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Neuroscience

डिजाइनिंग, पैकेजिंग, और stereotaxic इंजेक्शन के माध्यम से उच्च अनुमापांक CRISPR रेट्रो और lentiviruses की डिलिवरी

Published: May 23, 2016 doi: 10.3791/53783
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Neurobiology, Geisel School of Medicine at Dartmouth College

Summary

CRISPR / Cas9 प्रणाली संभावित सुलभ और वैज्ञानिक समुदाय के लिए सस्ती लक्षित जीनोम का संपादन करता है। इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के वायरस है कि CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग कर ब्याज की एक जीन पीटा जाएगा, और फिर उन्हें वयस्क माउस मस्तिष्क में stereotaxically इंजेक्षन बनाने के लिए कैसे करना है।

Introduction

सामान्य शरीर विज्ञान और रोग विकृति के आधार का अध्ययन करने के लिए, वहाँ ठीक मॉडल जीवों में जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने की जरूरत है। स्तनधारी मॉडल जीवों के लिए, यह काफी हद तक निर्माण और ट्रांसजेनिक चूहों के विकास पर केंद्रित है जिसमें ब्याज की एक आनुवंशिक तत्व एक recombinase द्वारा मान्यता प्राप्त साइटों से घिरे है। यह इन घिरे जीन की एक साइट विशिष्ट हेरफेर में परिणाम कर सकते हैं। यह एक सफल रणनीति रही है, वहीं यह समय और संसाधन गहन है; उदाहरण के लिए, एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक जानवर है कि एक floxed जीन, Cre recombinase, और एक Cre रिपोर्टर जीन व्यक्त करेंगे बनाने के लिए कई matings और सत्यापन की आवश्यकता है। इसके विपरीत, प्रतिकृति की stereotaxic इंजेक्शन दोषपूर्ण वायरल एक floxed जीन जानवर में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और recombinase एन्कोडिंग कणों जटिल जीनोटाइपिंग या प्रजनन रणनीतियों 1 की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, अगर एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रचनात्मक वायरस व्यक्त है एक दूसरे वायरस Enco साथ सह इंजेक्शनडिंग एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन, तो यह लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक के भीतर ऊतक नियंत्रण प्रदान करता है। इस रणनीति अभी भी तोड़े में जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है, जबकि virally मध्यस्थता आरएनए आधारित रणनीतियों ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए की जरूरत को नाकाम। उदाहरण के लिए, प्रतिकृति की कमी वायरस है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक छोटी बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) सांकेतिक शब्दों की stereotaxic इंजेक्शन ब्याज की एक जीन की प्रतिलिपि की एक शक्तिशाली कमी में परिणाम के लिए सेल की अंतर्जात आरएनएआई मशीनरी का उपयोग कर सकते हैं। हालांकि, shRNA रणनीतियों सूक्ष्म जीन तोड़े चढ़ाव अक्सर मामूली सेलुलर phenotypes 2 में जिसके परिणामस्वरूप उत्पादन। एक तोड़े नीचे अधिक physiologically विषमयुग्मजी जीन में शिथिलता के लिए प्रासंगिक हो सकता है, इसकी कमी आई है मजबूती एक नाकआउट की तुलना में उपन्यास जीन की प्ररूपी खोज के लिए आदर्श नहीं है।

एक तीसरा तकनीक है कि हाल ही में उभरा है, CRISPR (नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराएँ संकुल) / Cas9 (CRISPR जुड़ेप्रोटीन 9) प्रणाली है, दोनों एक छोटा सा बहिर्जात आरएनए और डीएनए काटने एंजाइम की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली प्रोकार्योटिक प्रतिरक्षा प्रणाली, विदेशी की पहचान के वायरस से डीएनए पर हमले और Cas9 एंजाइम 3,4 के माध्यम से गिरावट के लिए यह लक्षित करने की एक विधि विकसित जिसमें से अनुकूलित किया गया था। इस शक्तिशाली जीनोम संपादन तकनीक लक्षित विलोपन, सम्मिलन, और म्यूटेशन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; और निम्नलिखित प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करेंगे कैसे आदेश विवो में अपनी अभिव्यक्ति पीटकर करने में ब्याज की एक जीन में विलोपन बनाने के लिए। Cas9 एंजाइम एक गाइड आरएनए एक पाड़ शाही सेना के साथ ब्याज की क्षेत्र के मुताबिक़ और सन्निहित के साथ व्यक्त किया जाना चाहिए। एक जीन इस तकनीक का उपयोग कर के नॉकआउट जीनोम में एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए Cas9 को निशाना सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA) का उपयोग कर, और ब्याज की एक साइट पर डबल असहाय टूटता है (DSBs) उत्प्रेरण की आवश्यकता है। ये DSBs तो गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) जो Le के माध्यम से अंतर्जात सेल की मरम्मत मशीनरी द्वारा मरम्मत कर रहे हैंindels कि missense या बकवास म्यूटेशन का उत्पादन हो सकता है और इसलिए कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति 5 का एक नुकसान बना सकते हैं करने के लिए विज्ञापन। क्योंकि इस प्रणाली जीनोमिक परिवर्तन पैदा करता है, यह केवल Cas9 और sgRNA के क्षणिक अभिव्यक्ति की आवश्यकता है। हालांकि, यह एक स्थिर फ्लोरोसेंट सूचक कोशिकाओं और उनके वंशज इस तरीके में हेरफेर की पहचान करने के लिए वांछनीय है।

Lenti- और रेट्रोवायरस स्थिरतापूर्वक मेजबान कोशिकाओं जो लंबे समय तक बनाए रखने और अभिव्यक्ति बँटवारा दौरान बेटी कोशिकाओं को पारित कर रहे हैं में ब्याज के डीएनए को एकीकृत करने का फायदा है। इस प्रोटोकॉल डिजाइन और दोषपूर्ण प्रतिकृति, उच्च अनुमापांक रेट्रोवायरस के दो प्रकार के उत्पादन का वर्णन करता है: मानव इम्यूनो वायरस निकाली गई lentiviral कणों (lentivirus) और murine मैलोनी ल्यूकेमिया वायरस (रेट्रोवायरस) के आधार पर उन। जबकि इन वायरस के दोनों बड़े transgenes की स्थिर व्यक्त समर्थन करने में सक्षम हैं, रेट्रोवायरल कणों केवल जीनोम डु में एकीकृत कर सकते हैंपरमाणु लिफाफा की गिरावट है, और इसलिए रिंग के साथ कोशिकाओं के विभाजन के लिए एक उपकरण लेबल करने के लिए और जन्म की तारीख कोशिकाओं 6 रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि lentiviruses अपेक्षाकृत कम अनुमापांक 7, इस पद्धति, वायरल संग्रह के दौरान कैफीन 8 के उपयोग सहित होने के लिए एक प्रतिष्ठा है, नियमित तौर पर 10 9 और 10 10 कणों / एमएल के titers पैदा करता है। lenti- और रेट्रोवायरस का एक और लाभ यह बहुत बड़ी आवेषण के लिए सहिष्णुता है। प्रोटोकॉल के निम्न संग्रह एक Lenti डिजाइन या रेट्रोवायरस एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, sgRNAs, और Cas9 डीएनए को संशोधित करने के साथ ही एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एन्कोडिंग के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा।

