュベートO /抗ヤギCTBの混合物の20μlの滴（1：3,000）で、室温でN、抗マウスPSD-95（1：100）および抗ウサギGluN2A（1 ：50）。その後、2に2時間のグリッドをインキュベート2％BSAおよび0.02 MのNaN 3との TBSTで18、10、5 nmの金粒子に結合したIgGの混合液（pH 8.2）の0μlの低下。抗体インキュベーションの間および後の洗浄と対比のための二重標識と同じ手順を保管してください。
- コントロールは、二次抗体は、単独で適用された中で行いました。
- ビューグリッドEM上や画像をデジタル化。それが24必要な場合のみ、明るさとコントラストのためのAdobe Photoshopの6.0での最終的な数字を処理します。
4.定量
- 手動でランダムに25,000Xの倍率でIPLの全深さをフォトモンタージュ、8,000X倍率に穴や亀裂なし内網状層（IPL）の領域を選択します。
- 彼らはa）は逆行性輸送CTB信号（大きな金粒子）を含有し、b）の展示、明確に定義された膜は、裂け目、およびシナプス後密度は、c）は、少なくとも二つの小さな金の一部が含まれている場合錐体双極ダイアドでRGCの樹状突起を特定PSD内icles、またはシナプス形質膜に沿って複数の小さな金粒子。
- 定量分析のために、上記の基準に基づいて、55 RGCの樹状突起、 - 45を収集します。
- PSDおよびNIH ImageJソフトウェアを有する個々のRGCの樹状突起のシナプス形質膜の長さを測定します。形質膜26のための9ナノメートル- 7の平均厚さに基づいて、膜関連のような膜を10nm内の金の粒子をカウントします。
- リニアマイクロメートル当たりの金粒子の数（金/μm）と粒子密度を計算します。各金粒子の中心とPSDの真ん中（シナプス場所の場合）または（シナプス外の場所のための）PSDのエッジ間の距離を測定します。
- ソフトウェアにより統計分析を実行します。手段を比較するために両側t検定を使用してください。意義P <0.05を締結。特に断りのない限り、報告値は、として±SEM 18を意味します 。
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Representative Results
以前に24,25説明したように、ここで示された結果は、ラットの網膜におけるRGCの樹状突起上GluA 2/3とNMDARをの著しく異なるシナプス下局在パターンを示しています。 RGC樹状プロファイルでGluA 2/3免疫粒子の77％は、最も中心的なシナプスと同様に、PSD（ 図1A）内に位置していました。しかし、NMDARをは、いずれのシナプスまたはextrasynaptically位置していました。 GluN2Aの免疫金粒子の83％は、PSDに局在した（ 図1C、図2A、図2B）、優先OFFシナプス、及び金粒子でのPSD（ 図2C）の中心に、より濃縮しました。対照的に、GluN2B用粒子標識（96％）の大部分は、端から180 nmのピークの粒子密度と、主にシナプス形質膜に沿って分布PSD（ 図1B、2A、2B）の外側に配置されましたPSD（ 図2B）。特に、GluN2BはONのシナプスに対する選好を示しました。実験のサブセットでは、GluN2A、PSD-95とCTBの同時標識がGluN2AとPSD-95は、PSD-95は下にあったNR2Aは、樹状突起膜にあったOFF RGCの樹状突起（ 図1D）のPSDに共局在していることを示しました膜は、それらがPSDに固定されていることを示唆しています。 perisynaptic膜及びミトコンドリア膜間の金濃度の有意差は、前者（ 図2D）での特異的標識を示唆し、観察されました。
CTBによって標識されたRGC樹状突起にシナプスとグルタミン酸受容体のPerisynapticローカライズを表示図1.免疫金標識 。 （A）：GluA2 / 3（10nmの金）とCTB（18 nm金）の二重免疫標識。シナプス前リボンは矢印で示されています。小GOLD粒子は、PSD RGCのプロセスで（矢印）クラスタ化されています。 （B）GluN2B（10nmの金）とCTB（18 nm金）の二重免疫標識;小さな金粒子（矢印）シナプス形質膜上に存在します。 （C）GluN2A（10nmの金）とCTB（18 nm金）の二重免疫標識。 GluA2 / 3と同様に、小さな粒子は、PSD内でクラスタ化されています。 （D）GluN2Aのトリプル免疫標識（5 nm金）、PSD-95（10nmの金）とCTB（18 nmの金）。 GluN2Aの金粒子（小矢印）とPSD-95の金粒子（大きな矢印）は、個々のCTB陽性RGCの樹状突起上のPSD内で共局在しています。挿入図：PSDの高倍率。スケールバー：0.1ミクロン（A = C = D、B）。これらは、張とダイヤモンド24,25に公表されたデータに基づいて新たな顕微鏡写真である。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
