Protocol
Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche Tiere hierin unterliegen den Regeln und Vorschriften des UNC - Ausschusses für Tierpflege und NIH - Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren detailliert beteiligt sind .
1. Herstellung und Beschichtung von Dissociated kortikalen Neuronen
- Euthanize timed-trächtige Weibchen durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte. Entfernen Sie ganze Gehirn aus den Schädeln embryonaler Tag 15.5 (E15.5) Mäuse und microdissect Rinden von jeder Hemisphäre. Eine ausführliche Anleitung über die Mikrodissektion von embryonalen Maus Kortex bitte Viesselmann et al 8 zu sehen.
- Legen nicht mehr als 4 cortices in 1 ml Sezieren Medien in einem sterilen 1,6 ml Microtube. In 120 ul 10x Trypsin und wird das Röhrchen 3 bis 5-mal zu mischen.
- Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen Zellen Zellkulturschalen auf Saatgut. Anmerkung: 1 kortikalen Hemisphäre liefert ca.oximately drei Millionen Zellen.
- Für die SDS-resistenten SNARE-Komplex Biochemie Assay Platte sechs Millionen Zellen pro 35 mm-Schale und verwenden zwei Gerichte pro Zustand. Hinweis: Dies wird durch Verwendung von 6-Well-Platten wird vereinfacht, wenn mehrere Bedingungen zu vergleichen.
- Für Verzweigungs Assays Platte Neuronen auf Salpetersäure gewaschen Kreisdeck bei einer Dichte von 250.000 Zellen pro 35 mm-Schale, für die DIC-Bildgebung von Axon Verzweigung Platte mit einer Dichte von 150.000. Diese Dichten vermeiden Übervölkerung und Analyse zu vereinfachen.
- Für die Live-Zelle TIRF Mikroskopie, resuspendieren zwei Millionen Neurone pro Transfektion in Nukleofektion Lösung bei RT.
- Zugabe von 100 ul Zellsuspension zu Microtube 10 ug VAMP2-pHlourin Expressionsplasmid enthält , und mit einem elektroporieren Nucleofector nach Herstellerprotokoll 9.
- Nach Transfektionen sofort 500 ul Trypsin Löschmedium hinzufügen, entfernen Suspension von Küvetten und Platte Zellen in einer Höhlesität von 400.000 Zellen pro 35 mm PDL-beschichtete Glasbodenschale.
- Platte alle kortikalen Neuronen in 2 ml Serum-freien Medien.
2. SNARE-Komplexbildung Assay
Hinweis: SDS-resistenten SNARE - Komplexe wurden verarbeitet und analysiert , wie ursprünglich 10 beschrieben mit den Änderungen , die nachstehend beschrieben. Für validierte alternative Antikörper gegen die hier verwendet wird, finden Sie im Abschnitt Materialien.
- Stimulieren E15.5 kortikalen Neuronen 2 Tage in vitro (DIV) mit 250 ng / ml Netrin-1 oder Schein - Kontrolle für 1 Stunde vor der Lyse.
- Vor der Verarbeitung von Proben, kühle Zentrifuge bis 4 ° C, und setzen Wasserbadtemperatur auf 37 ° C und Wärmeblock auf 100 ° C.
- Entfernen Sie Zelle Gerichte aus Inkubator und auf Eis.
- Absaugen Medien aus Zellen, ersetzen mit ~ 2 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) sanft 2 mal mit 1 - 2 min pro Wasch.
- Für diesen Test verwenden zwei Vertiefungen pro Ltgition.
- Absaugen PBS aus der ersten Vertiefung einer Bedingung und ersetzen mit 250 ul Homogenisierungspuffers. Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann eine Zelle Lifter, homogenisieren Zellen auf Eis.
- Saugen Sie das PBS aus dem nächsten gut von den gleichen Bedingungen und zu der auch die vor kurzem homogenisierte Mischung. Dies wird die Proteinkonzentrationen erhöhen. Wiederholen Sie dies für alle Bedingungen.