माउस stereotaxic न्यूरोसर्जरी विवो में वायरस को इंजेक्शन लगाने आकृति विज्ञान, समारोह, और संक्रमित न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है। न्यूरॉन्स में वायरल संक्रमण टिम की एक विस्तारित अवधि में अभिव्यक्ति के स्तर में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइस तरह के विकास के दौरान के रूप में ई, और अभिव्यक्ति ठीक विभिन्न दवा inducible सिस्टम और विशिष्ट Cre संचालित अभिव्यक्ति के उपयोग के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इस विशेष प्रोटोकॉल है कि कैसे एक वायरस एक sgRNA और Cas9 व्यक्त एक वयस्क चूहे के मस्तिष्क में ब्याज की एक जीन पीटा लिए इंजेक्षन करने के लिए बताते हैं। चूहे इस प्रक्रिया और वायरल transgene की अभिव्यक्ति के 48 घंटे बाद इंजेक्शन के भीतर देखा जा सकता से बहुत जल्दी ठीक हो। हालांकि, fluorophore अभिव्यक्ति 3 सप्ताह के बाद संक्रमण से पास अधिक से अधिक स्तर में जिसके परिणामस्वरूप सप्ताह के पाठ्यक्रम पर बढ़ाने के लिए प्रकट होता है। चूहे कि वायरल stereotaxic इंजेक्शन से गुजरना व्यवहार, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, या रूपात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं के उद्देश्य प्रदर्शित करने के लिए stereotaxic सर्जरी और एक वायरस एक विशिष्ट sgRNA और Cas9 व्यक्त का उपयोग कर वयस्क माउस मस्तिष्क में एक जीन पीटा के लिए है।

Protocol

आचार कथन: सभी प्रोटोकॉल डार्टमाउथ संस्थागत जैव सुरक्षा और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. CRISPR / Cas9 Retrovirus के लिए एक गाइड स्ट्रैंड (sgRNA) डिजाइनिंग के लिए प्रोटोकॉल

नोट: कई गैर लाभ वेबसाइटों है कि sgRNAs उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ब्याज की एक जीन को निशाना बनाने (https://benchling.com/ और http://crispr.mit.edu/) कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए डिजाइन और एक वाणिज्यिक विक्रेता है कि एक दूसरे के लिए annealed रहे हैं से एकल असहाय ओलिगोस आदेश है। इस annealed oligo PXL हस्तांतरण वेक्टर में ligated कर दिया जाएगा। Benchling का उपयोग कर डिजाइनिंग sgRNAs का एक उदाहरण के लिए पूरक वीडियो 1 देखें।

  1. sgRNAs डिजाइन करने के लिए समर्पित एक वेबसाइट का प्रयोग करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, वेबसाइट में ब्याज की जीन की शुरुआत के पास से एक कोडिंग / exonic अनुक्रम inputting एक 20 न्यूक्लियोटाइड sgRNA उत्पन्न होगा। भावना और विरोधी भावना oligo डिजाइन करने के लिए 20 न्यूक्लियोटाइड sgRNA अनुक्रम का प्रयोग करेंकि sgRNA बनाने के लिए आदेश दिया जाएगा।
  2. sgRNA पैदा करने के बाद, एक शब्द संसाधक में इस क्रम कॉपी। दस्तावेज़ में 20 न्यूक्लियोटाइड sgRNA अनुक्रम की शुरुआत करने के लिए एक जी (गुआनिन) जोड़ें, तो यह पहले से ही एक है (यानी, जी -20 न्यूक्लियोटाइड sgRNA अनुक्रम) के साथ शुरू नहीं करता है। इस U6 प्रमोटर बंद अच्छा प्रतिलेखन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
  3. अब यह 20-21 न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के रिवर्स पूरक दस्तावेज़। भावना oligo के लिए, दस्तावेज़ (यानी, CACC-G-20 न्यूक्लियोटाइड sgRNA अनुक्रम) में अनुक्रम के 5 'अंत करने के लिए "CACC" जोड़ें। यह अधिकता PXL वेक्टर में अनुक्रम ligate करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. antisense oligo के लिए, 5 'को समाप्त करने के AAAC जोड़ें। PXL वेक्टर में अनुक्रम ligate को यह अधिकता का प्रयोग करें।
  5. भावना और antisense oligos प्राप्त करते हैं। ओलिगोस प्राप्त करने के बाद, DNase मुक्त पानी का उपयोग कर 100 माइक्रोन के शेयरों बनाते हैं। एक साथ 4 μ के साथ 10 μl 100 सुक्ष्ममापी भावना और antisense oligos के प्रत्येक मिक्स10x चंचु बफर 2, और पानी के 16 μl के एल।
    नोट: (के रूप में BbsI overhangs गैर-संगत एकजुट समाप्त होता है) कर रहे हैं वे पेज शुद्धि या 5'phosphorylation जरूरत नहीं है।
    1. एक 500 मिलीलीटर बीकर में एक फोड़ा करने के लिए पानी की 200 मिलीलीटर लाओ, फिर एक फोम "फ्लोटर" धारक में इस मिश्रण युक्त ट्यूब तैरने लगते हैं। पानी के लिए धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस से शांत करने की अनुमति दें।
    2. बाँझ पानी में 1,000 और निम्न बंधाव में तुरंत उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष प्रतिक्रिया की दुकान: पतला अब annealed-oligo मिक्स 1।
  6. डाइजेस्ट PXL, एक PX330 वेक्टर व्युत्पन्न, 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर BbsI प्रतिबंध एंजाइम के साथ। एक 40 μl PXL के 2 माइक्रोग्राम, 10x चंचु बफर 2, 1 Bbs1 और संतुलन पानी की μl के 4 μl युक्त प्रतिक्रिया का प्रयोग करें। एक वाणिज्यिक किट का उपयोग दिनचर्या जेल शुद्धि को पचा-PXL अधीन। सुनिश्चित करें कि उपज ~ 8.5 kB उत्पाद।
  7. 1,000: एक वाणिज्यिक बंधाव किट का प्रयोग, 1 का 1 μl ligateपचा और जेल शुद्ध-PXL के 50 एनजी के साथ annealed-ओलिगोस। कमी ई सक्षम पुनर्संयोजन में बंधाव उत्पाद रूपांतरण कोली (चंचु 5-अल्फा, subcloning दक्षता)। प्लास्मिड डीएनए अनुक्रमण द्वारा सही गाइड की उपस्थिति के लिए transformants स्क्रीन।
  8. PXL से बाहर U6, गाइड किनारा, और आरएनए पाड़ तत्वों (sgRNA) BstB1 और Pac1 प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कर डाइजेस्ट और फ्लोरोसेंट प्रोटीन-T2A-Cas9 वायरल ही प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा रीढ़ की हड्डी में ligate। बंधाव उत्पाद (चंचु 5-अल्फा अधिकतम क्षमता) रूपांतरण। फ्लोरोसेंट प्रोटीन-T2A-Cas9 वायरल रीढ़ plasmids कम प्रतिलिपि plasmids कर रहे हैं और इस प्रकार कम प्रतिलिपि प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए।
    नोट: एक दूसरे sgRNA इसी तरह एक और PXL गाइड कतरा प्लाज्मिड के Paci पाचन द्वारा पेश किया जा सकता है और Pac1 में ligated पचता है और बछड़ा आंत्र फॉस्फेट पहले से ही पहली गाइड कतरा युक्त वायरल रीढ़ की हड्डी का इलाज किया। वायरल हस्तांतरण प्लाज्मिड के फॉस्फेट उपचार में मदद मिलेगीदूसरी गाइड युक्त नहीं plasmids के आत्म बंधाव से transformants की संख्या कम है।
  9. अनुक्रम Nucleobond एक्स्ट्रा मैक्सी तैयारी किट का उपयोग कर अंतिम प्लाज्मिड और मैक्सी तैयारी को सत्यापित करने और एक वायरस के लिए "रेट्रो / Lentiviral उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल - CaPO4 विधि" का उपयोग करने में यह पैकेज।

