转录组分析 体内 利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎

摘要

微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本进行定量检测和基因表达谱分析。因此，本实验方案提供了一种优化的技术流程，采用定制的双色牛微阵列，利用第7天的牛胚胎，以证明使用极少量总RNA的可行性。

摘要

早期胚胎丢失是导致牛只不育的重要因素。此外，由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的有趣模型。尽管已知遗传因素会影响早期胚胎发育，但鉴定这些因素一直面临严峻挑战。微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本水平进行定量检测和基因表达谱分析。在设计微阵列实验时，一个关键决策是选择单色还是双色方法。双色设计可增加技术重复，降低变异度，提高检测的灵敏度和准确性，并支持环状设计，从而定义共同的参考样本。尽管微阵列是一种强大的生物学工具，但其应用中存在一些潜在缺陷，可能削弱其效能。因此，在本技术论文中，我们展示了一种优化的实验流程，包括RNA提取、扩增、标记、将标记后的扩增RNA杂交至芯片、芯片扫描以及采用双色分析策略进行数据分析。

引言

高产奶牛早期胚胎丢失是奶业面临的主要挑战之一^1,2。由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的一个理想模型^3,4。然而，仍需开展更多研究以深入理解参与牛早期胚胎发育的相关基因。

自1995年首个微阵列技术问世以来的二十年⁵，更先进的探针制备技术的发展降低了不同微阵列平台内部及平台之间的芯片打印误差和变异性⁶微阵列技术的改进使其在临床研究中得到广泛应用⁷ 以及最近在早期胚胎质量评估中的应用⁸.

微阵列技术需要大量起始材料，这是其最初未能进入早期胚胎发育等多个研究领域的主要原因。近年来，RNA扩增方法已得到改进，能够从亚纳克级起始RNA材料线性扩增出微克水平的RNA。⁹市面上有多种商用RNA扩增试剂盒；然而，目前更为主流且技术较为成熟的试剂盒均基于核糖单引物等温扩增（Ribo-Single Primer Isothermal Amplification）技术。¹⁰ 由T7启动子驱动的¹¹ 方法。最常用的反义RNA扩增采用 体外 使用在5'端连接T7启动子的寡核苷酸dT引物进行转录¹²该技术可在用于芯片杂交的线性扩增后，保持大多数具有代表性的反义转录本¹³该方法已适用于扩增从牛胚胎中提取的皮克水平的总RNA⁸.

通用连接系统（ULS）是一种直接将DNA或扩增的RNA通过铂连接的荧光染料（Cyanine 547或Cyanine 647）进行标记的方法，该过程在鸟嘌呤的N7位点形成配位键¹⁴。该方法已被应用于胚胎研究中，以生成比通过酶法产生的氨基烯丙基修饰aRNA更稳定且无需额外修饰的扩增aRNA¹⁵。在微阵列实验中，已采用通用连接系统进行单荧光染料和双荧光染料标记。一项大规模微阵列比较研究显示，单色和双色阵列平台之间的数据质量具有良好的相关性⁶。

近年来，T7 启动子驱动的反义 RNA 扩增技术和 ULS 标记方法的发展为生成足量且高质量的标记 aRNA 材料用于微阵列杂交提供了更可靠的实验方案^8,16。因此，本研究提供了一套实验流程，以第 7 天的牛胚胎为例，展示从 RNA 提取到数据分析的双色微阵列实验中所涉及的一些关键步骤。

方案

本研究的动物实验部分在加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学代谢研究组进行，所有动物实验程序均经艾伯塔大学动物护理与使用委员会批准（方案编号 # AUP00000131），动物饲养和护理均遵循加拿大动物护理委员会（1993年）的指导原则。

1. 胚胎制备、总RNA提取及DNase处理

1. 有关动物实验方案和胚胎收集，请参见我们之前的发表文献^{17, 18}.
2. 将来自每头牛的相似发育阶段的胚胎在液氮中汇集并快速冷冻，随后于 -80 °C 保存直至进行 RNA 提取。
3. 提取总RNA 通过 一种基于层析柱的RNA提取试剂盒，可从小至皮克级的样品中提取RNA（试剂盒信息见材料清单）。
   注意：推荐试剂盒包含：预处理缓冲液、提取缓冲液、70% 乙醇、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗脱缓冲液、RNA 纯化柱（含收集管）以及微量离心管。
4. 向含有胚胎的离心管中加入10 µL提取缓冲液，于42 °C孵育30分钟。以800 x g离心2分钟，使细胞提取物收集至微量离心管中。
5. 用移液器将250 µL洗脱缓冲液加入纯化柱滤膜上。在室温下用洗脱缓冲液孵育RNA纯化柱5分钟。将纯化柱放入收集管中，在16,000 x g离心1分钟。
6. 将10 µL 70%乙醇加入RNA提取缓冲液与胚胎的混合物中，通过移液操作上下吹打充分混匀。将混合液转移至预处理的纯化柱中。
7. 为结合RNA，先将纯化柱在100 × g条件下离心2分钟，随后立即在16,000 × g条件下离心30秒，以去除流穿液。
8. 将100 µL洗涤缓冲液1加入纯化柱中，8,000 x g离心1分钟。
   注意：如果在RNA提取后进行逆转录或扩增反应，建议进行DNase处理。
9. 在步骤1.8之后立即消化基因组DNA。
   注意：推荐的DNase试剂盒见材料列表。推荐试剂盒包含：DNase I 储存液和缓冲液。
10. 将5 µL DNase I 储存液与35 µL缓冲液混合，配制DNase孵育混合液。轻轻颠倒混匀。
11. 将40 µL DNase孵育混合液直接用移液器加入纯化柱膜中，在室温下孵育15分钟。
12. 将40 µL洗脱缓冲液1加入纯化柱膜中，然后在8,000 × g离心15秒。
13. 用移液器将100 µL洗脱缓冲液2加入纯化柱中，于8,000 × g离心1分钟。
14. 向纯化柱中再加入100 µL 洗涤缓冲液2，于16,000 × g离心2分钟。
15. 将纯化柱转移至新的0.5 mL微量离心管中。用移液器将11 µL洗脱缓冲液直接加到纯化柱的膜上。为确保洗脱缓冲液充分被膜吸收，在加入洗脱缓冲液时，轻轻将移液器吸头接触膜表面。
16. 室温孵育柱子1分钟。先在1,000 × g离心1分钟，使洗脱缓冲液充分分布于柱中，然后在16,000 × g离心1分钟以洗脱RNA。
17. 根据制造商说明书使用生物分析仪评估RNA的质量和数量¹⁹.
18. 将RNA样品于-80 °C保存，直至使用。

2. 用于微阵列分析的RNA扩增与标记

注意：对于首次进行RNA扩增和标记操作的用户，建议在实际aRNA样本中加入5 ng的外源性RNA（spike-in RNA），以监测RNA扩增和杂交过程的质量控制。该外源性RNA混合物包含十种 体外 以预定比例合成并进行多聚腺苷酸化的转录本。当操作正确执行时，标记的转录本仅特异性地与芯片上的互补对照探针杂交，杂交信号可被扫描用于追踪质量控制，且几乎不产生自身杂交或交叉杂交。关于芯片扫描后数据的外源性对照信号强度及标准化处理的更多详细信息，请参见先前发表的文献。^{20, 21}以下步骤提供给常规微阵列使用者。

1. 准备100 pg高质量RNA样品（RNA完整性数值（RIN）至少> 7.0），总体积为10 - 11 µL。
2. 使用能够处理皮克级样品（低至100 pg）的扩增试剂盒对RNA样品进行扩增。
   注意：推荐的扩增试剂盒信息见材料列表，操作严格按照制造商说明书进行，不做任何修改。
3. 采用基于荧光的定量方法评估扩增后aRNA的片段大小分布情况。
4. 使用分光光度计（基于260 nm和280 nm处的吸光度）测定扩增后aRNA的浓度。
5. 将扩增后的aRNA储存于-80 °C，直至准备进行标记。
6. 根据ULS aRNA标记试剂盒用户指南，使用2 µg扩增RNA进行荧光标记。
   注意：由于Cyanine 547和Cyanine 647染料对光降解敏感，且Cyanine 647染料易受臭氧降解，因此标记过程需在尽可能避光和无臭氧的环境中进行。
7. 开启臭氧清除箱（图1A），直至臭氧浓度降至0.001 ppm。
8. 在臭氧清除箱内（图1B），在安全光源下加入2 µL Cyanine 547或Cyanine 647染料、2 µL标记缓冲液，并用无RNase水调整终体积至20 µL。在光源上加装暗室滤光片。
9. 轻轻混匀后，将反应管置于热循环仪中，在85 °C孵育15分钟。随后将样品置于冰上至少1分钟。短暂离心收集管内液体，然后使用RNA提取试剂盒进行纯化（跳过与DNase处理相关的步骤1.9至1.11），以去除未结合的Cy染料，获得标记后的扩增RNA。
10. 使用分光光度计测定标记后扩增RNA的浓度，并将标记的aRNA在-80 °C保存，最多不超过3天，之后尽快使用。

3. 微阵列杂交与洗涤

注意：以下重要步骤根据双色微阵列基因表达分析方案（版本 6.5，2010 年 5 月）进行了相应调整。

1. 取等量的825 ng Cyanine 547和Cyanine 647标记的aRNA，加入25倍体积的片段化缓冲液和10倍体积的封闭缓冲液，混匀。
2. 在60 °C下加热15分钟，然后在冰上冷却1分钟。
3. 加入等体积的2倍杂交缓冲液，充分混匀。
4. 以13,000 rpm离心，混合物即可用于杂交。
5. 取100 µL上述混合液加载至芯片载玻片上，并将载玻片密封于杂交 chamber 内。
6. 将组装好的杂交 chamber 放入杂交炉中，在65 °C、10 rpm旋转条件下孵育17小时。
7. 根据实验方案对芯片进行洗涤，并进行臭氧保护处理：将芯片浸入稳定与干燥溶液中30秒。
8. 将芯片从溶液中取出，确保芯片表面干燥且无灰尘颗粒。

4. 扫描微阵列玻片

1. 将芯片置于暗处，并开启扫描仪，待其准备就绪（等待 15 分钟）。
2. 将芯片条形码从左侧放入扫描仪，开始扫描。根据软件用户指南进行斑点分析，并将数据保存为（gpr）文件格式。

5. 统计分析

1. 下载 FlexArray 软件 http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php，点击 “导入原始数据”，并将 gpr 文件加载到 FlexArray 中。
2. 如有需要，按照说明进行归一化和统计分析。注意：本研究中阳性信号点筛选阈值的计算方法参见先前文献²²。
3. 在 FlexArray 的图谱查看器中，从下拉菜单选择手动模式，以查看所有杂交信号点及背景信号。注意：微阵列杂交后内参对照的信号图示可参见先前研究⁸。
4. 根据 FlexArray 下拉菜单中的选项，依次选择采用 Loess 方法进行芯片内归一化，然后采用分位数法进行芯片间归一化。
5. 将 FlexArray 中所有归一化后的数据导出为 Excel 文件，以供后续使用。

6. 生物信息学分析

此前已有文献描述了来自牛胚胎特异性转录本（Bovine Embryo-specific Transcripts，BESTv1）微阵列的探针序列原始注释⁸。在本研究中，通过EmbryoGENE实验室信息管理系统（LIMS）ELMA（http://elma.embryo-gene.ca）获得了20,403个唯一的基因符号（GS）（补充文件1）。从中筛选出6,765个唯一基因的列表（补充文件2），这些基因对应于牛第7天胚胎基因表达谱在微阵列标准化处理（步骤5.5）后所得的所有阳性信号。阳性信号阈值是根据先前发表的研究¹⁶中A值的信号强度计算得出的。

1. 使用PANTHER（通过进化关系进行蛋白质分析）分类系统^{23, 24}进行功能分析时，请打开以下链接（http://www.pantherdb.org/about.jsp）。
2. 上传包含6,765个胚胎特异性GS的列表，利用统计过表达检验方法识别胚胎发育过程中特定的生物学过程，并使用软件默认的参考基因列表Bos taurus（数据库中所有基因）²⁵。
   注意：这可通过二项检验，识别出在GO术语中统计上显著过表达或低表达的发育相关过程。
3. 将P值阈值设为< 0.05（软件默认设置）。数据可下载并导出为Excel文件，以便进一步筛选¹⁶。

结果

第7天牛胚胎的总RNA和扩增aRNA的代表性结果如图所示 图3 并在以下内容中进行了总结 表1.

RNA提取后可对其完整性和图谱进行评估。RNA质量评估可通过生物分析仪完成（图3A），仅RIN值高于7.0的样品可用于扩增（表1）。

扩增后应对扩增RNA的质量和数量进行评估。扩增RNA的图谱相似性及适当的片段大小范围是质量控制的主要因素（图3B）。经过两轮扩增后，扩增的RNA片段大小非常相似，范围在200至800 bp之间（图3B），所有 片段大小范围相似的aRNA均被选用于后续的荧光标记。此外，原始总RNA的成功扩增将使a...

讨论

使用第7天牛胚胎进行微阵列分析时，首要问题是难以获得足量的高质量RNA用于基因表达研究。传统的苯酚/氯仿RNA提取结合乙醇沉淀法不推荐用于第7天胚胎，因其产率较低，且残留的苯酚可能抑制RNA扩增反应。相比之下，采用标准的柱式法更适宜用于分离总RNA，然后用最小体积的洗脱缓冲液洗脱RNA以提高其浓度。在本研究中，每个胚胎平均获得780 pg的总RNA，与其他采用相同方法²⁶以及相同RNA提取试剂盒^27，28的报道结果相当。在RNA提取过程中，建议在使用前充分混匀以溶解沉淀物，或对提取缓冲液管进行温育，以重新溶解缓冲液后再使用。此外，提取步骤中的孵育时间对RNA得率也至关重要。在42 °C孵育时间少于完整的30分钟会降低RNA得率。

柱上DNase消化是总RNA纯化过程中去除基因组DNA污染的必要步骤。DNase酶对涡旋和离心非常敏感，因此DNase与缓冲液应通过轻柔颠倒混匀。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PicoPure RNA 提取试剂盒	Applied Biosystems	KIT0204
无RNase的DNase试剂盒（50次）	Qiagen	79254
Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒	Agilent Technologies	5067-1513
Arcturus RiboAmp HS PLUS 试剂盒	Applied Biosystems	KIT0505
2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2940CA
RNA 筛查胶带	Agilent Technologies	5067-5576
ULS 荧光标记试剂盒	Kreatech Diagnostics	EA-021
定制基因表达微阵列	Agilent Technologies	G2514F
Agilent 基因表达洗涤缓冲液 1	Agilent Technologies	Part #5188-5325
Agilent 基因表达洗涤缓冲液 2	Agilent Technologies	Part #5188-5326
2x Hi-RPM 杂交缓冲液	Agilent Technologies	Part #5190-0403
25x 片段化缓冲液	Agilent Technologies	Part #5185-5974
10x GE 封闭剂	Agilent Technologies	Part #5188-5281
稳定与干燥溶液	Agilent Technologies	Part #5185-5979
采用 Agilent SureHyb 技术的垫片载玻片	Agilent Technologies	G2524-60012	每包20片垫片载玻片，每片可承载4个微阵列
双色RNA外参试剂盒	Agilent Technologies	Cat# 5188-5279
GenePix 4000B 微阵列扫描仪	Molecular Devices	GENEPIX 4000B-U
无臭氧箱	BioTray	OFB_100x200
GAL 文件	Agilent Technologies	-