Design, Packaging, og levering af høj Titer CRISPR Retro og Lentivirus via stereotaktisk injektion

Summary

Den CRISPR / Cas9 system tilbyder potentialet til at gøre målrettet genom redigering tilgængelige og overkommelige for det videnskabelige samfund. Denne protokol er beregnet til at vise, hvordan man kan skabe virus, der vil knockout et gen af ​​interesse ved hjælp af CRISPR / Cas9 system og derefter injicere dem stereotaksisk i den voksne mus hjernen.

Introduction

For at undersøge grundlaget for normal fysiologi og patologi, der er behov for præcist at manipulere genekspression i modelorganismer. For pattedyr modelorganismer, er denne stort set centreret om etablering og udvikling af transgene mus, hvor et genetisk element af interesse er flankeret af lokaliteter, der er anerkendt af en rekombinase. Dette kan resultere i en stedsspecifik manipulation af disse flankerede gener. Mens dette har været en vellykket strategi, er det tid og ressourcekrævende; for eksempel skabe en tredobbelt transgent dyr, der ville udtrykke et floxed gen, Cre-rekombinase, og en Cre reportergen kræver flere parringer og validering. I modsætning hertil stereotaktisk injektion af replikationsdefekte virale partikler der koder for et fluorescerende protein og rekombinasen i en floxed gen dyr ikke kræver kompliceret genotypebestemmelse eller avlsstrategier ^1. Yderligere, hvis et fluorescerende protein og Cre udtrykkende virus er co-injiceret med en anden virus encoding en anden fluorescerende protein, så dette giver en indenfor-vævskontrol til målrettet genetisk manipulation. Mens denne strategi stadig kræver anvendelse af knock-in dyr, viralt medierede RNA baserede strategier omgå behovet for transgene dyr. For eksempel kan stereotaktisk injektion af replikationsdefekte vira, der koder for et fluorescerende protein og en kort hårnål RNA (shRNA) anvender cellens endogene RNAi maskiner til at resultere i en potent reduktion af transskriptionen af ​​et gen af ​​interesse. Men shRNA strategier producerer subtile gen knock-downs ofte resulterer i beskedne cellulære fænotyper ^2. Mens en knock-down kan være mere fysiologisk relevant for heterozygot gen dysfunktion, dens nedsat robusthed i forhold til en knock-out er ikke ideel til fænotypisk opdagelse af nye gener.

En tredje teknik, der har for nylig vist, CRISPR (Grupperet Regelmæssigt indbyrdes afstand Short palindrome Repeat) / Cas9 (CRISPR-associeredeprotein 9) systemet, er afhængig af ekspression af både en lille eksogene RNA og et DNA-skæring enzym. CRISPR / Cas9 systemet blev tilpasset fra den prokaryote immunsystemet, som udviklede en fremgangsmåde til identifikation fremmed, invaderende DNA fra virus og målrette den til nedbrydning via Cas9 enzymet ^3,4. Denne kraftfulde genom redigering teknik kan bruges til at skabe målrettede deletioner, insertioner og mutationer; og følgende protokol vil skitsere, hvordan man laver sletninger i et gen af interesse for at knockout udtryk i vivo. Den Cas9 enzym skal udtrykkes med en guide RNA homolog til regionen af interesse og sammenhængende med et stillads RNA. Knockout af et gen ved hjælp af denne teknik kræver målretning Cas9 til en specifik region i genomet under anvendelse af syntetiske guide RNA'er (sgRNA), og inducere dobbeltstrengede pauser (DSBs) på et sted af interesse. Disse DSBs derefter repareret af den endogene celle-reparation maskiner via ikke-homologe ende-sammenføjning (NHEJ), som leannonce til indels der kan producere missense eller nonsense mutationer og kan derfor skabe et tab af funktionelt protein-ekspression ^5. Da dette system producerer genomiske forandringer, det kræver kun forbigående udtryk for Cas9 og sgRNA. Det er dog ønskeligt, at en stabil fluorescensindikator at identificere celler og deres afkom manipuleret på denne måde.

Lenti- og retrovira har den fordel af stabilt integrere DNA af interesse i værtsceller, som opretholder langvarig ekspression og er gået ned til datterceller under mitosen. Denne protokol beskriver design og produktion af to typer replikation defekt, høj titer retrovirus: human immundefekt virus afledte lentivirale partikler (lentivirus) og de er baseret på murine Maloney leukæmi virus (retrovirus). Mens begge disse vira er i stand til at understøtte stabil ekspression af store transgener, kan de retrovirale partikler kun integrere i genomet during celledeling med nedbrydningen af det nukleare kuvert, og derfor kan bruges som et redskab til at mærke og fødsel-date celler ^6. Mens lentivirus har ry for at være relativt lav titer ^7, denne metode, herunder brug af koffein ⁸ under viral samling, rutinemæssigt producerer titere af 10 ⁹ og 10 ¹⁰ partikler / ml. En anden fordel ved lenti- og retrovira er tolerancen for meget store inserts. Følgende samling af protokoller skitserer proceduren for at designe en Lenti eller retrovirus koder for en fluorescerende reporter, sgRNAs, og Cas9 at udnytte CRISPR / Cas9 system til at modificere DNA samt udtrykke et fluorescerende protein.

