Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo's

Published: February 19, 2016 doi: 10.3791/53747
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2Center for Human Disease Modeling, Duke University Medical Center

Summary

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Abstract

De snelle proliferatie van cellen, de weefsel-specifieke expressie van genen en het ontstaan ​​van signaleringsnetwerken karakteriseren vroege embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren. De kinetiek en de locatie van de signalen - zelfs binnen enkele cellen - in het zich ontwikkelende embryo een aanvulling op de identificatie van belangrijke ontwikkelingsstoornissen genen. Immunokleuring technieken beschreven die is aangetoond dat de kinetiek van intracellulaire en hele dieren signalen structuren zo klein als primaire cilia definiëren. De technieken voor het fixeren, beeldvorming en verwerking beelden met behulp van een laser-scanning confocale microscoop verbinding kan in slechts 36 uur worden voltooid.

De zebravis (Danio rerio) is een gewenst organisme voor onderzoekers die proberen om studies uit te voeren in een gewervelde soorten die betaalbaar is en voor de menselijke ziekten tegen te gaan. Genetische knockouts of knockdowns moet worden bevestigd door het verlies van de werkelijke eiwit product. Deze bevestiging van eiwitverlieskan worden bereikt met de hier beschreven technieken. Aanwijzingen in signaalroutes kunnen worden ontcijferd door gebruik van antilichamen die reageren met eiwitten die post-translationeel zijn gemodificeerd door fosforylering. Het behoud en het optimaliseren van de gefosforyleerde toestand van een epitoop is daarom van cruciaal belang voor deze vaststelling en wordt bereikt door dit protocol.

Deze studie beschrijft technieken voor embryo vast gedurende de eerste 72 uur van ontwikkeling en co-lokaliseren verschillende relevante epitopen met trilharen in Kupffer de blaasjes (KV), de nieren en het binnenoor. Deze technieken zijn eenvoudig, hoeft dissectie vereisen en kan in een relatief korte tijd worden voltooid. Projecteren image confocale stacks in een enkel beeld is een nuttig middel van de presentatie van deze gegevens.

Protocol

De zebravis procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Virginia Commonwealth University.

1. Bereiding van reagentia

  1. 4% PFA / PBS. Weeg 8 g paraformaldehyde (PFA) in de zuurkast. Hoewel nog steeds in de zuurkast, Los de droge PFA in ~ 80 ml ​​gedestilleerd H 2 O onder roeren en verwarmen tot 50 ° C. Voeg al roerend 3-10 druppels verse 1N NaOH totdat PFA volledig is opgelost en oplossing verduidelijkt. Haal van het vuur en voeg 100 ml 2x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng het volume op 200 ml met gedestilleerd H2O Afkoelen tot kamertemperatuur en bevestigen pH van 7,4 voor gebruik. Bewaren in het donker bij 4 ° C, maar binnen één week.
  2. Gebruik 100% methanol zonder supplementen. Gebruik 95% ethanol zonder supplementen.
  3. Bereid fosfaat gebufferde Tween (PBT). Supplement fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,1% Tween-20. Voeg 0.5 ml van een 20% Tween-20 stockoplossing aan 100 ml 1x PBS. Bewaar bij kamertemperatuur.
  4. Bereid fosfaat gebufferde Triton-X (PBTx). PBS aangevuld met 0,1% Triton X-100. Voeg 0,5 ml van een 20% Triton X-100 bouillon aan 100 ml PBS. Bewaar bij kamertemperatuur.
  5. Bereid 10% NGS / PBTx. Normaal geitenserum (NGS) blokkeert aspecifieke bindingsplaatsen. WINKEL NGS in aliquots bij -20 ° C. Om gebruik te maken, voeg 1 ml tot 9 ml PBTx.
  6. Bereid 50% glycerol / PBS. Meng gelijke delen van 2x PBS en 100% glycerol. Bewaar bij kamertemperatuur.