2. अभिकर्मक के लिए 293FT / 293GP कोशिकाओं को तैयार (रेट्रो / Lentiviral उत्पादन - CaPO4 विधि)

  1. (1 दिन) तेजी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्रति 10 सेमी सेल संस्कृति की थाली कोशिकाओं के 1 शीशी पिघलना। lentiviral पैकेजिंग के लिए, 293FT कोशिकाओं का उपयोग करें। रेट्रोवायरल पैकेजिंग के लिए, 293GP (झूठ / पीओएल) कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में क्रायो ट्यूब से thawed-कोशिकाओं के सभी पिपेट और पूर्व गर्म सीओ 2 equilibrated-पूरा Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. 500 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पूरा हो गया है के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspendकोव संशोधित Dulbecco मध्यम। एक 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान पर कोशिकाओं थाली। एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. (2 दिन) चढ़ाना के बाद 24 घंटे, मौजूदा मीडिया aspirating और थाली करने के लिए पूर्व गर्म Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर प्लेट पर मीडिया बदल जाते हैं।
    1. (दिन 3-4) मीडिया परिवर्तन के बाद 24-48 घंटा और कोशिकाओं एक बार मिला हुआ हो, 2.5-3.0 x 10 6 कोशिकाओं / प्लेट (10 सेमी प्लेट) की एक confluency के लिए कोशिकाओं को विभाजित।
    2. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, मीडिया aspirate और पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ थाली धो लें। थाली करने के लिए 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं थाली से उठा। Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम से 0.5 मिलीलीटर 0.25% trypsin प्रतिक्रिया बेअसर और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं पिपेट में जोड़े।
    3. 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं स्पिन। Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम से 1 एमएल में कोशिकाओं Resuspend। पतला 1081, पीबीएस के 90 μl में कोशिकाओं की एल। या तो एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना। पुन प्लेट 2.5-3.0 x 10 6 कोशिकाओं / पूरा Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम के साथ प्लेट।
      नोट: कोशिकाओं हो जाएगा ~ चढ़ाना के बाद 50% मिला हुआ 24-34 घंटा। कोशिकाओं transfect जब वे कर रहे हैं ~ 50% मिला हुआ।

3. दिवस (5) CaPO4 अभिकर्मक और वायरल कण संग्रह

  1. मौजूदा मीडिया aspirating और पूर्व गर्म Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़कर अभिकर्मक के लिए पहले मीडिया 2 घंटा बदलें। सुनिश्चित करें ठीक है कि वहाँ 10 सेमी की थाली में मीडिया के 10 मिलीलीटर।
  2. 2, 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब का उपयोग 2 व्यंजनों के लिए अभिकर्मक अभिकर्मकों तैयार करें। पहली ट्यूब "डीएनए" और दूसरी ट्यूब "2X HBS" लेबल। 7.4 पीएच पर Tris-EDTA में / μl 1μg करने के लिए डीएनए की एकाग्रता को समायोजित करें।
    1. lentiviruses के लिए, धीरे-धीरे हस्तांतरण वेक्टर के 20 μl (वीरा जोड़नेब्याज की एल निर्माण), CMVdelta8.9 के 13 μl, VSV जी के 9 μl, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड एच 2 ओ के 860 μl, और पहली ट्यूब ( "डीएनए") के लिए 2.5 एम 2 CaCl के 100 μl जबकि लगातार दोहन ट्यूब पर मिश्रण करने के लिए।
    2. रेट्रोवायरस के लिए, CMVdelta8.9 प्लाज्मिड न आना। 20 μl स्थानांतरण वेक्टर, 15 μl VSV जी, 860 μl आणविक जीव विज्ञान ग्रेड एच 2 हे, और 100 μl 2.5 एम 2 CaCl ट्यूब लेबल "डीएनए" में जोड़े।
    3. 2x HEPES बफर खारा के 1 मिलीलीटर जोड़ें (पीएच 7.0, यह पीएच पूरी तरह से गंभीर है) ट्यूब लेबल "2X HBS" करने के लिए।
    4. धीरे धीरे, एक समय में एक बूंद "2X HBS" ट्यूब के लिए "डीएनए" ट्यूब के 1 मिलीलीटर सामग्री जोड़ें। जबकि "डीएनए" ट्यूब की सामग्री जोड़ने लगातार सूचकांक या मध्यम उंगली के साथ "2X HBS" ट्यूब नल। प्रत्येक गिरावट के बाद स्पष्ट Capo 4 पुटिकाओं का निरीक्षण करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में ट्यूब सेते हैं।
  3. प्रत्येक 10 सेमी सेल थाली करने के लिए धीमी गति से बूंदों में अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें, तो रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस सेते हैं।
  4. (6 दिन) Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम + 0.5% FBS के 8 मिलीग्राम और 40 मिलीग्राम कैफीन / 100 मिलीलीटर मीडिया के साथ मीडिया बदलें। हस्तांतरण वेक्टर एक फ्लोरोसेंट मार्कर होता है, तो fluorophore अभिव्यक्ति एक सफल अभिकर्मक इंगित करता है।
  5. (7 दिन) एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करके वायरल कणों से युक्त मीडिया लीजिए और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बांटना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्टोर। प्रत्येक थाली करने के लिए 0.5% FBS मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. (दिवस 8) फिर से, वायरल कणों से युक्त मीडिया को इकट्ठा करने और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पिछले दिन की फसल के साथ गठबंधन।