Mus stereotaktisk neurokirurgi er en værdifuld metode til at injicere virus in vivo for at studere morfologi, funktion, og tilslutning af inficerede neuroner. Viral infektion i neuroner kan anvendes til at manipulere ekspressionsniveauer over en længere periode på time, såsom hele udvikling, og ekspression kan styres præcist ved anvendelse af forskellige lægemidler inducerbare systemer og specifikt Cre drevet ekspression. Denne særlige protokol forklarer, hvordan at injicere en virus, der udtrykker en sgRNA og Cas9 til knockout et gen af ​​interesse i hjernen af ​​en voksen mus. Mus genvinde meget hurtigt fra denne procedure og ekspression af det virale transgen kan ses inden for 48 timer efter injektion. Imidlertid synes fluorofor udtryk at stige i løbet af uger resulterer i nærheden maksimale niveauer af 3 uger efter infektion. Mus, der undergår viral stereotaktisk injektion kan bruges til adfærd, elektrofysiologi, eller morfologiske undersøgelser. Samlet set er formålet med disse procedurer er at demonstrere, hvordan man knockout et gen i den voksne musehjerne hjælp stereotaktisk kirurgi og en virus, der udtrykker en bestemt sgRNA og Cas9.

Protocol

Etik Statement: Alle protokoller blev godkendt af Dartmouth Institutional Biosafety og Institutional Animal Care og brug Udvalg anmeldelse bestyrelser.

1. Protokol til Designing en vejledning Strand (sgRNA) for CRISPR / Cas9 Retrovirus

BEMÆRK: Der er mange non-profit websites, der kan bruges til at generere sgRNAs at målrette et gen af ​​interesse (https://benchling.com/ og http://crispr.mit.edu/). Målet med denne protokol er at designe og bestille enkeltstrengede oligoer fra en kommerciel leverandør, der er sammenføjet med hinanden. Denne udglødet oligo vil blive ligeret ind i PXL transfervektor. Se supplerende video 1 for et eksempel på designe sgRNAs hjælp Benchling.

1. Brug en hjemmeside dedikeret til at designe sgRNAs.
   BEMÆRK: For eksempel indlæsning en kodende / exon-sekvens fra nær starten af ​​genet af interesse i hjemmesiden vil generere en 20 nukleotid sgRNA. Brug 20 nukleotid sgRNA sekvens til at designe sense og anti-sense-oligos, der vil blive beordret til at oprette sgRNA.
2. Efter generering af sgRNA, kopiere denne sekvens i et tekstbehandlingsprogram. Tilføj et G (guanin) til begyndelsen af den 20 nukleotid sgRNA sekvens i dokumentet, hvis det ikke allerede begynde med én (dvs. G-20 nukleotid sgRNA sekvens). Dette er nødvendigt for at sikre god transskription fra U6 promotor.
3. Dokument den omvendte komplement af denne nu 20-21 nukleotidsekvens. For sense oligo, tilføje "CACC" til 5'-enden af sekvensen i dokumentet (dvs. CACC-G-20 nukleotid sgRNA sekvens). Dette overhæng vil blive anvendt til at ligere sekvensen i PXL vektoren.
4. For antisense oligo, tilføje AAAC til 5'-enden. Brug denne overhæng at ligere sekvensen i PXL vektoren.
5. Anskaf de sense og antisense oligoer. Han modtog oligoerne, gør 100 uM lagre hjælp DNAse frit vand. Bland 10 gl af hver af de 100 pM sense- og antisense-oligoer med 4 μl 10x NEB buffer 2, og 16 pi vand.
   BEMÆRK: De behøver ikke side rensning eller 5'phosphorylation (som BbsI udhæng er ikke-kompatible klæbende ender).
   1. Bring 200 ml vand i kog i et 500 ml bægerglas, derefter flyde røret med denne blanding i et skum "floater" indehaver. Lad vandet langsomt at afkøle fra 95 ° C i 2 timer ved stuetemperatur.
   2. Fortynd nu udglødet-oligo mix 1: 1000 i sterilt vand og bruge med det samme i den følgende ligation eller opbevare den resterende reaktion ved -20 ° C.
6. Digest PXL, en PX330 vektor derivat, med BbsI restriktionsenzym ved 37 ° C i 2 timer. Brug en 40 pi reaktion indeholdende 2 ug Pxl, 4 pi 10x NEB buffer 2, 1 pi BBS1 og resten vand. Udsætte den fordøjede-pxl til rutinemæssig geloprensning under anvendelse af et kommercielt kit. Sørg for, at udbyttet er ~ 8.5 kB produkt.
7. Anvendelse af et kommercielt ligeringskit, ligere 1 pi af 1: 1,000annealede-oligoer med 50 ng fordøjet og geloprenset-PXL. Omdan ligeringsproduktet ind kompetent rekombination mangelfuld E. coli (NEB 5-alfa, subkloning effektivitet). Screene transformanter for tilstedeværelsen af ​​den korrekte vejledning af plasmid DNA-sekventering.
8. Fordøje U6, guide streng, og RNA stilladsorganer (sgRNA) ud af PXL hjælp BstB1 og PAC1 restriktionsenzymer og liger i det fluorescerende protein-T2A-Cas9 viral backbone fordøjet med de samme restriktionsenzymer. Omdan ligeringsproduktet (NEB 5-alfa maksimal effektivitet). De fluorescerende protein-T2A-Cas9 viral backbone plasmider er lavt kopiantal plasmider og dermed lavt kopiantal forskrifterne skal anvendes.
   BEMÆRK: En anden sgRNA kan tilsvarende indføres ved Pacl-fordøjelse af en anden PXL guide streng plasmid og ligeret ind i PAC 1-fordøjet og kalv-tarm phosphatase-behandlede virale skelet, der allerede indeholder det første styringsmiddel streng. Phosphatasebehandling af det virale transferplasmidet vil hjælpereducere antallet af transformanter fra selv-ligering af plasmider ikke indeholder det andet styr.
9. Sekvens kontrollere den endelige plasmid og maxi prep hjælp af Nucleobond Xtra maxi prep kit og pakke det ind i en virus ved hjælp af følgende "Protokol til Retro / Lentiviral Produktion - CaPO4 Method".