2. Embryo Fixatie

  1. . (Bijv., Β-actine: CAAX-GFP) vermeerderingsbedrijf verkrijgen wild type (AB en WIK) of transgene embryo's door middel van natuurlijke paringen. Desgewenst injecteren embryo's met constructen of morfolino's, zoals beschreven. 15,16
  2. Verhogen embryo. Verzamel embryo en incuberen bij 28,5 ° C bij aanwezigheid van 0,003% 1-fenyl-2-thioureum (PTU) pigmentatie te blokkeren zoals beschreven. 17 p>
  3. Fix. Wanneer embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium, 18 hebben bereikt,   verdoven van de embryo's met behulp van MESAB, verwijder zoveel systeem mogelijk water en voeg vers 4% PFA / PBS gedurende 3-4 uur bij kamertemperatuur. LET OP: Op sommige momenten minder dan 20 uur na de bevruchting (HPF), vast te stellen voorafgaand aan dechorionation. Op sommige momenten na 20 HPF, dechorionate voorafgaand aan de fixatie met behulp van twee paren van fijne punt pincet onder een dissectie microscoop.
  4. Het veranderen van oplossingen. Transfer embryo's met behulp van een breed boring pipet, zoals beschreven. 17 Change oplossingen in 1,5 ml afgesloten microcentrifugebuizen, simpelweg doordat embryo's om zich te vestigen door de zwaartekracht zonder centrifugeren.
  5. Post-fixeermiddel na 3 -. 4 uur, verwijder PFA / PBS, te vervangen door 100% methanol en bewaar bij -20 ° C gedurende ten minste 48 uur. LET OP: Voor maximale P-CaMK-II immunoreactiviteit, beperken de totale methanol opslagtijd een week.
"> 3. Immunokleuring Whole Embryo's

  1. Plaats een minimum van 10 embryo's voor elke experimentele conditie in bedekte 1,5 ml microcentrifugebuis en label ze.
  2. Laat de embryo's om zich te vestigen. Verwijdert en weggooit methanol en hydrateren met progressieve wassen met 0,5 ml van afnemende concentraties ethanol, zoals aangegeven in de volgende stap. Elke stap is een 5 minuten wassen met schommelen.
  3. Geleidelijk te hydrateren met deze 5-oplossingen: 66% ethanol / 33% PBTx, 33% ethanol / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (dit is de eerste herhaling van PBTx), 100% PBTx (dit is de tweede herhaling van PBTx).
  4. Verwijder laatste PBTx wassen. Voeg 0,5 ml 10% NGS / PBTx. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij RT met zachte wiegen en verwijder en gooi oplossing.
  5. Bereid primaire antilichaam-oplossing door verdunning in 10% NGS / PBTx. Als co-immunokleuring, gebruik hogere affiniteit antilichaam eerste. Voor deze studie incuberen met muis anti-geacetyleerde tubuline monoklonaal antilichaam verdund 1: 500. voor example, als er 10 monsters Combineer 6 pi van de stock antilichaamoplossing met 3 ml 10% NGS / PBTx en distribueren 0,3 ml van het in elke buis.
  6. Voeg 0,2-0,5 ml van het verdunde primaire antilichaam aan elke buis om alle embryo dompelen. Incubate met zachte rockende O / N bij RT.
  7. In de ochtend, te verwijderen en gooi antilichaam oplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx weg te wassen overtollige primaire antilichaam. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  8. Dim verlichting en vul de juiste fluorescent-geconjugeerd secundair antilichaam in 10% NGS / PBTx zodat elke conditie ten minste 0,5 ml. Met muizen anti-geacetyleerde tubuline primair antilichaam, gebruikt de groene fluorescente kleurstof geit anti-muis IgG bij een 1: 500 verdunning.
  9. Incubeer secundair antilichaam gedurende 4 uur met zachte schommelen bij kamertemperatuur in het donker. Van nu af aan, het proces monsters onder gedimd licht en incubeer in een donkere container of door het wikkelen in aluminiumfolie.
  10. Aan het einde van de incubatie Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx te wassen. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  11. Als gelijktijdige immunokleuring op door het tweede primaire antilichaam van een andere soort dan de eerste primaire antilichaam. In deze studies, volgt het konijn anti-fosfo CaMK-II antilichaam door de rode fluorescerende kleurstof-geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam.
  12. Verdun konijn anti-fosfo CaMK-II-antilichaam 01:20. Voor elke buis van embryo's, op te schorten in 0,3 ml 10% NGS / PBTx, voeg dan 15 ul van de voorraad antilichaam oplossing.
  13. Zorg ervoor dat de embryo's worden ondergedompeld en de lichten worden gedimd. Incubate met zachte rockende O / N bij kamertemperatuur in het donker.
  14. In de ochtend onder dimlichten, te verwijderen en gooi antilichaam oplossing. Voeg 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer.
  15. Houd overhead lichten dimmen en verdun genoeg van de juiste fluorescent-conjugated secundair antilichaam zodat elke conditie ten minste 0,5 ml. In deze studie verdunnen rood-fluorescerende kleurstof-geconjugeerd geit anti-konijn IgG secundair antilichaam (rood kanaal) 1: 500 in 10% NGS / PBTx.
  16. Incubate tweede secundaire antilichaam gedurende 4 uur met zachte schommelen bij kamertemperatuur in het donker.
  17. Aan het einde van deze incubatie en onder dimlichten, Verwijder de secundaire antilichaamoplossing. Voeg 0,5 ml PBTx. Schud gedurende 5 minuten. Verwijder en gooi oplossing. Herhaal dit twee keer. Store in beide PBTx of 50% glycerol / PBS, afhankelijk van de beeldvorming procedure.