- Nach der Fertigstellung homogenisiert Pipettenlösung auf ein vorgekühltes 1,6 ml Mikroröhrchen auf Eis und füge 20% TritonX-100 auf eine Endkonzentration von 1% TritonX-100 zu erreichen. 10-mal mit 1000 ul Pipette Man reibt mischen, während Blasen zu minimieren.
- Die Röhrchen auf Eis für 2 min, um Proteine zu solubilisieren. Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 6010 rcf bei 4 ° C pelletiert nicht-solubilisierten Material. Bewegen Sie Lysatüberstand in neue gekühlte 1,6-ml-Röhrchen auf Eis.
- Führen Proteinkonzentration Analyse unter Verwendung von Bradford - Test 11 und verdünnten Proben auf eine final Proteinkonzentration von 3 bis 5 mg / ml mit Puffer-Rest Homogenisieren, supplementiert mit 1% TritonX-100 und 5-fach Probenpuffer, ergänzt mit B-Mercaptethanol (BME).
- Teilen Sie jede experimentelle Probe gleichmäßig in zwei Röhren. Inkubieren einer Probe bei 37 ° C für 30 min (SNARE-Komplexe), und das andere bei 100 ° C für 30 min (SNARE Monomere). Invert Röhren intermittierend Proben in Lösung zu halten.
- Frieren Proben bei -20 ° C bis bereit, über SDS-PAGE zu trennen. Vor der Proben mittels Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden, Aufkochen vorher gekochten Proben für 5 min bei 100 ° C, aber auftauen 37 ° C Proben bei RT.
- Führen Sie Duplikate der Proben (30 - 40 & mgr; g Protein pro Probe) sowohl auf einem 8% und 15% Gel; die 8% bietet ideale Abtrennung des Komplexes, während die 15% verwendet wird SNARE-Protein-Monomere (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, Syntaxin-1 ~ 35 kDa) zu quantifizieren. Pflegen Stromquelle bei 70 V bis der Farbstoff Linie durch die stac istKönig Gel und Erhöhung Spannung 90V. Führen Sie Gele, bis der Farbstoff abläuft.
- Um Monomere zu erhalten, übertragen Proteine bis 0,2 um Nitrocellulosemembran auf Eis mit kaltem Transferpuffer mit 20% Methanol (MeOH) zugegeben, bei 70 V für 45 min.
- Dry Membran in einer Schale mit Deckel für 2 Stunden auf O / N bei RT (O / N liefert die besten Ergebnisse).
- Block SNARE-Komplex-Membranen in 10% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei RT.
- Bereiten Sie primäre Antikörper (Erkennung spezifischer SNARE-Komplex-Komponenten) in einer Verdünnung von 1: 1000 und Sonde O / N bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler.
- Spülen Blots in Tris-gepufferter Salzlösung plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 mal für jeweils 5 Minuten.
- Bereiten Sie fluoreszierenden sekundären Antikörperlösungen in einer Verdünnung von 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T und Sonde für 1 Stunde bei RT abgedeckt. Wiederholen Sie Schritt 2.12.1 nach 1 Stunde.
- Bild Flecken auf einem fluoreszierenden Scan-Maschine mit Software Suite ausgestattet und zu quantifizieren, sowohl die SNARE-Protein complex (immunoreaktive Banden oberhalb 40 kDa) und Monomer Bänder (immunoreaktive Banden bei 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa für SNAP-25, Syntaxin und VAMP2-1 bezeichnet) unter Verwendung von Anweisungen des Herstellers zum Zeichnen rechteckigen ROIs.