RGC樹状突起におけるNMDARローカリゼーションの 図2. 定量的に比較する。（A）PSD内外GluN2Aた （n = 53プロファイル）とGluN2Bた（n = 56プロファイル）のための免疫の接線方向の分布を示すヒストグラム。 perisynaptic領域は、60 nmのビンに分割しました。 （B）GluN2Aた （n = 53プロファイル）とGluN2Bた（n = 56プロファイル）のための免疫粒子のラベリング密度を示すヒストグラム。 perisynaptic領域は、PSDの縁から180nmのビンに分割しました。 （C）PSD内のラベル付けされたすべてのプロファイルでGluN2Aた （n = 44プロファイル）とGluN2Bた（n = 3プロファイル）のための免疫金粒子の総数の接線分布を示すヒストグラム。 （D）の粒子密度の比較CTB陽性RGCプロセスにおけるそれぞれperisynaptic膜およびミトコンドリア膜におけるGluN2Bた（n = 53と33のプロファイル）とGluN2A（N = 9、30）のための免疫金粒子、。これらのヒストグラムは張とダイヤモンド24,25に発表されたヒストグラムから変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
1）短いと弱い固定、2）、3）ポスト埋め込み免疫染色、および4）定量化置換をフリーズ：私たちは、埋め込み後イムノゴールドEM成功定量するための4つの技術を記載しています。
EMの免疫は、超薄組織切片中の特定のタンパク質の検出を可能にします。金粒子で標識された抗体は、直接EMを使用して可視化することができます。膜受容体のシナプス下局在を検出する際の強力な一方で、EMの免疫は、技術的に困難であること、および組織固定および処理方法の厳密な最適化を必要とすることができます。
膜の完全性及び抗原性の間の最適なバランスを取るために、我々は別の固定方法と時間をテストしました。例えば、中枢シナプス19,20で包埋後のEM NMDARに使用される成功したプロトコルは、網膜にNMDARの免疫反応性を検出することができませんでした。この研究は、に穏やかな固定と短いインキュベーション時間を採用しました強い、長期の固定16後NMDA受容体の抗原性の還元を避けます。
凍結置換法は、まず1990年代初頭27にグルタミン酸受容体の超微細局在化のために開発され、最適な包埋後のの免疫標識に必要な非極性、疎水性樹脂、HM20 28、低温浸潤および重合を含むました。ここで使用される特定の凍結置換法は、蝸牛29にラベリンググルタミン酸受容体のために開発され、中枢シナプス18,19,20,30におけるグルタミン酸受容体のために最適化され、それが近年ではさらに変更されていました。樹脂の低温浸透重合は、熱に不安定な分子の抗原性を保持するのに役立ち、脂質抽出と樹脂と組織19,31の間の有害な化学反応を最小限に抑えます。上記の固定方法と組み合わせることで、この凍結置換法のp良好な抗原性および合理的な構造的保存をrovides。
ここで使用される包埋後の免疫の技術はpreembedding免疫法に比べいくつかの利点を有します。 preembeddingの免疫法は高感度15,16,17,19,20,21を有しているが 、反応生成物の拡散は、非特異的標識26,32に生じる、不可避です。また、ペルオキシダーゼ酵素反応は難しい定量的レセプター18,21-の正確なシナプス下局在を評価すること、21は線形ではありません。包埋後のの免疫方法は、非拡散性マーカーを採用し、拡散性アーチファクトを低減し、より高い空間分解能18,33,34を可能にする樹脂包埋組織の表面に免疫反応を行います。金粒子が直接に可能網膜リボンシンでこれらの受容体の数、密度および変動性を推定すること、さらに、カウントすることができます後陣。また、免疫を包埋後のことは、複数の受容体の局在化が同時にEMレベルで検討することを可能にします。このプロトコルは、正常網膜の桿体双極性シナプス35内の他の膜タンパク質（ 例えば 、GABA受容体およびカルシウム活性化カリウム[BK]チャンネル）の局在を同定するのに使用されてきました。
いくつかの要因が、このプロトコルの成功のために重要です。まず、迅速かつ穏やかな固定が抗原性および微細構造の保全のための最初の重要なステップです。第二に、固定用"のpHシフト」プロトコルは、抗原エピトープとの良好な超微細保全36の最適な検出のために有益です。合理的な微細構造を維持したまま第三に、凍結置換は、受容体の抗原性を保持します。 （トリトンX-100なし）TBS緩衝液を用いている第四に、免疫染色の間、（トリトンX-100を含む）TBST緩衝液は、抗体のインキュベーションで使用され間および抗体のインキュベーション後の洗浄のために。これは、微細構造の変化を最小限にすることができます。第五に、溶液の交換中に、切片を、組織の乾燥に起因するアーチファクトを低減するために湿潤に保たれます。
ここで説明する包埋後のの免疫プロトコルは網膜リボンシナプスでの膜受容体を同定するための改良された方法を提供するが、それは免疫組織化学的方法をpreembeddingほど敏感ではありません。彼らは比較的低い特異性に苦しむと上記のように定量化にはあまり適しているので、後者は良いオプションではありません。我々のプロトコルは、免疫標識のために準備しない強く固定組織と比較して、ある程度の微細構造を損ないます。うまくいけば、将来の技術革新は、これらの制限を克服します。
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Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所の難聴やその他のコミュニケーション障害に関する神経疾患・脳卒中研究所（NINDS）と国立研究所（NIDCD）、（NIH）の学内プログラムによってサポートされていました。私たちは、NINDS EM施設と支援のためのNIDCD高度なイメージングコア（コード＃ZIC DC 000081から03）をお願いいたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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