4. Confocale Imaging and Processing

  1. Mount embryo's voor imaging. Place 1-5 embryo's op een glasplaatje. Een ruimte tussen de belangrijkste dekglaasje en schuif gebruik dekglaasje fragmenten aan weerszijden van de kamer. Gewoonlijk worden vier # 1 dekglaasjes gebruikt om deze spacer stapels te maken zonder dat ze sluiten.
    OPMERKING: Geen montage medium nodig is.
  2. Gebruik een 100X olie-immersiedoelstelling enkel embryo in beeld te brengen met behulp van uitgezonden licht. Schakel het licht. Schakel de confocale microscoop. Zorg ervoor dat de juiste lasers (groen en / of rood) worden ingeschakeld en op afstand de focus medeplichtige is ingeschakeld.
  3. Zet de confocale programma. In de "Acquire bar," selecteert u de eigenlijke doel. In de "XY Basic" bar, ingesteld beeldformaat 1024 door te klikken op de knop 1024.
  4. In de "Laser en Detector" bar, klikt u op de rode 488 doos en de groene 568 box aan te zetten laser en de detector voor elk kanaal. Stel pinhole tot medium en pas de winst in de "Gain" bar van elk kanaal te visualiseren.
  5. In de "Acquire Settings" bar, klikt u op "Live" om te beginnen met het verwerven van beelden. In de "View Settings" bar, vinkt u het vakje "Force Integral Zoom" naar het centrum in het venster "Live".
  6. In de "Acquire Settings" bar, onder het tabblad "Z", stap door de lagen van het beeld. Na het selecteren van de number optische secties op te nemen in het beeld te verplaatsen naar een bepaald punt in het "centrum" van de z-vlak.
  7. Onder het tabblad "Z", klikt u op de kleine rode "Reference" box. Dit zal de RFA nul op het gekozen als het "centrum" point. In het vak "Step Size", selecteert u de dikte van de lagen (tussen 0,25 pm en 2,0 um is ideaal). Besteed aandacht aan de box "File Size" en proberen te beperken tot 1 GB.
    OPMERKING: Gewoonlijk tot 40 optische secties van 0,5-1,0 urn verkregen, maar het aantal secties kan empirisch worden bepaald.
  8. Naar de top uiterste van de afbeelding te vinden, klikt u op de cirkel naast "Top" en bewegen door de z-lagen. Klik nu op de cirkel naast "Bottom", zal de computer het beeld terug naar de laag in het midden. Weer bewegen door de lagen onder extreme van de afbeelding te vinden.
  9. Klik op "leven" opnieuw in de "Acquire Settings" in om de laser te stoppenovername. In dit paneel, klik op de rode dozen gelabeld Gemiddeld en Z-stack. Deze dozen wordt groen.
  10. In het vak "Acquire Settings", klik op "Single" om de hele serie beelden te verwerven. U kunt de voortgang te bewaken als het scant in beide kanalen en door de gehele z-stack.
  11. Om op te slaan, klikt u op het venster volume en klik op "opslaan als" en de naam van het bestand. Opslaan als een ".ids" bestand. Om het volume van het bestand te maken, terwijl de z-stack is nog open, selecteert u de gegevens pull-down menu en klik op "volume te maken". Sla het bestand weergegeven als een tiff-bestand. Dit is het geprojecteerde beeld die worden getoond in deze publicatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimale voorwaarden voor het visualiseren Phospho-epitopen