3. Imaging Exozytose-Events über TIRF Mikroskopie
Hinweis: Dieses Protokoll erfordert spezielle Mikroskopie Ausrüstung einschließlich einer Klimakammer Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2, ein umgekehrtes TIRF - Mikroskop ausgestattet mit einer epifluoreszenten Beleuchtung, hoher Vergrößerung / hoher numerischer Apertur (NA) TIRF Ziel, eine automatisierte XYZ - Plattform zu halten und ein empfindliches Charge Coupled Device (CCD) -Detektor. Dieses Protokoll verwendet einen vollständig inverses Mikroskop mit einem 100x 1.49NA TIRF Ziel einen festen Zustand 491-nm-Laser und einem Elektronenvervielfachungs CCD (EM-CCD) ausgestattet automatisiert. Alle Geräte werden durch Bildgebung und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Beginn der Bildgebungsprotokoll Leistung auf der environmental Kammer, Bühne, Lampe, Computer und Kamera.
- Wählen Sie Ziel innerhalb Imaging-Software. Sobald das Ziel vorhanden ist, befestigen Sie den Objektivheizer um den Kragen.
- Bestätigen Sie, dass Ziel abgesenkt wird vollständig, bevor die Bühne Inkubator in der Stufe Schlitz zu sichern. Gießen Sie destilliertes Wasser in die Stufe Inkubator Einlässe gleichmäßig Spill zu verhindern.
- Schalten Sie das Inkubationssystems. Öffnen Sie das Ventil in die CO 2 Tank und bestätigen der Druck für das System den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Warten Sie einige Zeit Kammer zu erreichen , 5% CO 2 und 37 ° C. Vor der Zugabe des Abbildungsschale, legen Sie eine leere Schale in den Inkubator Kondensation von Wasser auf dem Ziel zu vermeiden.
- Einschalten der Laserquelle.
- Offene Bühne Inkubator und Sionsöl auf die Linse hinzuzufügen. Legen Probe in Inkubator und zu stabilisieren, mit Stabilität Armen oder einem Teller Gewicht. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit dem Boden der Probe macht. switch Durchlichtbeleuchtung und neuronale Fokusebene durch die Okulare finden.
- Starten Lasersoftware und eine Verbindung mit dem Lasersteuerungssoftware. Set Beleuchtung Weitfeld ein und wählen Sie das Ziel verwendet wird (100X 1,49 NA TIRF wird empfohlen). Eingestellt Brechungsindex der Probe (Zellen ~ 1,38). Passen Laserintensität von "TTL" für die 491-nm-Laser deaktivieren. Stellen Sie den Schieberegler auf 100 dann bringen sie zurück nach unten auf einen Wert zwischen 20 bis 40%. Überprüfen Sie nochmals "TTL".
- Konzentrieren Sie sich auf Probe wieder in Durchlichtbeleuchtung. Zum Imaging-Software und wählen Sie 491-nm-Laserbeleuchtung und offener Blende. Die Feineinstellung der Brennpunkt des Lasers an der Decke und in der Mitte den Punkt zu der Mitte des geschlossenen Feldblende mit dem Kühler entfernt. Legen Kondensator Oberseite nach unten auf der optischen Bank, um nicht zu kratzen Objektiv.
- Ersetzen Kondensator und gehen Sie zu TIRF-Software und stellen Eindringtiefe (PD) bis 110 nm. Wechseln Sie von Weitfeld-Beleuchtung zu TIRF illumination Modus für die Bildgebung.
- Finden VAMP2-phluorin Zellen durch die Okulare mit Weitfeld- Epifluoreszenz mit epifluoreszenten Lichtquelle zum Ausdruck.
- Justieren Sie Bildparameter (Belichtungszeit, Verstärkung und Laserleistung) zu maximieren Signal-Rausch-Verhältnis und der Dynamikbereich Intensität die minimale Belichtungszeit und Laser Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren (zum Beispiel: Exposition zwischen 50 bis 100 ms, mit einem 15 - 30 bei 30% gewinnen maximale Laserleistung).
- Stellen Sie den Serienautofokus pro Zelle. Erwerben Sie ein Timelapse Bild gesetzt mit dem Erwerb alle 0,5 Sekunden für 5 Minuten auftreten. Für die Netrin-1 stimuliert Zustand, 500 ng / ml Netrin-1 zu Schale von Zellen in einer Laminar-Flow-Haube und Rück die Schale in den Inkubator für 1 Stunde vor der Bildgebung.