2. Klargør 293FT / 293GP Celler for transfektion (Retro / Lentiviral Produktion - CaPO4 Method)

1. (Dag 1) Hurtigt tø 1 hætteglas med celler pr 10 cm cellekultur plade i et 37 ° C vandbad. For lentiviral emballage, brug 293FT celler. For retroviral emballage, brug 293GP (gag / pol) celler.
2. Pipette alle de optøede-celler fra kryo røret i et 15 ml konisk rør, og der tilsættes 2 ml forvarmet CO ₂ ækvilibreret-komplet Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium.
3. Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg for at pelletere. Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml komplet Erbugt modificerede Dulbeccos Medium. Plate cellerne på en 10 cm celledyrkningsskål. Inkuber cellerne natten over ved 37 ° C i en 5% carbondioxid-inkubator.
4. (Dag 2) 24 timer efter udpladning ændre medier på pladen ved at suge de eksisterende medier og tilsætning af 10 ml forvarmet Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium til pladen.
   1. (Dag 3-4) 24-48 timer efter medierne forandring og når cellerne bliver konfluente, opdele cellerne til en konfluens på 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / plade (10 cm plade).
   2. At opdele celler, aspireres medierne og vask pladen med 5 ml PBS. Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin til pladen og inkuber ved 37 ° C, indtil cellerne løftes fra pladen. Tilsæt 0,5 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium at neutralisere 0,25% trypsin reaktion og pipette cellerne i et 1,5 ml rør.
   3. Spin cellerne ved 500 x g i 5 min. Resuspender cellerne i 1 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium. Fortynd 1081; l af celler i 90 pi PBS. Tæl celler ved hjælp af enten et hæmocytometer eller automatisk celletæller. Re-plade 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / plade med komplet Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium.
      BEMÆRK: Celler vil være ~ 50% sammenflydende 24-34 timer efter plating. Transficere celler, når de er ~ 50% sammenflydende.

3. (Dag 5) CaPO4 Transfektion og viral Particle Collection

1. Skift medierne 2 timer før transfektion ved at suge de eksisterende medier og tilsætning af 10 ml forvarmet Iscoves Modificeret Dulbeccos Medium. Sørg for at der er præcis 10 ml medier i den 10 cm plade.
2. Forbered transfektionsreagenser for 2 retter ved hjælp af 2, 5 ml rundbundet polystyrenrør. Mærk det første rør "DNA" og det andet rør "2X HBS". Indstille koncentrationen af ​​DNA til 1 ug / ul i Tris-EDTA ved pH 7,4.
   1. For lentivirus, langsomt tilsættes 20 pi transfervektor (The Viral konstrukt af interesse), 13 pi CMVdelta8.9, 9 pi VSV-g, 860 pi molekylærbiologisk kvalitet _H2O, og 100 pi 2,5 M _CaCl2 til det første rør ( "DNA") under kontinuerlig aflytning på røret for at blande.
   2. For retrovirus, udelade CMVdelta8.9 plasmidet. Tilsæt 20 pi Transfer Vector, 15 pi VSV-g, 860 pi Molecular Biology Grade _H2O, og 100 pi 2,5 M _CaCl2 til røret mærket "DNA".
   3. Der tilsættes 1 ml 2x HEPES-bufret saltvand (pH 7,0; denne pH er helt afgørende) til rør mærket "2X HBS".
   4. Tilsæt langsomt 1 ml indholdet af "DNA" rør til "2X HBS" rør, en dråbe ad gangen. Kontinuerligt tryk på "2X HBS" rør med det indeks eller langfinger samtidig tilføjer indholdet af "DNA" rør. Overhold tilsyneladende capo ₄ vesikler efter hver dråbe. Inkubér røret i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Der tilsættes 1 ml af transfektion i langsomme dråber til hver 10 cm celle plade, derefter inkuberes natten over ved 37 ° C.
4. (Dag 6) Erstat medier med 8 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium + 0,5% FBS og 40 mg koffein / 100 ml medium. Hvis overførslen vektor indeholder en fluorescerende markør, derefter fluorofor ekspression indikerer en vellykket transfektion.
5. (Dag 7) indsamle de medier, der indeholder de virale partikler ved anvendelse af en 10 ml serologisk pipette og dispensere i en 50 ml konisk rør. Opbevar 50 ml konisk rør ved 4 ° C. Tilsæt 8 ml 0,5% FBS medier til hver plade.
   1. (Dag 8) Igen, indsamle medier, der indeholder de virale partikler og kombinere med den foregående dags høst i 50 ml konisk rør.

4. Koncentration og oprensning af virus

1. Lav en 5x polyethylenglycol 6000 ved tilsætning 40% polyethylenglycol 6000 og 1,5 M NaCl til Hedeselskabet ₂ O. Autoklaver løsning påden flydende cyklus i 45 minutter ved 121 ° C. bland langsomt opløsningen når køling.
   BEMÆRK: Løsningen starter overskyet og derefter bliver klar, da det køler.
2. Centrifugeres 50 ml konisk rør indeholdende begge samlinger af viral supernatant ved 2.000 xg i 10 minutter for at pelletere uopløseligt materiale. Oprens den virale medier ved filtrering gennem et 0,45 um lav proteinbinding sprøjtefilter (PES eller PVDF).
3. Tilføj 5x polyethylenglycol 6000 løsning på medier (Den endelige koncentration skal være 8% polyethylenglycol 6000 og 0,3 M NaCl). Bland ved at vende røret flere gange (ikke vortex). Inkubér det virale indeholdende polyethylenglycol-opløsning ved 4 ° C i 12 eller flere timer, remixing lejlighedsvis.
4. (Dag 9) Centrifuger det virale indeholdende polyethylenglycol opløsning ved 2.500 xg i 45 minutter. Fjern og kassér supernatanten og spin igen i 2 min. Igen, fjern og kassér supernatanten.
5. Pelleten resuspenderes ved tilsætning 320 pisteril phosphatbufret saltvand (320 pi er 1/100 ^th af den oprindelige mængde af virale indeholdende medier indsamlet) og inkuberes natten over ved 4 ° C. Eventuelt resuspender pelleten ved stuetemperatur på en rocker i 30 min.
6. Efter re-suspension pelleten, aliquot virus (5-10 pi per 0,5 ml rør) og fryse alikvoter ved -80 ° C (fryse optøning eller opbevaring ved 4 ° C vil dramatisk reducere titeren).
7. Titrere vira under anvendelse af standard protokoller, dvs, udføre en fortyndingsserie på en 6-brønds plade af HEK293T celler og manuelt tælle fluorescerende kolonier 48 timer senere.

5. Test Effektivitet af CRISPR Virus

BEMÆRK: Sequence-kloner ved hjælp af følgende trin for at teste for produktion af dobbelt-strenget pauser repareres af NHEJ med musen Neuro2A celler. Dette har den fordel i forhold landmåler assays ved, at den kan anvendes til at bestemme den procentdel af celler, der er blevet ombygget og artenDe indels følger af NHEJ.

1. Coat en 3,5 cm celledyrkningsskål med en gelatinøs proteinblanding såsom matrigel fortyndet 1:50 i Iscoves modificerede Dulbeccos medium og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Aspirere den gelatinøse proteinblanding og plade af Neuro2A celler.
2. Efter Neuro2A cellerne når 50% konfluens, tilføje CRISPR lentivirus eller Retrovirus ved en infektionsmultiplicitet på 10 (dvs. 10 viruspartikler per celle).
   BEMÆRK: Neuro2A celler er ikke så venlig for infektion, da er HEK293-celler, således en enkelt infektion vil ikke resultere i 100% af cellerne bliver inficeret med lentivirus. Endvidere retrovirus inficerer kun delende celler og vil derfor heller ikke resultere i 100% infektion. For at opnå en næsten 100% infektionsrate, kan tilsætning af virus gentages på flere dage, opdele cellerne efter behov. Alternativt kan fluorescerende positive celler isoleres ved anvendelse af fluorescens-aktiveret celle-sortering. the mest effektive måde at opnå en 100% infektion sats med en lentivira er at udføre en enkelt infektion efterfulgt af FACS isolation. For et retrovirus, udføre 4-runder af infektion 24 hr hinanden og følger ved FACS isolering for at sikre 100% infektion.
3. Efter infektion af cellerne i 1 uge, udvide cellerne til nær konfluens på en 10 cm plade, aspireres medierne, og vask pladen med 5 ml phosphatbufret saltvand. Der tilsættes 1 ml 0,25% trypsin og inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne løftes fra pladen. Tilsæt 0,5 ml Iscoves modificerede Dulbeccos medium at neutralisere 0,25% trypsin reaktion og pipette cellerne i et 1,5 ml rør og pelletere cellerne ved 500 x g i 5 min.
4. For at isolere DNA, tilsættes 100 pi 50 mM kaliumhydroxid, genopslæmmes cellerne, og der inkuberes ved 95 ° C i 5 min. Neutraliser opløsningen ved anvendelse af 10 pi 1 M Tris, pH = 8,0.
5. PCR amplificere regionen flankerer det genomiske region målrettet efter CRISPR sgRNAhjælp ~ 300 ng af DNA isoleret i trin 5.5 under anvendelse af en high fidelity PCR Master Mix ^4.
6. Kør PCR-reaktionen på en 2,5% agarosegel og gel rense passende størrelse fragment under anvendelse af en gel-oprensningskit, såsom en gel DNA recovery kit. Ligere ind i en PCR-kloningsvektor, såsom pGEM-T-let og transformeres til kompetente celler ^9.
7. 24 timer senere, tilsættes 2 ml LB bouillon i en 15 ml rundbundet rør samt det passende antibiotikum (ampicillin, neomycin, etc.). Inokulere røret med en individuel koloni ved anvendelse af en steril pipettespids eller loop at vælge en enkelt koloni fra LB-plade. Udvide og vokse kolonien ved at ryste røret ved 250 RPM og 37 ° C i 24 timer. Gentag for så mange kolonier som ønsket.
   1. Ved hjælp af en mini-prep-kit, isolere DNA fra E. coli og sekvens med primere designet til at amplificere det område af genet målrettet efter sgRNA for at analysere Cas9 målrettet region af muse-genomet.

6. stereotaktisk Injection protokol om Voksen Mouse

1. Forbered Kirurgi
   BEMÆRK: Det er vigtigt at opretholde sterile forhold under overlevelse operationer. Dette opnås i denne protokol ved varme sterilisering kirurgi værktøjer, hjælp betadine at sterilisere injektionsstedet, og tilføje antibiotisk salve til incisionssted efter at det er lukket. Det er også vigtigt at anvende sterile handsker samt en grundigt steriliseret, dedikeret operationsområde.
   1. Heat sterilisere kirurgi værktøjer før brug ved enten autoklavering eller en med varmt perle sterilisator. Forbered opsving kammer og kirurgi ved at dreje på varmepuder at opretholde kroppens temperatur under operationen og nyttiggørelse. Saml boret anvendes til at skabe huller i kraniet til injektion.
   2. Load 4 pi virus i kanylen ved at trække virus direkte fra sterile PCR-rør. Kort fortalt fjerne den virale alikvot fra is. Vedligehold virusi sprøjten ved stuetemperatur i mere end 1 time før injektion.

7. stereotaktisk injektion

1. Bekræft, at ventilationen til operationen suite er åben for at sikre korrekt luftstrøm. Forbered musen til operation ved bedøvelse med 4% isofluran i en induktion kammer. Efter bedøvelse barbere hovedet til fremstilling injektionsstedet.
   1. Placer musen i stereotaktisk instrument ved at bruge pincet til at flytte tungen ned og til siden. Sæt bid bar i munden, indtil tænderne falde i sprækken, og fastgør øre barer. Sikre, at organet af musen er på varmepuden og næse er beliggende i næsekeglen. Direkte 4% isofluran i næsen kegle. Bekræft anæstesi ved at knibe foden med en pincet og sikre, at der ikke er nogen startle reflex.
   2. Anvend kunstige tårer at smøre øjnene. Finish forbereder injektionsstedet ved pensling den barberede hoved med vekslende runder af povidone-iod og lidocain.
2. Ved hjælp af en skalpel, skæres lille snit langs midten af ​​hovedbunden. Tør kraniet med en vatpind og hydrogenperoxid, hvis nødvendigt for at hjælpe visualisere bregma.
   1. Ved hjælp af en dissekering omfang, finde bregma på kraniet og placere boret tip om bregma. Nul (eller optage) de digitale stereotaktiske koordinater på x, y og z fly.
   2. For at sikre, at hovedet er niveauet på rostral at caudale y-aksen, placere boret på lambda og niveau hovedet, således at z-koordinat er omtrent ens ved både bregma og lambda.
   3. For at sikre, at hovedet er niveauet på x-aksen, placere borehovedet til y = 1/2 lambda. Sikre, at z-koordinat er lig med 1 mm på hver side (x = +/- 1 mm) af den sagittale sutur. Juster kraniet, hvis der er en forskel i z-koordinat på 1 mm til venstre og højre for lambda.
3. Placer boret hen over de ønskede koordinater. For tandede gyrus, bruge koordinatsystemetsy = -1,9 fra bregma og x = +/- 1,1. Før boring, sænke isofluran til 2%, derefter langsomt og forsigtigt, bore gennem kraniet.
   1. Efter boring alle huller, anbringer den fyldte injektionssprøjte på stereotaktisk instrument. centrere visuelt sprøjten over hullet og nul Z-koordinaten på kraniet.
   2. Langsomt sænke sprøjten til dybeste z-dybde. For tandede gyrus, z dybder er -2,5, -2,4, og -2,3. Begynd injektion med en hastighed på 0,25 pl / min under anvendelse af en stereotaktisk injektor.
      1. Efter injektionen er færdig ved laveste Z-dybde, vent 1 min, derefter hæve til næste koordinere og begynde injektion igen. Fortsæt dette mønster, indtil alle z-injektion koordinater injiceres. Vent 2 minutter, før du fjerner sprøjten efter den sidste injektion.
         BEMÆRK: Ingen bivirkninger er blevet bemærket på vævet ved at indsprøjte op til 2 pi virus pr halvkugle i musen hjernen.
   3. Gentag injektion til andre borehuller.
4. Efter injektion, fjernes musen fra stereotaktisk instrument og sutur hovedbunden med 6-0 silkesutur. Påfør Lidocain og et anti-bakteriel creme til såret.
   1. Injicer 0,8-1,0 ml saltvand + Ketoprofen (3-5 mg / kg) via IP ruten til at styre smerte. Derefter placere musen i opvarmet opsving kammer. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. dyret Må ikke vende tilbage til selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt.
5. I dagene efter operationen, vejer musen dagligt og tilvejebringe bløde fødevarer og godbidder. Check såret og bemærk den generelle tilstand / opførsel.
6. Efter stereotaktisk injektion, kan musene aflives for slice prep elektrofysiologi ¹ eller perfunderes, og deres hjerner fjernet, skåret og farvet via immunhistokemi til analyse ^10.

Representative Results

Efter "protokollen til Designing en vejledning Strand (sgRNA) for CRISPR / Cas9 Retrovirus", oligoer rettet mod en bestemt sekvens indsættes i PXL kloningsvektor nedstrøms for hU6 promotor og nedstrøms en vejledning RNA stillads ved hjælp af BbsI kloning sites (figur 1, trin 1). Denne sgRNA derefter skåret ud af PXL og indsat i pRubi rygraden ved hjælp af BstBI og Pacl steder (Figur 1, trin 2). Endelig er en anden sgRNA klonet i PXL kan placeres nedstrøms for den første styr i pRubi-Guide1 (figur 1, trin 3), målretning andet område af genet og øge chancerne for en knockout via NHEJ. Verifikation af de korrekte konstruktioner bør bestemmes af sekvensanalyse. Når denne konstruktion er lavet, kan det pakkes ind i en virus efter "protokollen for Retro / Lentiviral Produktions- CaPO4 Method". Vellykket emballage bekræftes ved infektion af virus i HEK293-celler for at titrere vIrus. Hvis der ikke er nogen fluorofor ekspression så var der sandsynligvis en fejl under emballering af virusset.

Figur 2 er et repræsentativt resultat af 2 retrovira, én udtrykker GFP og det andet udtrykker mCherry, co-injiceret i gyrus dentatus fra neonatal mus (7 dage gamle) og afbildes 21 dage efter injektion. Mærkning af neuroner med mCherry eller GFP tillader morfologisk vurdering af forskellige genetiske manipulationer i det samme væv, hvor man virus kan udtrykke en CRISPR / Cas9 medieret KO og den anden en kontrol virus, der udelukkende udtrykker en fluorofor. Stereotaktisk injektion giver præcis anatomisk selektivitet som demonstreret ved den diskrete infektion af de tilsigtede koordinater, den tandede gyrus. Ved analyse hjernesnit for infektion, er det vigtigt at holde omgivende væv, indtil det afgøres, at den korrekte anatomiske region blev inficeret. Hvis der ikke er tegn på infektion, så er det muligt, at injektionen skete i en naboregionen end kan identificeres i de omkringliggende sektioner. Det kan også være nyttigt at lokalisere nålen spor for at finde den nøjagtige injektion region. VSVG pseudotype virus sjældent spredt ud af grænserne for gyrus dentatus, når det injiceres in vivo, og har tendens til at spredes langs rostralt / kaudale akse inficere celler langs hele gyrus dentatus, som analyseret ved 3D rekonstruktion (figur 3).

Figur 1:. Kloning strategi for retroviral pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR plasmid Denne strategi er identisk for de FU-baserede lentivirale plasmider. sgRNA oligoer anneales og indsat i PXL hjælp af BsbI kloningssteder. Efter sekventering for at sikre, at sgRNA held indsættes i PXL, fordøje plasmidet med BstBI og Pacl. Indsatsen, der er droppet ud (black box) er derefter klonet i den virale tilbage ben (sort punkteret linier) pRubi-Guide1 CRISPR. En anden sgRNA kan også indsættes i PXL og spaltet ud ved hjælp af Pacl-enzym. Dette klones derpå ind i pRubi-Guide1 CRISPR vektor (røde stiplede linjer) ved hjælp Pacl. Det resulterende plasmid indeholder så både vejledning strenge samt de nødvendige virale elementer, promotorer og fluoroforer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Retroviral injektion af muse gyrus dentatus Retrovira udtrykker mCherry (rød) eller GFP (grønt) blev injiceret i gyrus dentatus fra en p7 mus. 21 dage senere blev musene perfunderet og hjernerne sektioneret og farvet for GFP og mCherry. (A) En 5X bred felt fluorescerende billede viser PRESLUTNING af gyrus dentatus injektion og specificiteten af ​​mærkning gyrus dentatus granula neuroner. Morfologien af ​​hippocampus kan ses via DAPI (blå) farvning. Scale bar måler 200 um. (B) En 10X wide-field fluorescerende billede viser, at disse høje titer lentivirus inficere et stort antal celler, hvis morfologi kan tilgås via fluorofor ekspression. Scale bar måler 100 um. (C) Virus udtrykker GFP eller mCherry blev co-injiceret i den tandede gyrus. Ved hjælp af et system af retrovirus, kan man bruge en virus at gøre en genetisk manipulation præget af GFP og anden manipulation præget af mCherry, og derefter vurdere enkelt eller additive ændringer som følge af hver virus. Scale bar måler 10 um.

Figur 3:. Anatomisk spredning af lentiviral injektion stereotaktisk coinjektion af en GFP-shPten virus og en mCherry kontrol virus ind i hjernen på en voksen PTEN ^{loxP / +} mus resulterede i en viral spredning langs hele rostrum / caudale akse af gyrus dentatus i hippocampus. Dette er vist i en 3D-rekonstruktion af omfanget af injektionen, hvor lukkede konturer af virale spredning blev sporet over 21 serielle snit (Z = 50 um / afsnit) under anvendelse genopbygning software. Contour tracings blev derefter justeret til at generere 3D-billeder til volumen kvantificering. Total viral spredning er vist i grøn (volumen = 54.730.800 um ³⁾ og tandet-lokaliserede spredning er vist i lilla (volumen = 27.275.200 um ^3). Virus spredes langs nålen sporet og corpus callosum i skæringspunktet af nålen spor foruden fylde rostralt / caudale akse af gyrus dentatus. Scale bar måler 200 um.

les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Supplemental Video 1. Design af sgRNAs til kloning ind retroviral og lentiviral rygrad.
I dette syntetiske guide RNA (sgRNA) design eksempel er den genomiske sekvens for muse CHD8 downloades fra NCBI. Startkodonet og exon struktur derpå visualiseret i Vector NTI. Dette giver os mulighed for at kopiere den genomiske regionen omkring den første kodning exon og indtaste denne sekvens i Benchling. Benchling giver os mulighed for at visualisere alle potentielle sgRNAs i regionen. Endvidere efter angivelse af genomisk region, vi har input, vil Benchling vise os de scores på-target og off-target for hver guide RNA. Brugeren kan derefter vælge guide RNA med de højeste online- og offline-target scoringer. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Discussion

Der er et par kritiske trin, der er vigtige for en vellykket viral pakning. Celle sundhed er kritisk før og under transfektion, som usunde celler i høj grad vil reducere mængden af ​​virus produceret. Hvis transfektion og emballering er succesfulde, derefter 100% af cellerne skal udtrykke fluorophoren og cellerne bør udgøre en funktionel syncytium. I trin 3.2.4, banke på glasset er nødvendig for høj titer transfektion effektivt, og pH af den HEPES-bufret saltvand, skal være nøjagtige. De maxi-preps der producerer de plasmider, der er nødvendige for viral pakning skal være yderst rene. Til dette punkt, er det nyttigt til ethanol udfælde den endelige DNA eluering og re-suspendere i Tris-EDTA-buffer. Det er også meget vigtigt at reducere mængden af ​​serum til 2% eller mindre i medierne, at koffein er blevet tilsat til på dag 6 (trin 3.4) før viral samling. Hvis serum ikke reduceres, så den endelige oprensede virus vil indeholde en uønsket mængde af serum protein. Anvendelsen af ​​polyethylenglycol 6000 ved udfældning viruspartiklerne udelukker nødvendigheden af ​​ultracentrifugering. Det er også vigtigt at bemærke, at Cas9 CRISPR indeholdende vira har typisk en titer ca. 10 gange mindre end vira udelukkende indeholdende en fluorofor.

For stereotaktisk kirurgi, brug af inhaleret anæstesi muliggør en hurtig og præcis styring eller dyrets bevidsthed sammenlignet med injicerbare anæstetika og tillader anæstesi over et større aldersgruppe. Det er meget vigtigt at holde kirurgiske instrumenter rent og sterilt, og reproducerbar målretning kræver præcis positionering af hovedet. Sørg for at der ikke er nogen pitching eller rulning af hovedet i stereotaktisk instrument, og at kraniet føles fast. Det kan være nyttigt at tillade kraniet tørre for at finde suturerne at bestemme de stereotaksiske koordinater. Desuden bør satsen og volumen for hver stereotaktisk koordinere bestemmes empirisk.

Denne teknik er begrænsende på, at spredningen af ​​et lenti- eller retrovirus er begrænset, især sammenlignet med adenoassocierede virus (AAV'er) .Derfor disse vira er værdifulde, når inficerer en diskret område af hjernen, men ikke for den overordnede infektion i forbindelse med AAV'er anvendes til adfærdsanalyse hos dyr. Anvendelsen af ​​koffein i denne protokol øger titeren af ​​disse vira, men de er stadig ikke så høje som de titere opnået i AAV emballage. Også, stabil integration er kun en fordel ved fluorofor ekspression, som CRISPR / Cas9 danner stabile genomiske redigeringer selv når transient transficeret og det er muligt, at den igangværende ekspression af Cas9 og sgRNA sidste ende kan frembringe off target effekter. Den forbigående ekspression CRISPR / Cas9 systemet med AAV'er er tilstrækkelig til at frembringe genomiske ændringer, der er opformeret i hele celledelinger dog fluorofor ekspression vil ikke blive opretholdt.

Oprettelse af lenTi- og retrovira anvender CRISPR / Cas9 systemet vil bibringe evnen til at målrette enhver hidtil ukendt gen i en lang række organismer. Effektiviteten af ​​gen redigering synes at være afhængig af sekvensen af ​​føringen RNA rettet mod Cas9 spaltning. Det er blevet bestemt empirisk, at mellem 10% og 80% af klonerne indeholder indels efter sekventering inficerede Neuro2A celler. Det er på nuværende tidspunkt ikke, om InDel frekvenser beregnet i Neuro2A celler er reflekterende af dem i neuroner. Guide RNA design software som Benchling omfatter nu en "on target" score, der kan være i stand til at forudsige effektiviteten af ​​et givet mål sekvens. I hvilken grad sådanne "on-target" score er pålidelige behov, der skal empirisk bestemt i neuroner og andre celletyper som CRISPR-Cas9 systemet bliver mere bredt implementeret.

Lentivirus-baserede transgene dyr produktion har været variabelt succes med rapporter om, at lentivirus-leverede transgener bliver silenced ^11. CRISPR medieret gen redigering af DNA kan føres gennem kønscellerne at generere hele dyremodeller. Således kan stabil genomisk redigering kunne opnås på trods af lyddæmpning af virale-leverede fluoroforer og Cas9 transgener. Det kan give en effektiv platform for målrettet genomiske forandringer. Den virale levering af CRISPR / Cas9 system, mens de ikke kræver transgene organismer, er komplementær til disse teknikker. For eksempel injicere sådanne viruspartikler til en forbindelse transgent dyr, der inducerbart udtrykker Cre og Cre afhængige opto eller kemo-genetisk transgener bør lette komplekse undersøgelser af forholdet mellem genetiske manipulationer og neuronal aktivitet. Et andet eksempel er at levere disse Cas9 / sgRNA viruspartikler en betinget knockout i et forsøg på at screene for genet-gen interaktioner. Endelig er en anden spændende rute med denne forskning er screening af fænotyper og terapeutiske forbindelser i patientens afledte celler, som kanbruges til at validere og opdage genetiske netværk, der er afbrudt i forskellige sygdomme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
List of Cell Culture Reagents
293FT cell line	Life Technologies	R700-07	For Lentivirus
293GP cell line	Clontech	631458	For Retrovirus
Iscove's Modification of DMEM (IMDM)	Corning	10-016-CV	Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and  1% P/S
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)	Corning	25-025-CI
L-Glutamine solution, 100x (L-Gln)	Corning	25-005-CI
Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S)	Corning	30-002-CI
Polystyrene 10 cm plate	USA Scientific	CC7682-3394
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-053-CI
List of Transfection Reagents
5 ml polystyrene tubes	Fisher Scientific	352054
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)	Fisher Scientific	C69-500	Make a 2.5 M solution in ddH2O
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3
HEPES	Fisher Scientific	BP2939-100
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	S369-500
2x HEPES Buffered Saline (HBS)			500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-5G
0.22 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLGV033RS
0.45 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLHP033RS
60 cc L/L Syringe	Med-Vet International	MV60CCLL
50 ml Conical Tube	Corning	352098
polyethylene glycol   6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC41678-5000
Donor Horse Serum	Cellgro	35-030-CV
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
10 ml serological pipette	Fisher Scientific	357551
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate	Invitrogen	A21311
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
artificial tear ointment	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
normal saline	Med-Vet International	DYND500MLSH
cotton tipped applicators	Med-Vet International	CTA6
Triple antibiotic ointment	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 silk sutures	Med-Vet International	MV-711