Methoden beschrijven de immuunlokalisatie eiwit epitopen in zebravisembryo's relatief dun vergeleken met die voor het lokaliseren via mRNA in situ hybridisatie. Fixeermiddelen gebruikt lokaliseren eiwit epitopen haarcellen van zebravis embryo's onder 4% PFA / PBS en Dent's fixatief, dat een mengsel van methanol en DMSO. 19 Lokalisatie van het RNA van volledige mount in situ hybridisatie (WISH) bedraagt ​​normaal gebruikt PFA gevolgd door opslag in 100% methanol. 20,21 Onze studies bleek dat de WISH fixeermiddel combinatie bij het ​​beperken van de tijd in methanol om twee tot zeven dagen, was superieur aan andere fixatief immuunlokalisatie de P-CaMK-II-antilichaam . Het signaal verkregen met het PFA / methanol combinatie was also aanzienlijk groter dan wanneer Dent's fixatief, 4% PFA / PBS of methanol zelfstandig wordt gebruikt, afhankelijk van de ontwikkelingstijd en locatie binnen het embryo.

Bij het optimaliseren van de hier en per fixatief en ontwikkelingstijd gebruikte beschreven techniek, werd een referentiemonster bereid, waarbij alle stappen werden gevolgd, behalve dat het primaire antilichaam weggelaten. Dergelijke controlemonsters ontbrak een fluorescentiesignaal als afgebeeld onder dezelfde omstandigheden zoals hierboven beschreven. Deze controle wordt aanbevolen voor andere onderzoekers het repliceren van deze aanpak met elk antilichaam.

De PFA / methanol fixatief combinatie leverde de sterkste P-CaMK-II signaal en is ook compatibel met immunokleuring voor geacetyleerde tubuline, dat een standaard marker voor trilharen. Ontwikkelingsgebied, de eerste trilharen orgel dat naar voren komt en is afgebeeld in deze studies is de Kupffer de blaasjes (KV). De KV is gelegen aan het achterste uiteinde van de notochorda zoals getoond bij de 12-somiet (15 HPF) fase (figuur 1). De KV is een voorbijgaande orgel en is verantwoordelijk voor de links-rechts asymmetrie. Blijkens de 2-somiet fase (12 HPF) en verdwijnt rond de 18-somiet stadium. Slaan primaire cilia genereren kringloop vloeistof, wat leidt tot een verhoging van Ca2 + in de epitheelcellen van de trilharen KV en de activering van CaMK-II in discrete plaatsen (Figuur 1). P-CaMK-II reactiviteit verschijnt en verdwijnt aan één zijde van de KV zolang cilia slaan. 12 In dit vroege stadium totale embryonale CaMK-II waarden nog steeds slechts de helft van het niveau per 24 HPF en één tiende van het niveau 3 dagen van ontwikkeling. 11 Misschien omdat totale CaMK-II-expressie is relatief laag 15 hPF, een verbetering van de immunokleuring techniek in dit stadium is bijzonder belangrijk.

between 24 en 72 HPF ontwikkeling, wordt P-CaMK-II op het apicale oppervlak van epitheelcellen van trilharen specifieke gebieden van de pronephric leidingen (figuren 2,3). De immunoreactiviteit van totale CaMK-II over de gehele pronephric kanaal en in aangrenzende somieten (figuur 2) toont aan dat slechts een subset van embryonale CaMK-II wordt geactiveerd (P-CaMK-II).

Fixatie Voorwaarden zijn compatibel met behoud van GFP Fluorescentie

Deze fixatie technieken zijn ook compatibel met behoud van groen fluorescerend eiwit (GFP) fluorescentie zonder versterking (figuur 3). In de GFP-gemerkte CaMK-II construct dat wordt gebruikt in deze figuur GFP behoudt voldoende fluorescentie hoewel PFA / methanol fixatie en daaropvolgende immunokleuring. In een hoge vergroting aanzicht van epitheelcellen van de pronephric kanaal (figuur 3), ee mozaïek expressie van GFP-CaMK-II kan worden gezien in cellen die ook zijn immunostained P-CaMK-II.

De zebravis embryo oor is een weefsel waarin de hoogte van Ca2 +, via CaMK-II, beïnvloedt de ontwikkeling. 14 zebravis oren meestal betrekking op ongeveer een dag van ontwikkeling. Momenteel wordt CaMK-II intens geactiveerd op basis van de kinocilia en op lagere niveaus langs de kinocilium (figuur 4). Deze set van beelden laat zien dat dit fixatie en immuunlokalisatie techniek kan detecteren vlekken binnen cilia, een structuur waarvan de doorsnede kleiner is dan 1 micrometer. Deze trilharen behouden hun structuur in deze fixatie en immunokleuring proces.