- Die Häufigkeit der Exozytose - Ereignisse pro Zelle Fläche und der Zeit, offen Bildstapel in ImageJ , indem Sie die Datei in das Fenster oder gehen Sie zu Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung normalisiert zu quantifizieren0; 2A Inset 1).
- Durchschnittliche Intensität: Um eine stabile Fluoreszenzsignale zu entfernen, die eine durchschnittliche z Projektion des gesamten Stapels mit Bild> Stapel> Z-Projekt> Projektionstyp nicht Vesikelfusion Ereignisse darstellen, erstellen. Subtrahieren dieses mittlere Bild von jedem Bild im Timelapse mit Prozess> Bild Rechner> Bild1: Ihr Stack-Betrieb: subtrahieren Image2 neu geschaffenen Durchschnitt z Projektion. Dies unterstreicht Exozytose - Ereignisse (2A Inset 2 - 3).
- Graf Exozytose-Fusionsereignisse mit dem Auge. Exozytose - Ereignisse werden als das Auftreten eines beugungsbegrenzten Fluoreszenzsignal definiert , das schnell diffundiert als VAMP2-phluorin diffundiert innerhalb der Plasmamembran (2A Inset 6).
- Verwenden Sie den Befehl Schwellenwert das erste Bild unter Verwendung von Bild zu markieren> Anpassen> Schwelle> einstellen Regler , bis die gesamte Zelle Schwelle markiert (2A Inset 7 - 8).
- Unter AnaLyze, wählen SetMeasurements und überprüfen Bereich und Anzeige Etikett. Wählen Sie den schwellenZellBereich mit dem Zauberstab - Tracing - Tool und klicken Sie auf 'm' zu messen (2A Inset 7 - 8).
- Transfer - sowohl die Exozytose - Fusionsereignisse zählen, die Zellbereichsmessungen und die verstrichene Abbildungszeit in ein Tabellenkalkulations Anzahl von Exozytose - Ereignisse / mm 2 / Zeit (2A Inset 9) zu berechnen.
4. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Timelapse Mikroskopie von Axon Branching
Hinweis: Eine vollständige Protokoll und Demonstration für einen allgemeinen Ansatz zur DIC - Bildgebung 12 zur Verfügung steht. Während dieses Protokoll DIC nutzt, andere Durchlichtmikroskopie Methoden für die gleichen Zwecke werden können (: Phasenkontrast zum Beispiel) verwendet.
- Bei 2 DIV, Ort Glasboden Bildgebung Schale untransfizierten Neuronen in vorgewärmten Klimakammer, die eine feuchte env zu haltenironment mit 5% CO 2 und 37 ° C. Nutzen Sie ein Mikroskop mit einem 60x Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC Objektivlinse und hoher NA Kondensator für beste Bildqualität und Auflösung.
- Stellen Sie die Fokusebene zu finden Neuronen durch die Okulare Durchlichtbeleuchtung verwendet wird.
- Mit Hilfe der Multizonen-Erfassungsfunktion auf Imaging-Software, zu finden und die XYZ-Positionen von mindestens 6 Zellen speichern. Positionieren Sie die Bühne, so dass Neuronen von Interesse passen in das Sichtfeld für die besten Ergebnisse.
- Stimulieren Sie mit 250 ng / ml Netrin-1 und drücken Sie "Start Multizonen-Akquisition". alle 20 s für 24 Stunden erwerben Sequenziell Bilder an jeder Position, pausieren Erwerb und Refokussierung wie nötig.
- Überprüfen Sie Bilder in Imaging-Software Apps verwenden> Überprüfen Sie Multi Dimensional Daten> öffnen Dateinamen. Identifizieren stabiler Axon Zweige (20 & mgr; m lang), dass Form während der Imaging-Sitzung. Verwenden Sie die Linienzeichenwerkzeug eine stableaxon branc zu messenh von der Basis an der Axon an der Spitze, um sicherzustellen, die 20 & mgr; m Länge Qualifikation erfüllt ist.