4. एकाग्रता और वायरस की शुद्धि

  1. 2 ओ DDH करने के लिए 40% पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 और 1.5 एम NaCl जोड़कर एक 5x पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 समाधान करें पर समाधान आटोक्लेव121 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए तरल चक्र। धीरे-धीरे समाधान मिश्रण जब ठंडा।
    नोट: समाधान बादल शुरू कर देंगे और उसके बाद स्पष्ट हो गया है के रूप में यह होता है।
  2. आदेश में अघुलनशील सामग्री गोली में 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार वायरल सतह पर तैरनेवाला के दोनों संग्रह युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र। एक 0.45 माइक्रोन से कम प्रोटीन बाध्यकारी सिरिंज फिल्टर (पी इ एस या PVDF) के माध्यम से छान कर वायरल मीडिया शुद्ध।
  3. जोड़े 5x पॉलीथीन ग्लाइकोल मीडिया के लिए 6000 समाधान (अंतिम एकाग्रता 8% पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 और 0.3 एम NaCl) होना चाहिए। ट्यूब कई बार (भंवर नहीं करते हैं) inverting द्वारा मिक्स। 12 या उससे अधिक घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर वायरल युक्त पॉलीथीन ग्लाइकोल समाधान सेते हैं, कभी कभी remixing।
  4. (दिवस 9) अपकेंद्रित्र 45 मिनट के लिए 2500 XG पर वायरल युक्त पॉलीथीन ग्लाइकोल समाधान। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने और 2 मिनट के लिए फिर से स्पिन। फिर, हटाने और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. के 320 μl जोड़कर गोली Resuspendबाँझ फॉस्फेट बफर खारा और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते (320 μl वायरल युक्त मीडिया एकत्र की मूल मात्रा का 1/100 वें) है। वैकल्पिक रूप से, 30 मिनट के लिए एक घुमाव पर कमरे के तापमान पर गोली resuspend।
  6. गोली फिर से निलंबित करने के बाद, विभाज्य वायरस (5-10 प्रति μl 0.5 मिलीलीटर ट्यूब) और -80 डिग्री सेल्सियस (फ्रीज 4 डिग्री सेल्सियस पर विगलन या भंडारण नाटकीय रूप से कम हो जाएगा अनुमापांक) पर aliquots फ्रीज।
  7. मानक प्रोटोकॉल, IE का उपयोग वायरस अनुमापांक, HEK293T कोशिकाओं के 6 अच्छी तरह से थाली पर एक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन और मैन्युअल 48 घंटा बाद में फ्लोरोसेंट कालोनियों गिनती।

5. CRISPR वायरस का परीक्षण प्रभावकारिता

नोट: निम्न चरणों का उपयोग अनुक्रम क्लोन NHEJ द्वारा मरम्मत डबल भूग्रस्त टूटता माउस Neuro2A कोशिकाओं का उपयोग कर के उत्पादन के लिए परीक्षण करने के लिए। यह सर्वेक्षक assays में है कि यह कोशिकाओं का प्रतिशत है कि संशोधित किया गया है और प्रकृति का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से अधिक लाभ दियाindels NHEJ से उत्पन्न की।

  1. ऐसे Matrigel के रूप में कोट एक पतला प्रोटीन मिश्रण के साथ एक 3.5 सेमी सेल संस्कृति डिश Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम 1:50 पतला और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। पतला प्रोटीन मिश्रण Aspirate और Neuro2A कोशिकाओं थाली।
  2. बाद Neuro2A कोशिकाओं 50% संगम तक पहुँचने, 10 के संक्रमण की बहुलता पर CRISPR Lentivirus या Retrovirus जोड़ने (यानी, सेल प्रति 10 वायरल कणों)।
    नोट: Neuro2A कोशिकाओं के रूप में HEK293 कोशिकाओं रहे संक्रमण के रूप में मिलनसार नहीं कर रहे हैं, इस प्रकार, एक एकल संक्रमण कोशिकाओं lentivirus से संक्रमित होने की 100% में परिणाम नहीं होगा। इसके अलावा, रेट्रोवायरस केवल कोशिकाओं को विभाजित संक्रमित करता है और इसलिए भी 100% संक्रमण में परिणाम नहीं होगा। आदेश में संक्रमण के एक के पास 100% की दर को प्राप्त करने के लिए, वायरस के अलावा कई दिनों पर दोहराया जा सकता है, जरूरत के रूप में कोशिकाओं को विभाजित। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट सकारात्मक कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर अलग किया जा सकता है। गुई एक lentiviruses के साथ एक 100% संक्रमण की दर प्राप्त करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका FACS अलगाव के बाद एक एकल संक्रमण प्रदर्शन है। एक रेट्रोवायरस के लिए, 24 घंटा के अलावा संक्रमण के 4-राउंड प्रदर्शन और 100% संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए FACS अलगाव से पालन करें।
  3. 1 सप्ताह के लिए कोशिकाओं को संक्रमित करने के बाद, एक 10 सेमी की थाली पर पास संगम के लिए कोशिकाओं का विस्तार मीडिया aspirate, और फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर के साथ थाली धो लें। 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं थाली से उठा। Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम से 0.5 मिलीलीटर 0.25% trypsin प्रतिक्रिया बेअसर और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं पिपेट और 5 मिनट के लिए 500 XG पर गोली कोशिकाओं में जोड़े।
  4. डीएनए को अलग-थलग करने के लिए, 50 मिमी पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के 100 μl जोड़ने के लिए, कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और 95 पर सेते 5 मिनट के लिए सें। समाधान 1 एम Tris, पीएच = 8.0 के 10 μl का उपयोग कर बेअसर।
  5. पीसीआर क्षेत्र जीनोमिक क्षेत्र CRISPR sgRNA द्वारा लक्षित flanking बढ़ानाका उपयोग कर ~ डीएनए के 300 एनजी 5.5 कदम में पृथक एक उच्च निष्ठा पीसीआर मास्टर मिश्रण 4 का उपयोग कर।
  6. इस तरह के एक जेल डीएनए वसूली किट के रूप में 2.5% agarose जेल और जेल शुद्ध टुकड़ा एक जेल शुद्धि किट का उपयोग उचित आकार पर पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएँ। PGEM टी आसान के रूप में एक पीसीआर क्लोनिंग वेक्टर ऐसे में ligate और सक्षम कोशिकाओं 9 में बदलना।
  7. 24 घंटा बाद में, एक 15 मिलीलीटर दौर तली ट्यूब के रूप में अच्छी तरह से उचित एंटीबायोटिक (एम्पीसिलीन, neomycin, आदि) में लेग शोरबा के 2 मिलीलीटर जोड़ें। लेग प्लेट से एक भी कॉलोनी का चयन करने के लिए एक बाँझ विंदुक टिप या पाश का उपयोग करके एक व्यक्ति कॉलोनी के साथ ट्यूब टीका लगाना। विस्तार और 250 आरपीएम और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब झटकों से कॉलोनी बढ़ता है। के रूप में कई कालोनियों के लिए दोहराएँ के रूप में वांछित।
    1. एक मिनी प्रस्तुत करने का किट का उपयोग करना, ई से डीएनए को अलग-थलग कोलाई और व्यवस्था माउस जीनोम के Cas9 लक्षित क्षेत्र का विश्लेषण करने में जीन sgRNA द्वारा लक्षित क्षेत्र बढ़ाना करने के लिए डिजाइन प्राइमरों के साथ अनुक्रम।