Een ander voorbeeld van tweekleurige tegenkleuring in het binnenoor op een later tijdstip van ontwikkeling werd bereikt door kleuring met beide Alexa 488falloïdine en anti-geacetyleerd tubuline gevolgd door een Alexa 568 gelabeld secundair antilichaam (Figuur 5). Het is opmerkelijk dat de PFA / methanol fixatiemethode bewaart zowel F-actine en tubuline, die niet geldt voor alle fixeermiddelen. Dit voorbeeld is getoond als een gefuseerde kleur voor het gehele oor en vervolgens gedurende subregio's. 14

Een laatste representatief voorbeeld van tweekleurige tegenkleuring werd bereikt met een stam van vis die embryo's met membraan gerichte GFP (Figuur 6) geproduceerd. Membraan gerichte GFP is niet verbonden aan een ander eiwit en gaat verloren wanneer geëxtraheerd met methanol, daarom werd dit beeld verkregen uit vis die alleen werden gefixeerd met PFA. Dit resultaat suggereert dat methanol behandeling onttrekt membranen, dus het is niet aanbevolen voor eiwitten die uitsluitend membraan kan worden gebonden. De P-CaMK-II signaal in deze figuur is verminderd ten opzichte van die bereikt indien methaanol werden ook gebruikt, maar hieruit blijkt dat in dit stadium en locatie (nier) van de ontwikkelende embryo, het signaal sterk genoeg te detecteren zonder methanol behandeld. Dat is niet waar de KV stadium;. Dwz methanol moet P-CaMK-II immunokleuring visualiseren. Dit voorbeeld is alleen zichtbaar als een samengevoegde afbeelding waar pronephric duct de nieren is grenst aan trunk spier.

Samengevat, de PFA / methanol fixatie hier beschreven methode is geschikt voor het behoud van GFP en kleuring van F-actine, tubuline geacetyleerde totale CaMK-II en P-CaMK-II.