- In einer Tabelle, die Rahmennummer nach Netrin Stimulation aufzuzeichnen, wenn Membranausstülpungen in Bereichen initiieren, wo Äste später sowie die Rahmennummer nach Netrin Stimulation bilden, wenn sie im Entstehen begriffenen Zweige 20 & mgr; m in der Länge erreichen.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der Frames zwischen Vorsprung und Zweigbildung um 20 sec die Bildungszeit pro Zweig zu berechnen.
5. Toxin Manipulations und fixierte Zell Immunofluoreszenz
- Bei 2 DIV, behandeln Neuronen in Versuchsbedingungen mit 250 ng / ml Netrin-1 und / oder 10 nM Botulinum A - Toxin (BoNT), die spaltet die SNARE - Protein SNAP25 und SNARE wirksam hemmt Exozytose 13, plus 250 ng / ml netrin- 1. Lassen Sie eine Reihe von unbehandelten Neuronen als Kontrollbedingung.
ACHTUNG: BoNTA erfordert den Einsatz von Augen und Atemschutz bei Herstellung und VerwendungLösungen. Pflegen Sie alle kontaminierten Materialien als infektiöses Material und Autoklaven so schnell wie möglich. - Bei 3 DIV (24 Stunden nach der Behandlung) absaugen Medien und sofort mit mindestens 1 ml PHEM fix (siehe Tabelle 1 für weitere Details) ersetzen erwärmt auf 37 ° C. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei RT.
- Spülen Sie 3x mit PBS (für die zukünftige Verwendung Dichtung mit Parafilm und lagern bei 4 ° C).
- Ort Deckgläser in dunklen, befeuchteten Färbung Kammer und Permeabilisierung der Zellmembranen für 10 min in frisch verdünnten 0,2% TritonX-100 in PBS (hergestellt aus 10% TritonX-100-Lager).
- Entfernen Permeabilisierung Lösung und Spülen mit 50 ul 1x mit PBS. Block für 30 min in ~ 50 & mgr; l von 10% Rinderserumalbumin in PBS (BSA-PBS) oder 10% Gekochte Eselserum in PBS bei RT.
- Spülen Sie mit 1x PBS wieder. Inkubieren Deckgläser in 50 & mgr; l des primären Antikörpers: in 1% BSA-PBS für 1 h bei RT (1 1.000 βIII Tubulin, neuronale Identität zu bestätigen), im Dunkeln.
- Führen Sie 3x 5 min Waschen in PBS. Inkubieren Deckgläser in 50 ul spektral unterschiedliche Sekundärantikörper für Tubulin (1: 400), und Fluoreszenz Phalloidin (je nach Anregung: 488 Phalloidin bei 1: 400, 647 Phalloidin bei 1: 100) in 1% BSA-PBS für 1 Stunde .
- Waschen 3x 5 min in 1x PBS und montieren Deck auf Objektträger in Montage Medien.
- Vakuum überschüssige Eindeckmedien von den Rändern des Deckglases und Dichtung mit klarem Nagellack.
- Sammeln Sie Weitfeld- Epifluoreszenz- Bilder auf einem inversen Mikroskop mit einem 40x 1.4NA Ziel, epifluoreszenten Fähigkeiten und EM-CCD.
- Manuell analysieren ImageJ Verzweigung verwenden. Öffnen Bildstapel in ImageJ indem Sie die Datei in das Fenster ziehen oder auf Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung 4A Einschub 1).
- Mit line> segmentierte Linie, verfolgen Sie die Axon, als die längste Neuriten erstreckt definiert von der soma (4A Einschub 2 - 3).
- Mit Analysieren> Tools> ROI-Manager, speichern Sie die Axon als eine Region von Interesse zu verfolgen. Trace und jedes Axon Zweig speichern, definiert als Neuriten ≥20 & mgr; m in der Länge. Nur primäre Zweige (Auswüchse direkt aus dem Axon sprießen) in der Analyse (Abbildung 4A Einsatz von 3 bis 4).
- Drücken Sie 'm' die gespeicherten Bereiche von Interesse zu messen und übertragen Längen in Pixeln in eine Tabelle, die Länge in & mgr; m zu berechnen.
- Unterteilen, die Anzahl der Zweige axon ≥20 um in der Länge, um die Länge des Axons in & mgr; m geteilt durch 100 Anzahl der Axon Verzweigungen pro 100 & mgr; m Länge erhalten.
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Representative Results
Verwendung in vitro biochemischen Techniken , um die Menge von SDS-resistenten SNARE - Komplexe in einer Population von Neuronen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt die resultierende Western - Blot nach Beendigung der SDS-resistenten SNARE - Komplex Assay für SNAP-25 sondiert, syntaxin1A und VAMP2.
TIRF - Mikroskopie an der basalen Zellmembran liefert hochauflösende Bilder von einzelnen Exozytose - Fusionsereignisse in einzelnen Zellen. 2A die Bildanalyse - Methodik zur Identifizierung von VAMP2-phluorin vermittelten Exozytose - Ereignisse zeigt. Der Einschub zeigt ein einzelnes Exozytose - Ereignis als Vesikelfusion auftritt und als VAMP2-phluorin diffundiert innerhalb der Plasmamembran. 2B zeigt ein Beispiel eines Exozytose - Ereignis über die Zeit auftritt (Sekunden) in einem kortikalen Neuron. Gezoomte Einsätze bezeichnen die soma, ein Axon Zweig und einen axonalen Wachstumskegel die spati zeigtal Nützlichkeit dieses Assays. Kreise bezeichnen einzelne Exozytose-Fusionsereignisse, die über die TIRF-Mikroskopie zu sehen ist.
Timelapse DIC - Bildgebung von Netrin stimuliert Axon Verzweigung den Zeitpunkt der Axon Zweigbildung zeigt. Abbildung 3 zeigt die Bildung eines Axons Niederlassung in Echtzeit folgende Netrin Stimulation. Weiße Pfeile bezeichnen den anfänglichen Vorsprung von einem Zweigstellenstandort. Schwarz Pfeilspitzen bezeichnen einen voll ausgebildeten, stabilen Zweig von mindestens 20 um von der Haupt Axon an die Zweigspitze zu messen. Netrin abhängige Erhöhungen der Axon Verzweigung auftritt folgenden Netrin abhängige Anstiege in Exozytose-Fusion.
Feste Zelle Immunzytochemie mit pharmakologischen Hemmung der SNARE - Aktivität kombiniert zeigt , dass SNARE - vermittelten Exozytose ist eine Voraussetzung für die kortikale Axon verzweigen. 4A, umreißt eine Schritt für Schritt Prozess der Niederlassung Kurven perfo RMED in ImageJ. 4B zeigt repräsentative Bilder von kortikalen Neuronen bei 3DIV. Die Bedingungen sind wie folgt: unbehandelt, mit 250 ng / ml stimuliert Netrin oder mit BoNTA und 250 ng / ml Netrin für 24 h behandelt.
Abbildung 1. Die SDS - Widerstand von SNARE - Komplexen als quantifizierbare Metric von SNARE - Formation in vitro unter Verwendung. Eine repräsentative Western Blot sondiert für SNARE - Komplex Mitglieder VAMP2, Syntaxin1A und SNAP-25 und die Ladekontrolle BIII Tubulin. Sowohl SNARE - Proteine in komplexen und identifizierbare Monomere werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Live Cell Imaging und Quantifizierung von Exozytose Vesikelfusion Events in kortikalen Neuronen. (A) Schritt für Schritt Umriss der Exozytose Vesikelfusion Bildanalyse , wie sie manuell wurde mit ImageJ ausgeführt. (B) Inset Tafeln zeigen eine einzelne VAMP2-pHlourin Vesikelfusion Ereignis , wie es im Laufe der Zeit auftritt. Die zweite Platte eine TIRF-Mikroskopie Bild eines ganzen kortikalen Neuronen exprimieren VAMP2-pHlourin bei 2cm kennzeichnet. Die gestrichelte Linie Kästchen bezeichnen die Bereiche von Interesse, wie unten dargestellt: soma, Axon Zweig und ein axonalen Wachstumskegel. Kreise mit den Regionen von Interesse bezeichnen einzelne Vesikelfusion Veranstaltungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Long Term Live Cell DIC Imaging enthüllt Zeitpunkt der Netrin-1 - abhängige Axon Branching. DIC lebenden Zellen Bilder eines kortikalen Neuronen , die Bildung von Axon Niederlassungen in Reaktion auf Netrin Stimulation zeigt. Weiße Pfeile bezeichnen Punkte der anfänglichen Vorsprung vor dem Neuriten 20 & mgr; m in der Länge zu erreichen. Schwarz Pfeilspitzen bezeichnen Bonafide Zweige (Länge ≥20 & mgr; m). Zeit bezeichnet als Stunde: Min . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Feste Zellimmunfluoreszenz mit Toxin Hemmung der Exocytosis Gekoppelt Zeigt , dass Exocytosis für erforderlich ist Netrin-1 - abhängige Axon verzweigen. (A) Übersicht über die Verfolgung und Analyseschritte zur Quantifizierung von Axon in einem Netrin Verzweigung kortikalen Neuronen bei 3DIV stimuliert. (B) Repräsentative Bilder von kortikalen Neuronen bei 3DIV jeder experimentellen Bedingung: unbehandelt, stimuliert mit 250 ng / mL Netrin, oder mit 10 nM BoNTA Toxin behandelt plus 250 ng / ml Netrin. Grün ist F-Actin (Phalloidin), rot βIIItubulin ist. Bezeichnen Pfeile Punkte Axon Zweige ≥20 & mgr; m in der Länge. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Lösung | Rezept |
| Homogenisierungspuffer | 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4,150 mM NaCl, 1 mM EGTA. Außerdem notwendige Protease und Phosphatase-Inhibitoren abhängig von Zelltyp |
| 2x Probenpuffer | 60 mM Tris-HCl pH 6,75, 5% (v / v) fI-Mercaptoethanol, 2% (w / v) SDS, 10% (w / v) Glycerin, 0,007% (w /v) Bromphenolblau |
| PHEM Fixiermittel | 60 mM PIPES pH 7,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 10 mM EGTA pH 8,0, 2 mM MgCl 2, 0,12 M Sucrose, 4% PFA |
| Eindeckmittel | 20 mM TRIS pH 8,0, 0,5% N-Propylgallat, 90% Glycerol hoher Qualität, MilliQ H 2 O |
| 10X SDS Laufpuffer | Man löst 30,0 g Tris - Base, 144,0 g Glycin und 10,0 g SDS in 1000 ml H 2 O, pH 8,3. Verdünnen auf 1x. |
| 10X Transferpuffer | Man löst 30,3 g Tris 250 mM und 144,1 g Glycin für 1,92 M Lösung in 1 l H 2 O; (für 1 L 1x Puffer 100 ml 10x Lösung zu 200 ml MeOH hinzu und 700 ml kaltem DI H 2 O) |
| Serum freie Medien (SFM) | 50 ml: 0,5 ml L-Glutamin, 1 ml B27, 48,5 ml Neurobasal Medium |
| Trypsin ABSCHRECKMITTEL (TQM) | 50 ml: 0,5 ml L-Glutamin, 2,5 ml FBS, 47 ml Neurobasal Medien |
| Trisgepufferte Saline | 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl in 1 l H 2 O; (Für TBS-T 1 ml Tween-20) |
Tabelle 1. Lösungen
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Acknowledgments
RO1-GM108970 (SLG) und F31-NS087837 (CW): Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well tissue culture treated plates | Olympus Plastics | 25-105 | |
| glass coverslips | Fisher scientific | 12-545-81 | 12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells. |
| Amaxa nucleofection solution | Lonza | VPG-1001 | 100 ml/transfection |
| Amaxa Nucleofector/electroporator | Lonza | program O-005 | |
| 35 mm Glass bottom live cell imaging dishes | Matek Corporation | p356-1.5-14-C | must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells |
| Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope | Olympus | ||
| Lambda LS xenon lamp | Sutter Instruments Company | ||
| Environmental Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| 100x 1.49 NA TIRF objective | Olympus | ||
| Andor iXon EM-CCD | Andor | ||
| Odyssey Licor Infrared Imaging System | LI-COR | Odyssey CL-X | Used for scanning blots |
| Image studio software suite | LI-COR | Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots | |
| Metamorph for Olympus | Molecular devices, LLC | version 7.7.6.0 | Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse |
| CELL TIRF control software | Olympus | Software used to control lasers for TIRF imaging | |
| Fiji (Image J) | NIH | ImageJ Version 1.49t | |
| 60x Plan Apochromat 1.4 NA objective | Olympus | ||
| 40x 1.4 NA Plan Apochromat objective | Olympus | ||
| Neurobasal media | GIBCO | 21103-049 | Base solution for both serum free and trypsin quenching media |
| Supplement B27 | GIBCO | 17504-044 | 500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media |
| L-Glutamine | 35050-061 | 1 ml/50 ml Serum free media | |
| Bovine serum albumin | Bio Basic Incorporated | 9048-46-8 | 10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes. |
| 10x trypsin | Sigma | 59427C | |
| HEPES | CELLGRO | 25-060-Cl | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg | Corning | 21-030-cm | |
| Fetal bovine serum | Corning/CELLGRO | 35-010-CV | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning/CELLGRO | 20-021-CV | |
| NaCl | Fisher scientific | BP358-10 | |
| EGTA | Fisher scientific | CAS67-42-5 | |
| MgCl2 | Fisher scientific | BP214-500 | |
| TRIS HCl | Sigma | T5941-500 | |
| TRIS base | Fisher scientific | BP152-5 | |
| N-Propyl Gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| Glycerol Photometric grade | Acros Organics | 18469-5000 | |
| Glycerol (non optics grade) | Fisher scientific | CAS56-81-5 | |
| B-mercaptoethonal | Fisher scientific | BP176-100 | |
| SDS | Fisher scientific | BP166-500 | |
| Distilled Water | GIBCO | 152340-147 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-7886 | Dissolved in sterile water at 1 mg/ml |
| Botulinum A toxin BoNTA | List Biological Laboratories | 128-A | |
| Rabbit polyclonal anti human VAMP2 | Cell signaling | 11829 | |
| Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A | Santa Cruz Biotechnology | sc-12736 | |
| Goat polyclonal anti human SNAP-25 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7538 | |
| Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin | Covance | MMS-435P | |
| Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647 | Invitrogen | ||
| LI-COR IR-dye secondary antibodies | LI-COR | P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022 | 800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat |
| 0.2 μm pore size nitrocellulose membrane | Biorad | 9004-70-0 | |
| Tween-20 | Fisher scientific | BP337-500 | |
| Methanol | Fisher scientific | S25426A | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B5525-5G | |
| Sucrose | Fisher scientific | S6-212 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | O-4042-500 | |
| Triton-X100 | Fisher scientific | BP151-500 | |
| TEMED | Fisher scientific | BP150-20 | |
| 40% Bis-Acrylimide | Fisher scientific | BP1408-1 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alternative Validated Antibodies | |||
| Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone | Sigma Aldrich | S0664 | |
| Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2) | Synaptic Systems | 104-211 | |
| Mouse Monoclonal SNAP25 | Synaptic Systems | 111-011 |
References
- Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
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