वयस्क माउस के लिए 6. stereotaxic इंजेक्शन प्रोटोकॉल

  1. सर्जरी के लिए तैयार
    नोट: यह अस्तित्व सर्जरी के दौरान बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इस सर्जरी के उपकरणों स्टरलाइज़, betadine का उपयोग कर इंजेक्शन साइट बाँझ, और चीरा साइट के लिए एंटीबायोटिक मलहम जोड़ने के बाद इसे बंद कर दिया है गर्मी से इस प्रोटोकॉल में पूरा किया है। यह भी बाँझ दस्ताने के साथ ही एक अच्छी तरह से निष्फल, समर्पित सर्जरी क्षेत्र का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    1. हीट बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण या तो autoclaving या एक का उपयोग कर गर्म मनका अजीवाणु द्वारा उपयोग करने से पहले। सर्जरी और वसूली के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड पर बदल कर वसूली कक्ष और शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार। इंजेक्शन के लिए खोपड़ी में छेद बनाने के लिए इस्तेमाल ड्रिल इकट्ठा करो।
    2. लोड बाँझ पीसीआर ट्यूब से सीधे वायरस वापस लेने के द्वारा इंजेक्शन सुई में वायरस के 4 μl। संक्षेप में बर्फ से वायरल विभाज्य को हटा दें। वायरस बनाए रखेंइंजेक्शन से पहले नहीं 1 से अधिक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सिरिंज में।

7. stereotaxic इंजेक्शन

  1. पुष्टि करें कि सर्जरी सूट करने के लिए वेंटिलेशन उचित हवा का प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए खुला है। एक प्रेरण कक्ष में 4% isoflurane साथ anesthetizing द्वारा शल्य चिकित्सा के लिए माउस को तैयार है। संज्ञाहरण के बाद, सिर दाढ़ी इंजेक्शन साइट तैयार करने के लिए।
    1. जीभ के नीचे स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करके और टीम के लिए stereotaxic साधन में माउस रखें। जब तक दांत स्लॉट में छोड़ देता है, तो कान सलाखों सुरक्षित मुंह में काटने बार डालें। सुनिश्चित करें कि माउस के शरीर हीटिंग पैड पर है और नाक नाक शंकु में स्थित है। नाक शंकु में प्रत्यक्ष 4% isoflurane। चिमटी के साथ पैर बन्द रखो और कोई डराना पलटा है कि वहाँ सुनिश्चित करने के द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    2. कृत्रिम आँसू लागू आंखों चिकना करने के लिए। समाप्त पीओवी की बारी दौर के साथ सिर के बाल काटे swabbing द्वारा इंजेक्शन साइट तैयारीidone आयोडीन और lidocaine।
  2. एक छुरी का प्रयोग, खोपड़ी के केंद्र के साथ छोटा सा चीरा काट दिया। एक झाड़ू और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ खोपड़ी सूखी यदि आवश्यक हो तो मदद करने के लिए शीर्षस्थान कल्पना।
    1. एक विदारक गुंजाइश का प्रयोग, खोपड़ी पर पर्वबिन्दु लगाने और शीर्षस्थान पर ड्रिल टिप जगह है। शून्य (या रिकॉर्ड) एक्स, वाई, जेड और विमानों पर डिजिटल स्टीरियोटैक्टिक निर्देशांक।
    2. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए कि सिर व्याख्यान चबूतरे y अक्ष दुम करने पर स्तर है, लैम्ब्डा पर ड्रिल बिट जगह है और सिर स्तर इतना है कि जेड समन्वय दोनों शीर्षस्थान और लैम्ब्डा पर लगभग बराबर है।
    3. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए है कि सिर का एक्स-अक्ष पर स्तर है, y = 1/2 लैम्ब्डा ड्रिल बिट जगह है। सुनिश्चित करें कि जेड समन्वय बाण सीवन के प्रत्येक पक्ष (एक्स = +/- 1 मिमी) पर 1 मिमी पर बराबर है। अगर वहाँ में एक फर्क है खोपड़ी को समायोजित करें छोड़ दिया और लैम्ब्डा के अधिकार के लिए 1mm पर जेड समन्वय।
  3. वांछित निर्देशांक खत्म ड्रिल रखें। दांतेदार गाइरस के लिए, निर्देशांक का उपयोगएसवाई शीर्षस्थान और एक्स = +/- 1.1 से = -1.9। ड्रिलिंग से पहले, 2% isoflurane कम है, तो धीरे धीरे और सावधानी से, खोपड़ी के माध्यम से ड्रिल।
    1. सभी छेद ड्रिलिंग के बाद, stereotaxic साधन पर भरे सिरिंज प्रत्यय। दिखने में छेद पर सिरिंज केंद्र और शून्य Z खोपड़ी में समन्वय।
    2. धीरे-धीरे गहरी Z गहराई के लिए सिरिंज कम है। दांतेदार गाइरस के लिए, Z गहराई -2.5, -2.4, -2.3 और कर रहे हैं। एक stereotaxic इंजेक्टर का उपयोग कर 0.25 μl / मिनट की दर से इंजेक्शन शुरू करो।
      1. इंजेक्शन सबसे कम जेड गहराई में पूर्ण होने पर, 1 मिनट रुको, तो समन्वय स्थापित करने के लिए अगले बढ़ाने के लिए और इंजेक्शन फिर से शुरू करते हैं। इस पैटर्न जारी रखें जब तक सभी जेड इंजेक्शन निर्देशांक इंजेक्ट कर रहे हैं। पिछले इंजेक्शन के बाद सिरिंज को हटाने से पहले 2 मिनट रुको।
        नोट: कोई प्रतिकूल प्रभाव माउस मस्तिष्क में गोलार्द्ध प्रति वायरस के 2 μl अप करने के लिए इंजेक्शन द्वारा ऊतक पर उल्लेख किया गया है।
    3. अन्य बोर छेद के लिए दोहराएँ इंजेक्शन।
  4. इंजेक्शन के बाद, stereotaxic साधन से माउस को हटाने और 6-0 रेशम टांके के साथ खोपड़ी सिवनी। Lidocaine और घाव करने के लिए एक विरोधी बैक्टीरियल क्रीम लगाओ।
    1. दर्द का प्रबंधन करने के लिए आईपी मार्ग के माध्यम से 0.8-1.0 मिलीलीटर खारा + Ketoprofen (3-5 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन। फिर गरम वसूली कक्ष में माउस जगह है। पशु छोड़ पहुंच से बाहर है जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है अन्य जानवरों की कंपनी के लिए पशु वापस नहीं है।
  5. दिन सर्जरी के बाद में, दैनिक माउस वजन और नरम भोजन और व्यवहार करता है प्रदान करते हैं। घाव की जाँच करें और ध्यान दें सामान्य स्थिति / आचरण।
  6. Stereotaxic इंजेक्शन के बाद, चूहों टुकड़ा प्रस्तुत करने का इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी 1 के लिए euthanized जा सकता है या भरकर रखा जाता है और उनके दिमाग को हटा दिया, कटा हुआ, और विश्लेषण के लिए 10 immunohistochemistry के माध्यम से सना हुआ।

Representative Results

"CRISPR / Cas9 Retrovirus के लिए एक गाइड स्ट्रैंड (sgRNA) डिजाइनिंग के लिए प्रोटोकॉल" के बाद, एक विशेष अनुक्रम को निशाना ओलिगोस hU6 प्रमोटर के बहाव PXL क्लोनिंग वेक्टर में डाला जाता है और BbsI क्लोनिंग साइटों का उपयोग कर एक गाइड आरएनए पाड़ के नीचे की ओर जाता है (चित्रा 1, चरण 1)। इस sgRNA तो PXL से excised और BstBI और Paci साइटों (चित्रा 1, चरण 2) का उपयोग कर pRubi रीढ़ की हड्डी में डाला जाता है। अंत में, एक और sgRNA PXL में क्लोन pRubi-Guide1 (चित्रा 1, चरण 3) में पहली गाइड के बहाव रखा जा सकता है, जीन के एक अन्य क्षेत्र को लक्षित और NHEJ के माध्यम से एक पीटकर की संभावना बढ़ रही है। सही निर्माणों का सत्यापन अनुक्रम विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। एक बार जब इस निर्माण किया जाता है, यह एक वायरस के लिए "रेट्रो / Lentiviral उत्पादन के CaPO4 विधि के लिए प्रोटोकॉल" में पैक किया जा सकता है। सफल पैकेजिंग आदेश वी अनुमापांक करने में HEK293 कोशिकाओं में वायरस के संक्रमण की पुष्टि की हैirus। अगर कोई fluorophore अभिव्यक्ति है तो वहाँ की संभावना वायरस की पैकेजिंग के दौरान एक त्रुटि थी।

चित्रा 2 2 रेट्रोवायरस, एक व्यक्त GFP और अन्य व्यक्त mCherry के एक प्रतिनिधि परिणाम है, नवजात माउस (7 दिन पुराना) की दांतेदार गाइरस में सह इंजेक्शन और 21 दिन imaged के बाद इंजेक्शन। mCherry या GFP के साथ न्यूरॉन्स की लेबलिंग केवल एक fluorophore व्यक्त की अनुमति देता है एक ही ऊतक में विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़, जहां एक वायरस एक CRISPR व्यक्त कर सकते हैं की रूपात्मक आकलन / Cas9 मध्यस्थता KO और अन्य एक नियंत्रण वायरस। Stereotaxic इंजेक्शन सटीक संरचनात्मक चयनात्मकता के रूप में करना निर्देशांक, दांतेदार गाइरस के असतत संक्रमण द्वारा प्रदर्शन की अनुमति देता है। जब संक्रमण के लिए मस्तिष्क वर्गों का विश्लेषण, यह आसपास के ऊतकों को रखने के लिए जब तक यह निर्धारित किया जाता है कि सही संरचनात्मक क्षेत्र संक्रमित किया गया था महत्वपूर्ण है। अगर वहाँ संक्रमण के कोई संकेत नहीं है, तो यह संभव है कि इंजेक्शन के एक पड़ोसी क्षेत्र एक में हुईडी आसपास के वर्गों में पहचाना जा सकता है। यह भी सटीक इंजेक्शन लगाने के लिए क्षेत्र सुई ट्रैक का पता लगाने में सहायक हो सकता है। VSVG छद्म वायरस शायद ही कभी के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण (चित्रा 3) द्वारा विश्लेषण किया है, जब विवो में इंजेक्शन, और पूरे दांतेदार गाइरस साथ व्याख्यान चबूतरे / दुम अक्ष संक्रमित कोशिकाओं के साथ फैल जाते हैं दांतेदार गाइरस के हाशिये से बाहर फैल गया।