Figuur 1
Figuur 1. P-CaMK-II tegengekleurd voor Geacetyleerd Tubuline (cilia) in zebravis KV. Uitzicht op een enkele live-12 somite fase (12 ss) embryo onthult de posterieure locatie van de KV door de arrowhead (zijaanzicht, A) en de cirkel binnen de doos (ventrale uitzicht, B). Embryo's in dit stadium werden vastgesteld met behulp van PFA / methanol. Embryo's werden immunostained voor geacetyleerd tubuline gevolgd door een Alexa 488 gelabelde secundaire antilichaam (groene kanaal). Vervolgens het konijn polyklonaal antilichaam tegen P-CaMK-II werd gevolgd door een Alexa 568- gelabeld secundair antilichaam (rode kanaal). Tweekanaals fluorescerende image projecties werden verkregen zoals beschreven aan steeds hogere vergrotingen (C, D). Schaal bar = 10 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie. 12 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. P-CaMK-II tegengekleurd voorTotaal CaMK-II langs zebravis Kidney. Een enkele dechorionated embryo bij 30 HPF werd bevestigd met PFA / methanol. Embryo's werden daarna gekleurd voor totaal CaMK-II gevolgd door Alexa 488 gelabeld secundair antilichaam (groen). Vervolgens werd het primaire antilichaam P-CaMK-II gevolgd door Alexa 568 gelabeld secundair antilichaam (rood). Vlekken onthult een verrijking van geactiveerde CaMK-II (in het rood) langs de apicale oppervlak van cellen die lijn de leidingen van de pronephric zebravis nier, terwijl de totale CaMK-II wordt verrijkt ten somite grenzen van aangrenzende spierweefsel en in heel sarcomeres. Schaal bar = 50 micrometer. Deze beelden werden bij een lagere vergroting dan wordt in de tekst beschreven om de gehele nier visualiseren verkregen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie. 13 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 3. P-CaMK-II Counter Imaged voor GFP in zebravis niercellen. Deze 30 HPF embryo werd geïnjecteerd met een cDNA dat codeert voor een dominant negatieve GFP-CaMK-II. 13 Zulke injecties meestal mozaïek expressie te tonen. Het embryo werd vastgesteld met behulp van PFA / methanol en vervolgens immunostained voor P-CaMK-II met behulp van een Alexa 568 gelabelde secundaire antilichaam. Imaging onthult dat GFP blijft door middel van PFA / methanol fixatie, rehydratie, blokkering en immunokleuring. Schaal bar = 10 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie. 13 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
figuur 4 P-CaMK-II tegengekleurd met Geacetyleerd Tubulin in zebravis binnenoor. Deze 30 HPF embryo werd vastgesteld met behulp van PFA / methanol. De anti-geacetyleerd tubuline antilichaam werd in volgorde en met de Alexa 488 gemerkte secundaire antilichaam, het P-CaMK-II-antilichaam en het Alexa 568 gelabelde secundaire antilichaam. Kleuring blijkt dat P-CaMK-II is aanwezig langs binnenoor cilia en co-lokaliseert met geacetyleerde tubuline. Schaal bar = 5 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie. 14 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Actine en geacetyleerd Tubulin in zebravis binnenoor. Een drie dagen oude (72 HPF) zebravis embryo is vastgesteld en immunostained voor geacetyleerde tubulin gebruik van Alexa 568 gemerkte secundaire antilichamen, gevolgd door actine visualisatie met behulp van Alexa 488 phalloidin. Cilia alsmede axonale innervatie van het oor blijkt uit geacetyleerd tubuline (rood) en F-actine structuren omvatten spiervezels (groen). Twee trilhaartjes sensorische gebieden van de zebravis oor wordt in meer detail: het voorste macula (am) en achterste crista (pc). Schaal bar = 10 micrometer. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van een eerdere publicatie. 14 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
. Figuur 6 P-CaMK-II Counter Imaged voor Membrane GFP in zebravis Kidney Deze single samengevoegde afbeelding waarin de β-actine. CAAX-GFP embryo (30 HPF) werd gefixeerd en gekleurd voor P-CaMK-II gevolgd door Alexa 568 gelabelde secundaire antilichaam. Vlekken onthult een verrijking van geactiveerde CaMK-II (in het rood) langs de apicale oppervlak van cellen die de kanalen van de pronephric zebravis nier lijn. Deze nier ductale cellen zijn gelegen net onder spierweefsel en beide worden gekenmerkt door de expressie van membraan gerichte GFP (groen). Schaal bar = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De PFA / methanol methode die in dit laboratorium met het hoofddoel van optimale immuunlokalisatie van de fosfo-T 287 -CaMK-II epitoop in zebravis ontwikkeling. Deze methode succesvol gelokaliseerde P-CaMK-II tijdens de vorming van verschillende trilharen organen waaronder de zebravis KV, 12 binnenoor 14 en nieren. 13 Met name in het stadium KV Deze techniek noodzakelijk was. Het succes van deze werkwijze is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van a) beperking van autofluorescentie, b) behoud van het fosfo-epitoop CaMK-II en c) betere toegankelijkheid van het epitoop antilichamen.

Een eerste beperking van deze benadering is de tijd van opslag in methanol. Terwijl immunoreactiviteit van P-CaMK-II is maximaal na twee dagen in methanol bij -20 ° C, wordt de reactiviteit van het epitoop verloren na een week opslag in methanol. Het is niet duidelijk of momenteel de fosfaatgroep is hydrolyzed of verdere denaturatie optreedt die immunoreactiviteit afneemt. Methanol / EGTA bij -20 ° C is een traditioneel snel fixatief bewaren tubuline-rijke structuren tijdens de ontwikkeling van vroege embryo's. 22 echter methanol alleen is niet wenselijk voor het bewaren morfologie of structuren zoals actine cytoskelet en dient vóór PFA.

Bijkomende voordelen van deze benadering zijn dat het bewaart ook andere epitopen zoals F-actine en geacetyleerde tubuline en niet de natuurlijke fluorescentie van GFP elimineren. Andere fixatieven, zoals fixatief Dent, zijn superieur voor andere epitopen 13 en compatibel met P-CaMK-II kleuring blijven, hoewel P-CaMK-II kleuring zwakkere Dent's fixatief dan PFA / methanol. Sinds fosfo-eiwitten heersen in signaalroutes dat tijdens de vroege ontwikkeling actief zijn, Dent's fixatief en PFA / methanol worden aanbevolen als twee fixatieven voor andere fosfo-epitopen in Zebrafish embryo's. Bij het ​​ontwikkelen van toepassingen van deze techniek voor andere eiwitten en de antilichamen, is nuttig geweest om antilichamen die ook reactief op immunoblots hebben en gekloneerd en tot overexpressie eiwitten waarmee antilichamen kunnen worden bevestigd. 12

