微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本进行定量检测和基因表达谱分析。因此，本实验方案提供了一种优化的技术流程，采用定制的双色牛微阵列，利用第7天的牛胚胎，以证明使用极少量总RNA的可行性。
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方法文章
转录组分析 体内 利用双色微阵列平台制备牛植入前胚胎
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
早期胚胎丢失是导致牛只不育的重要因素。此外，由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的有趣模型。尽管已知遗传因素会影响早期胚胎发育，但鉴定这些因素一直面临严峻挑战。微阵列技术能够对全基因组范围内的转录本水平进行定量检测和基因表达谱分析。在设计微阵列实验时，一个关键决策是选择单色还是双色方法。双色设计可增加技术重复，降低变异度，提高检测的灵敏度和准确性，并支持环状设计，从而定义共同的参考样本。尽管微阵列是一种强大的生物学工具，但其应用中存在一些潜在缺陷，可能削弱其效能。因此，在本技术论文中，我们展示了一种优化的实验流程，包括RNA提取、扩增、标记、将标记后的扩增RNA杂交至芯片、芯片扫描以及采用双色分析策略进行数据分析。
引言
高产奶牛早期胚胎丢失是奶业面临的主要挑战之一1,2。由于牛与人类在胚胎发育过程上具有相似性，牛已成为研究人类着床前胚胎发育的一个理想模型3,4。然而，仍需开展更多研究以深入理解参与牛早期胚胎发育的相关基因。
自1995年首个微阵列技术问世以来的二十年5，更先进的探针制备技术的发展降低了不同微阵列平台内部及平台之间的芯片打印误差和变异性6微阵列技术的改进使其在临床研究中得到广泛应用7 以及最近在早期胚胎质量评估中的应用8.
微阵列技术需要大量起始材料，这是其最初未能进入早期胚胎发育等多个研究领域的主要原因。近年来，RNA扩增方法已得到改进，能够从亚纳克级起始RNA材料线性扩增出微克水平的RNA。9市面上有多种商用RNA扩增试剂盒；然而，目前更为主流且技术较为成熟的试剂盒均基于核糖单引物等温扩增（Ribo-Single Primer Isothermal A....
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方案
本研究的动物实验部分在加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学代谢研究组进行，所有动物实验程序均经艾伯塔大学动物护理与使用委员会批准（方案编号 # AUP00000131），动物饲养和护理均遵循加拿大动物护理委员会（1993年）的指导原则。
1. 胚胎制备、总RNA提取及DNase处理
- 有关动物实验方案和胚胎收集，请参见我们之前的发表文献17, 18.
- 将来自每头牛的相似发育阶段的胚胎在液氮中汇集并快速冷冻，随后于 -80 °C 保存直至进行 RNA 提取。
- 提取总RNA 通过 一种基于层析柱的RNA提取试剂盒，可从小至皮克级的样品中提取RNA（试剂盒信息见材料清单）。
注意：推荐试剂盒包含：预处理缓冲液、提取缓冲液、70% 乙醇、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗脱缓冲液、RNA 纯化柱（含收集管）以及微量离心管。 - 向含有胚胎的离心管中加入10 µL提取缓冲液，于42 °C孵育30分钟。以800 x g离心2分钟，使细胞提取物收集至微量离心管中。
- 用移液器将250 µL洗脱缓冲液加入纯化柱滤膜上。在室温下用洗脱缓冲液孵育RNA纯化柱5分钟。将纯化柱放入收集管中，在16,000 x g离心1分钟。
- 将10 µL 70%乙醇加入RNA提取缓冲液与胚胎的混合物中....
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结果
第7天牛胚胎的总RNA和扩增aRNA的代表性结果如图3所示，并总结于表1中。
RNA提取后可对其完整性和图谱进行评估。RNA质量评估可通过生物分析仪完成（图3A），仅RIN值高于7.0的样品可用于扩增（表1）。
扩增后应对扩增RNA的质量和数量进行评估。扩增RNA的图谱相似性及适当的大小范围是质量控制的主要因素。图3B）。经过两轮扩增后，扩增出的RNA片段大小非常相近，介于200至800 bp之间（图3B）并选择所有大小范围相似的aRNA进行后续荧光标记。此外，原始总RNA的扩增成功将产生至少一千倍以上的aRNA增加量（
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讨论
使用第7天牛胚胎进行微阵列分析时，首要问题是难以获得足量的高质量RNA用于基因表达研究。传统的苯酚/氯仿RNA提取结合乙醇沉淀法不推荐用于第7天胚胎，因其产率较低，且残留的苯酚可能抑制RNA扩增反应。相比之下，采用标准的柱式法更适宜用于分离总RNA，然后用最小体积的洗脱缓冲液洗脱RNA以提高其浓度。在本研究中，每个胚胎平均获得780 pg的总RNA，与其他采用相同方法26以及相同RNA提取试剂盒27，28的报道结果相当。在RNA提取过程中，建议在使用前充分混匀以溶解沉淀物，或对提取缓冲液管进行温育，以重新溶解缓冲液后再使用。此外，提取步骤中的孵育时间对RNA得率也至关重要。在42 °C孵育时间少于完整的30分钟会降低RNA得率。
柱上DNase消化是总RNA纯化过程中去除基因组DNA污染的必要步骤。DNase酶对涡旋和离心非常敏感，因此DNase与缓冲液应通过轻柔颠倒混匀。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由阿尔伯塔省畜牧与肉类署、阿尔伯塔创新—生物解决方案、阿尔伯塔牛奶协会以及阿尔伯塔农业与林业部畜牧研究处资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PicoPure RNA 提取试剂盒 | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| 无RNase的DNase试剂盒（50次） | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS 试剂盒 | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA 筛查胶带 | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS 荧光标记试剂盒 | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| 定制基因表达微阵列 | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent 基因表达洗涤缓冲液 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent 基因表达洗涤缓冲液 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM 杂交缓冲液 | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x 片段化缓冲液 | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE 封闭剂 | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| 稳定与干燥溶液 | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| 采用 Agilent SureHyb 技术的垫片载玻片 | Agilent Technologies | G2524-60012 | 每包20片垫片载玻片，每片可承载4个微阵列 |
| 双色RNA外参试剂盒 | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B 微阵列扫描仪 | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| 无臭氧箱 | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL 文件 | Agilent Technologies | - |
参考文献
- Royal, M. D., Smith, R. F., Friggens, N. C. Fertility in dairy cows: bridging the gaps. Animal. 2 (08), 1101-1103 (2008).
- Diskin, M. G., Murphy, J. J., Sreenan, J. M. Embryo survival in dairy cows managed under pastoral conditions. Anim. Reprod. Sci. 96 (3-4), 297-311 (2006). ....
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重印与许可