आकृति 1
चित्रा 1:। रेट्रोवायरल pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR प्लाज्मिड के लिए क्लोनिंग रणनीति इस रणनीति फू-आधारित lentiviral प्लास्मिड के लिए समान है। sgRNA ओलिगोस annealed और BSBI क्लोनिंग साइटों का उपयोग कर PXL में डाला जाता है। अनुक्रमण सुनिश्चित करने के बाद कि sgRNA सफलतापूर्वक PXL में डाला जाता है, BstBI और Paci साथ प्लाज्मिड को पचाने। डालें कि (ब्लैक बॉक्स) बाहर गिरा दिया जाता है तो वायरल वापस ख में क्लोन हैएक काले (बिंदीदार रेखा) pRubi-Guide1 CRISPR। एक दूसरा sgRNA भी PXL में डाला जा सकता है और Paci एंजाइम का उपयोग कर बाहर पच। यह तो pRubi-Guide1 CRISPR वेक्टर (लाल बिंदीदार रेखा) Paci साइट का उपयोग में क्लोन है। परिणामी प्लाज्मिड तो गाइड किस्में दोनों के साथ ही आवश्यक वायरल तत्व, प्रमोटरों, और fluorophores होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। माउस दांतेदार गाइरस के रेट्रोवायरल इंजेक्शन रेट्रोवायरस mCherry (लाल) या GFP (हरा) को व्यक्त करने के लिए एक P7 माउस के दांतेदार गाइरस में इंजेक्ट किया गया। 21 दिन बाद चूहों perfused थे और दिमाग sectioned और GFP और mCherry के लिए दाग। (ए) एक 5x व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट छवि जनसंपर्क चलतादांतेदार गाइरस इंजेक्शन की ecision और लेबलिंग दांतेदार गाइरस ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की विशिष्टता। हिप्पोकैम्पस की आकृति विज्ञान DAPI (नीला) धुंधला के माध्यम से देखा जा सकता है। स्केल बार 200 माइक्रोन के उपाय। (बी) के एक 10x व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट छवि को दर्शाता है कि इन उच्च अनुमापांक lentiviruses कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है जिसकी आकृति विज्ञान fluorophore अभिव्यक्ति के माध्यम से पहुँचा जा सकता है संक्रमित। स्केल बार 100 माइक्रोन के उपाय। (सी) वायरस GFP या mCherry व्यक्त दांतेदार गाइरस में सह इंजेक्शन थे। रेट्रोवायरस की एक प्रणाली का उपयोग करते हुए, एक के बाद एक आनुवंशिक हेरफेर GFP और एक अन्य हेरफेर mCherry द्वारा चिह्नित द्वारा चिह्नित करने के लिए एक वायरस का उपयोग कर सकते हैं, और फिर एक वायरस के कारण एक या additive परिवर्तन का आकलन करें। स्केल बार 10 माइक्रोन के उपाय।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Lentiviral इंजेक्शन के संरचनात्मक प्रसार Stereotaxic coinjection एक GFP-shPten वायरस और एक वयस्क के मस्तिष्क में एक mCherry नियंत्रण वायरस के PTEN loxP / + माउस पूरे व्याख्यान चबूतरे / हिप्पोकैम्पस के दांतेदार गाइरस की दुम अक्ष के साथ एक वायरल प्रसार में हुई। इस इंजेक्शन के लिए किस हद तक में बंद कर दिया वायरल प्रसार की आकृति 21 धारावाहिक वर्गों (जेड = 50 माइक्रोन / अनुभाग) पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने पर पता लगाया गया की एक 3 डी पुनर्निर्माण में दिखाया गया है। समोच्च ट्रेसिंग तो मात्रा मात्रा का ठहराव के लिए 3 डी छवियों को उत्पन्न करने के लिए गठबंधन किया गया। कुल वायरल प्रसार हरे रंग में दिखाया गया है (मात्रा = 54730800 माइक्रोन 3) और दांतेदार स्थानीय प्रसार बैंगनी रंग में दिखाया गया है (मात्रा = 27275200 माइक्रोन 3)। वायरस सुई ट्रैक और दांतेदार गाइरस के व्याख्यान चबूतरे / दुम अक्ष भरने के अलावा सुई ट्रैक के चौराहे पर महासंयोजिका साथ फैलता है। स्केल बार 200 माइक्रोन के उपाय।

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पूरक 1 वीडियो sgRNAs के डिजाइन रेट्रोवायरल और lentiviral रीढ़ की हड्डी में क्लोन करने के लिए।
इस कृत्रिम गाइड आरएनए (sgRNA) डिजाइन उदाहरण में, माउस CHD8 के जीनोमिक अनुक्रम एन सी बी आई से डाउनलोड किया जाता है। प्रारंभ कोडोन और एक्सॉन संरचना तो वेक्टर एनटीआई में कल्पना कर रहे हैं। यह हमें पहले कोडिंग एक्सॉन के आसपास जीनोमिक क्षेत्र कॉपी और Benchling में इस क्रम में प्रवेश करने की अनुमति देता है। Benchling हमें इस क्षेत्र में सभी संभावित sgRNAs कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हम जीनोमिक क्षेत्र इनपुट का संकेत के बाद, Benchling हमें प्रत्येक गाइड शाही सेना के लिए ऑन-लक्ष्य और बंद लक्ष्य स्कोर दिखाएगा। उपयोगकर्ता तो उच्चतम राशि पर और बंद लक्ष्य स्कोर के साथ गाइड आरएनए का चयन कर सकते हैं। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

Discussion

वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सफल वायरल पैकेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं। के रूप में अस्वस्थ कोशिकाओं बहुत उत्पादित वायरस की मात्रा कम हो जाएगा सेल स्वास्थ्य से पहले और अभिकर्मक के दौरान महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक और पैकेजिंग सफल रहे हैं, तो कोशिकाओं की 100% fluorophore व्यक्त करना चाहिए और कोशिकाओं को एक कार्यात्मक संकोश फार्म चाहिए। कदम 3.2.4 में, ट्यूब दोहन कुशलता से उच्च अनुमापांक अभिकर्मक के लिए आवश्यक है, और HEPES बफर खारा के पीएच सटीक होना चाहिए। मैक्सी preps कि वायरल पैकेजिंग के लिए आवश्यक plasmids उत्पादन अत्यंत शुद्ध होना चाहिए। इस बात के लिए, यह अंतिम डीएनए क्षालन वेग इथेनॉल के लिए और Tris-EDTA बफर में फिर से निलंबित सहायक है। यह भी है कि मीडिया कैफीन वायरल संग्रह से पहले दिन 6 (3.4 कदम) को जोड़ा जाता है में 2% या उससे कम करने के लिए सीरम की मात्रा को कम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। सीरम कम नहीं है, तो अंतिम वायरस शुद्ध सीरम prot की एक अवांछनीय राशि में शामिल होंगेein। पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 जब वायरल कणों precipitating के उपयोग की आवश्यकता ultracentrifugation शामिल नहीं है। यह भी ध्यान दें कि Cas9 CRISPR युक्त वायरस आम तौर पर 10 के आसपास एक अनुमापांक गुना केवल एक fluorophore युक्त वायरस की तुलना में कम है महत्वपूर्ण है।

stereotaxic सर्जरी के लिए, साँस संज्ञाहरण के उपयोग के इंजेक्शन anesthetics की तुलना में तेजी से और सटीक नियंत्रण या जानवर की चेतना की अनुमति देता है और एक बड़ा आयु सीमा से अधिक संज्ञाहरण अनुमति देता है। यह अत्यधिक सर्जिकल उपकरणों को साफ और बाँझ रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्ष्य-निर्धारण सिर की सटीक स्थिति की आवश्यकता है। सुनिश्चित करें कि कोई पिचिंग या stereotaxic साधन में और खोपड़ी जगह में मजबूती का मानना ​​है कि सिर के रोलिंग वहाँ है सुनिश्चित करें। यह खोपड़ी आदेश stereotaxic निर्देशांक निर्धारित करने के लिए टांके खोजने के लिए शुष्क करने की अनुमति देने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, दर और प्रत्येक के लिए मात्रा stereotaxic समन्वय के अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए।

इस तकनीक में सीमित है कि एक lenti- या रेट्रोवायरस के प्रसार को सीमित रखा गया है, खासकर जब (AAVS) .Therefore एडिनो से जुड़े वायरस की तुलना में, इन वायरस जब एक असतत मस्तिष्क क्षेत्र को संक्रमित करने के लिए मूल्यवान हैं, लेकिन कुल मिलाकर संक्रमण के लिए नहीं AAVS के साथ जुड़े पशुओं में व्यवहार विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया। इस प्रोटोकॉल में कैफीन का उपयोग बहुत इन वायरस के अनुमापांक बढ़ जाती है, लेकिन वे अभी भी titers एएवी पैकेजिंग में हासिल रूप में उच्च नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, स्थिर एकीकरण, केवल fluorophore अभिव्यक्ति का एक फायदा है CRISPR / Cas9 रूपों के रूप में स्थिर जीनोमिक संपादन भी जब क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट और यह संभव है कि पर जा रहा है Cas9 और sgRNA की अभिव्यक्ति के अंत में लक्ष्य प्रभाव बंद उत्पादन हो सकता है। क्षणिक अभिव्यक्ति AAVS साथ CRISPR / Cas9 प्रणाली जीनोमिक परिवर्तन है कि कोशिका विभाजन के दौरान प्रचार कर रहे हैं का निर्माण करने के लिए पर्याप्त है, हालांकि, fluorophore अभिव्यक्ति बनाए रखा नहीं किया जाएगा।

लेन का निर्माणतिवारी और CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग रेट्रोवायरस जीवों की एक विस्तृत विविधता में किसी भी उपन्यास जीन को निशाना बनाने की क्षमता प्रदान करेगा। जीन संपादन की दक्षता गाइड आरएनए Cas9 दरार को निशाना बनाने का क्रम पर निर्भर होता है। यह अनुभव से निर्धारित किया गया है कि 10% के बीच और क्लोन के 80% indels के बाद अनुक्रमण Neuro2A कोशिकाओं को संक्रमित होते हैं। यह वर्तमान में अज्ञात है कि क्या INDEL आवृत्तियों Neuro2A कोशिकाओं में गणना की न्यूरॉन्स में उन लोगों को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। ऐसे Benchling के रूप में गाइड आरएनए डिजाइन सॉफ्टवेयर अब एक "पर लक्ष्य" स्कोर कि किसी दिए गए लक्ष्य अनुक्रम की दक्षता की भविष्यवाणी करने में सक्षम हो सकते हैं शामिल हैं। क्या डिग्री इस तरह के "पर लक्ष्य" स्कोर और अधिक व्यापक रूप से लागू हो जाता है अनुभव से न्यूरॉन्स और CRISPR-Cas9 प्रणाली के रूप में अन्य सेल-प्रकार में निर्धारित किया जा करने के लिए विश्वसनीय जरूरत है।

Lentivirus आधारित ट्रांसजेनिक पशु उत्पादन रिपोर्ट के साथ अस्थायित्व सफल रहा है कि lentivirus दिया ट्रांसजीन सी बन जाते हैं11 lenced। डीएनए के CRISPR मध्यस्थता जीन संपादन पूरे पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए रोगाणु लाइन के माध्यम से पारित किया जा सकता है। इस प्रकार, स्थिर जीनोमिक संपादन वायरल दिया fluorophores और Cas9 Transgenes के मुंह बंद करने के बावजूद प्राप्त किया जा सकता है। यह लक्षित जीनोमिक परिवर्तन के लिए एक कुशल मंच प्रदान कर सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली के वायरल वितरण, जबकि ट्रांसजेनिक जीवों की आवश्यकता नहीं है, उन तकनीकों का पूरक है। उदाहरण के लिए, एक यौगिक ट्रांसजेनिक जानवर है कि inducibly Cre और रचनात्मक निर्भर ऑप्टो या केमो-आनुवंशिक transgenes व्यक्त आनुवंशिक जोड़तोड़ और neuronal गतिविधि के बीच संबंधों में जटिल अध्ययन की सुविधा चाहिए में इस तरह के वायरल कणों इंजेक्शन। एक दूसरा उदाहरण जीन जीन बातचीत के लिए स्क्रीन करने के प्रयास में एक सशर्त नॉकआउट में इन Cas9 / sgRNA वायरल कणों वितरित करने के लिए है। अंत में, इस अनुसंधान के एक और रोमांचक मार्ग phenotypes और रोगी ली गई कोशिकाओं में चिकित्सकीय यौगिकों की स्क्रीनिंग, जो कर सकते हैमान्य है और आनुवंशिक नेटवर्क है कि विभिन्न रोगों में बाधित कर रहे हैं खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम निन्ह द्वारा समर्थित किया गया R01MH097949 अनुदान और आत्मकेंद्रित BWL और नॉरिस कपास कैंसर केंद्र ऑप्टिकल इमेजिंग साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान P30CA023108 करने के लिए पायलट अनुदान 7359 बोलती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
List of Cell Culture Reagents
293FT cell line Life Technologies R700-07 For Lentivirus
293GP cell line Clontech 631458 For Retrovirus
Iscove's Modification of DMEM (IMDM) Corning  10-016-CV Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and  1% P/S
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) Corning 25-025-CI
L-Glutamine solution, 100x (L-Gln) Corning 25-005-CI
Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S) Corning 30-002-CI
Polystyrene 10 cm plate USA Scientific CC7682-3394
Trypsin EDTA 1x Corning 25-053-CI
List of Transfection Reagents
5 ml polystyrene tubes Fisher Scientific 352054
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Fisher Scientific  C69-500 Make a 2.5 M solution in ddH2O
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific  S271-3
HEPES Fisher Scientific  BP2939-100
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Fisher Scientific  S369-500
2x HEPES Buffered Saline (HBS) 500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-5G
0.22 µM syringe filter unit EMD Millipore  SLGV033RS
0.45 µM syringe filter unit EMD Millipore  SLHP033RS
60 cc L/L Syringe Med-Vet International MV60CCLL
50 ml Conical Tube Corning 352098
polyethylene glycol   6000 (PEG 6000) Millipore 528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS) National Diagnostics CL-253
0.5 ml microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
Matrigel Fisher Scientific CB-40230A
6-well plate Fisher Scientific 353046
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC41678-5000
Donor Horse Serum Cellgro 35-030-CV
TritonX-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
10 ml serological pipette Fisher Scientific 357551
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate Invitrogen A21311
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx Med-Vet International 1CCVLS
Isoflurane
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk Med-Vet International JOR580S
artificial tear ointment Med-Vet International RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution  Med-Vet International HPIV108208H
normal saline  Med-Vet International DYND500MLSH
cotton tipped applicators Med-Vet International CTA6
Triple antibiotic ointment  Med-Vet International RXTRIP-OI15
MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8" Med-Vet International 25058
6-0 silk sutures Med-Vet International MV-711

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 111 Lentivirus Retrovirus वायरल पैकेजिंग उच्च अनुमापांक, Intracerebroventricular इंजेक्शन CaPO4 अभिकर्मक
डिजाइनिंग, पैकेजिंग, और stereotaxic इंजेक्शन के माध्यम से उच्च अनुमापांक CRISPR रेट्रो और lentiviruses की डिलिवरी
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Fricano-Kugler, C. J., Williams, M.… More

Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Salinaro, J. R., Li, M., Luikart, B. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (111), e53783, doi:10.3791/53783 (2016).

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