Het is de moeite om technieken te optimaliseren voor immuunlokalisatie omdat a) gen suppressie op eiwitniveau kan verifiëren en b) maakt de ontwikkeling van actiemodellen waard. In dit laboratorium zijn de resultaten van deze assays het opstellen van modellen waarmee CaMK-II functies toegestaan. Bijvoorbeeld, de ligging in het KV is van voorbijgaande aard en asymmetrische, zoals de rol van dit orgaan. In de nier, de ligging aan de apicale kant van pronephric ductale cellen suggereert rollen die reageren op signalen van het kanaal. Tenslotte, de activering van dit enzym in specifieke intense puncta in de oorbasis kinocilia suggereert een gelokaliseerde Ca2 + signaal. De werkwijzen die hier worden beschrevenzou ook nuttig zijn om elke onderzoeker die streeft naar een hoge resolutie beelden van elke embryonale celtype in twee fluorescerende kanalen te verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie ​​IOS-0817658.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma P-7629 0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water
Alexa488 anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 anti-rabbit IgG Life Technologies A11008 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa488 phalloidin Life Technologies A12379 Preferentially binds to F-actin
Alexa568 anti-mouse IgG Life Technologies A11004 Goat polyclonal, use at 1:500
Alexa568 anti-rabbit IgG Life Technologies A11011 Goat polyclonal, use at 1:500
anti-acetylated α-tubulin Sigma T7451 Mouse monoclonal, use at 1:500
anti-phospho-T287 CaMK-II EMD Millipore 06-881 Rabbit polyclonal, use at 1:20
anti-total CaMK-II BD Biosciences 611292 Mouse monoclonal, use at 1:20
Ethanol Fisher S96857 Lab grade, 95% denatured
Forceps Fine Science Tools 11252-20 Dumont #5
Glass coverslips VWR 16004-330 #1  thickness
Glass microscope slides Fisher 12-550-15 Standard glass slides
Methanol Fisher A411 Store in freezer
Microcentrifuge tubes VWR 20170-038 capped tubes, not sterile
Normal goat serum Life Technologies 16210-064 Aliquot 1 ml tubes, store in freezer
Paraformaldehyde Sigma P-6148 Reagent grade, crystalline
Phosphate buffered saline (PBS) Quality Biological 119-069-131 10x stock solution or made in lab
Triton X-100 Sigma BP-151 10% solution in water, store at RT
Tween-20 Life Technologies 85113 10% solution in water, store at RT
Compound microscope Nikon E-600 Mount on vibration-free table
C1 Plus two-laser scanning confocal Nikon C1 Plus Run by EZ-C1 program, but upgrades use "Elements"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during embryonic development. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).
  2. Webb, S. E., Miller, A. L. Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development. Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).
  3. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).
  4. Yuen, M. Y., et al. Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development. Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).
  5. Tombes, R. M., Borisy, G. G. Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient. J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).
  6. Hudmon, A., Schulman, H. Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function. Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).
  7. Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II). Gene. 322, 17-31 (2003).
  8. Braun, A. P., Schulman, H. The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function. Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).
  9. Rich, R. C., Schulman, H. Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).
  10. Rothschild, S. C., et al. Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis. Dev Biol. 330, 175-184 (2009).
  11. Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis. Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).
  12. Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry. Development. 137, 2753-2762 (2010).
  13. Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia. Development. 138, 3387-3397 (2011).
  14. Rothschild, S. C., et al. CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling. Dev Biol. 381, 179-188 (2013).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , e1113 (2009).
  16. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , e1115 (2009).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , University of Oregon Press. (1993).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  19. Obara, T., et al. Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish. J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).
  20. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function. J Vis Exp. , e50644 (2013).
  21. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature. 3, 59-69 (2008).
  22. Harris, P., Osborn, M., Weber, K. Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage. J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).

Tags

Chemie Fixatie fosfo-epitopen calcium trilharen microscopie Kupffer de blaasjes nier oor zebravis
Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo's
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rothschild, S. C., Francescatto, L., … More

Rothschild, S. C., Francescatto, L., Tombes, R. M. Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (108), e53747, doi:10.3791/53747 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter