Summary
Ein Verfahren zur Herstellung und Durchführung der filterbasierten oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) Assay zum Nachweis von chemischen Verunreinigungen (dh Pestizid Ferbam und Antibiotikum Ampicillin) dargestellt.
Introduction
Oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) ist eine Technik, die Kombination von Raman-Spektroskopie mit Nanotechnologie. Die Intensität der Raman-Streuung von Analyten an Edelmetallnano Oberflächen wird durch die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz stark verbessert. 1 Silber-Nanopartikel (Ag NPs) sind bei weitem die am häufigsten verwendeten SERS Substrate aufgrund seiner hohen Verstärkung Fähigkeit. 2 Bisher wurden verschiedene Syntheseverfahren von Ag-NPs entwickelt. 3-6 Ag-Nanopartikeln allein so wirksam SERS Substrate verwendet werden können, oder mit anderen Materialien und Strukturen kombiniert, um die Empfindlichkeit und / oder Funktionalität zu verbessern. 7-11
SERS-Techniken haben große Kapazität für die Detektion verschiedener Spurenmengen von Kontaminanten in Lebensmitteln und Umweltproben zeigten 12 Traditionell gibt es zwei allgemeine Möglichkeiten zur Herstellung eines SERS Beispiel:.. Lösungs-und-Substrat-basierte Verfahren 13 Die Lösungs-method verwendet NP Kolloide mit Proben zu mischen. Dann wird das NP-Analyt-Komplexes unter Verwendung von Zentrifugation gesammelt und auf einem festen Träger für die Raman-Messung nach dem Trocknen aufgebracht. Das Substrat-basierten Verfahren wird in der Regel durch Aufbringen von mehreren Mikroliter einer flüssigen Probe auf die vorgefertigte feste Substrat aufgebracht. 14 sind jedoch keine dieser beiden Methoden effektiv und geeignet für eine große Menge an Probenvolumen. Mehrere Änderungen der SERS-Assays überwand die Volumengrenzen, wie die Integration eines Filtersystems 15-21 oder den Einbau einer Mikrofluidik-Vorrichtung. 21-24 Die modifizierten SERS-Assays große Verbesserung in der Empfindlichkeit und Machbarkeit gezeigt haben, für die chemische Verunreinigungen Überwachung in großen Wasserproben.
Hier zeigen wir die detaillierte Protokoll der Herstellung und Anwendung einer Spritzenfilter basierend SERS Verfahren Spurenmenge an Pestizid Ferbam und Antibiotikum Ampicillin zu detektieren.
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Protocol
1. Silbernanopartikelsynthese 15
- Man löst 18 mg Silbernitrat in 100 ml Reinstwasser (18.2 ΩU) und Vortex für 5 Sek.
- Man löst 27 mg Natriumzitratdihydrat in 1 ml Wasser und Vortex für 5 Sek.
- Übertragen Sie alle der hergestellten Silbernitratlösung zu einem Erlenmeyerkolben mit Rührstab und stellte die Flasche auf einem Magnet heißen Platte enthält. Wird der Kolben unter kräftigem Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 700 Umdrehungen pro Minute bei ~ 350 ° C (Einstellung Temperatur auf der Platte).
- Beim Kochen, fügen sofort alle der vorbereiteten Natriumcitratlösung zu den Erlenmeyerkolben gegeben und die Lösung verlassen für weitere 25 min zum Sieden, bis die Lösung grünlich braun wird, die die Bildung von Ag-Nanopartikeln zeigt.
- Entfernen Sie den Kolben von der heißen Platte und legen Sie sie auf einem anderen Magnetplatte (nicht erhitzen) und rühren O / N in der gleichen Rührgeschwindigkeit bei RT, bis die Mischung erreicht einen stabilen Zustand, mit einer konstanten Farbe und Transparency. Verwenden Sie ein UV-VIS-Spektrometer der Absorption der hergestellten Silber-Nanopartikel, um festzustellen, wenn nötig.
- Verdünne die Endmischung mit ultrareinem Wasser auf 100 ml.
- Verwenden Sie einen Zetasizer die Größe der Silber-Nanopartikel zu messen, wenn notwendig, nach dem Protokoll des Herstellers.
- Übertragen Sie die Ag-Kolloid zu einem verschlossenen Behälter und schützen sie vor Licht mit Aluminiumfolie. Das Kolloid kann bei Bedarf für 2 Monate bei 4-7 ° C im Kühlschrank aufbewahrt werden.
2. Herstellung eines SERS Aktive Filter Membrane
- Man löst 2,92 g Natriumchlorid (NaCl) in 100 ml Wasser, um eine 50 mM NaCl-Lösung herzustellen.
- 1 ml der 5 mM NaCl-Lösung in 1 ml der hergestellten Silber-Nanopartikel und mischen sie auf einem Taumelmischer für 10 Minuten bei 20 Umdrehungen pro Minute. Dieser Schritt ist die Silber-Nanopartikel in Ag-Nanocluster zu aggregieren.
- Platzieren einer Filtermembran (PVDF, 0,1 um Porengrße) in einem Filterhalter, die an einer Spritze befestigt werden kann. Der kleinere Porengröße Membran war found wirksamer als die größere Porengröße Membran (dh 0,22 um) in Trapping Ag-Nanocluster und Erzeugen konsistenter Signale.
- Last 2 ml der hergestellten Ag-Nanocluster in die Spritze für die Filtration. Bringen Sie den Filterhalter an der Spritze und manuell das gesamte Volumen von Ag-Nanocluster durch die Membran in einer Fließrate von 1 Tropfen / s übergeben. Die Membran Fallen Ag-Nanocluster, eine SERS-aktiven Filtermembran bilden.
- Nehmen Sie die Filtermembran aus dem Filterhalter. Besondere Vorsicht ist geboten, wenn die Membran am äußeren Rand, die eine Pinzette keine Beschädigung der Membran zu gewährleisten. Luft trocknen für ca. 3 min und Platz Membran auf einem Glasträger.
- Raman Detektion des SERS-Substrat
- Stellen Sie die Raman Instrument zu einem 780 nm Wellenlängenlaser mit einer Laserleistung von 5 mW, Bestrahlungszeit von 1 sec und Belichtungszahl von 2. Stellen Sie die mikroskopische Objektiv zu 10X. Stellen Sie sicher, das Ziel auf der Software entsprechend zu gesetzt ist. </ Li>
- Setzen Sie den Glasobjektträger mit der Membran auf der Oberseite auf die Plattform des Raman-Instruments und verwenden das Mikroskop auf der Oberfläche der Membran zu konzentrieren.
- Wähle zufällig 8-10 Flecken von der Membranoberfläche und das Instrument wird sie automatisch in Folge sammeln. Offene spektralen Daten im Hersteller-Software für die Analyse.
3. Anwendung der Active Filter System SERS zum Nachweis chemischer Kontaminanten
- Bereiten Sie eine 10 ppb Ferbam Lösung.
Achtung: Ferbam ist sehr volatil. Vorsichtsmaßnahmen (Atemschutzmaske und Schutzbrille), wenn die feste wiegen.- Wiegen Sie 2 mg Ferbam Pulver und löst ihn in 20 ml 50% Acetonitril (10 ml Acetonitril und 10 ml Wasser), um eine Stammlösung (100 ppm) zu machen. Mischen Sie den Kolben für 30 Sekunden.
- Nehmen Sie 1 ml der 100 ppm Ferbam Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml 50% Acetonitril 10 ppm-Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Nehmen Sie 1 ml der10 ppm Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml 50% Acetonitril eine 1 ppm-Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Nehmen Sie 1 ml der 1 ppm Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml 50% Acetonitril eine 100-ppb-Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Nehmen Sie 1 ml der 100-ppb-Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml 50% Acetonitril 10 ppb Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Bereiten Sie eine 1 ppm Ampicillin Lösung.
- Wiegen 10 mg Ampicillin Pulver und löst ihn in 100 ml Wasser auf 100 ppm Ampicillin-Lösung zu machen. Mischen Sie den Kolben für 30 Sekunden.
- Nehmen Sie 1 ml der 100 ppm-Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml Wasser zu einer 10 ppm Ampicillin-Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Nehmen Sie 1 ml der 10-ppm-Lösung in einem Reagenzglas und fügen 9 ml Wasser zu einer 1 ppm Ampicillin-Lösung zu machen. Mischen Sie den Schlauch für 5 Sek.
- Setzen Sie die Filtermembran zurück in den Filterhalter, mit dem NP beschichtete Seite nach oben zeigt. </ Li>
- Last 5 ml einer Probe in eine neue Spritze, und dann hängen Sie es an den Filterhalter mit einer Ag-beschichtete Membran im Inneren.
- geben manuell das gesamte Volumen der Probe durch die Membran in einer Fließrate von 1 Tropfen / s. Zielmoleküle können auf den auf der Filtermembran beschichteten Nanopartikeln adsorbiert und konzentriert werden.
- Trennen Filtermembran aus dem Filterhalter, der Luft trocknen lassen für etwa 3 min und Messen der Signale des Raman-Instrument unter Verwendung der gleichen Methode wie in Schritt 2.6 beschrieben.
- Wiederholen Sie Schritt 2,2 bis 2,6, um eine weitere Ag-beschichteten Membran vor, und ergeben sich aus Schritt 3.3 für den Nachweis der anderen Probe.
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Representative Results
Die wichtigsten Schritte dieses Versuches wurden in der schematischen Darstellung (Abbildung 1). Abbildung 2 demonstriert die Bedeutung der optimierten Volumen AGNPS in der Membranbeschichtung zu verwenden, um die Empfindlichkeit maximiert zu erreichen. 1 ml der Silber-Nanopartikel bietet das stärkste Signal, wenn Ferbam verwenden, im Vergleich zu 0,5 ml (unzureichende Beschichtung) oder 2 ml (zuviel Beschichtung).
Wir konnten Ferbam bei 10 ppb und Ampicillin bei 1 ppm mit großer Signalintensität von der entwickelten Filterbasis SERS-Assay (Figur 1) zu erkennen. Die SERS-Spektrum von Ferbam zeigt verschiedene charakteristische Peaks bei 10 ppb. Der Peak bei 1.386 cm -1 ist aus der gemischten Vibration von CN und C = S Dehnung und symmetrische CH3 Verformung. Der Peak bei 1.516 cm -1 ist, die mit CH 3 CN und Dehnung. Der Peak bei 561 cm
Mit Probenvolumen erhöhen, können wir die Nachweisgrenze weiter erhöhen, wie in Figur 4 gezeigt. Wir einen Anstieg der Spitzenintensität beobachtet, wenn das Probenvolumen zu erhöhen. Dies ist der Vorteil des Filters basierend Verfahren wie das Volumen einstellbar ist, und die Nachweisgrenze ist ebenfalls einstellbar.
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Abbildung 1. Eine schematische Darstellung von Filter SERS-Test. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. SERS-Spektren von 5 ml 100 ppb Ferbam die durch die Membranen, die durch unterschiedliche Menge an Silber-Nanopartikel beschichtet Von oben nach unten:. 0,5 ml Ag-Kolloid mit 0,5 ml NaCl, 1,0 ml Ag mit 1,0 ml NaCl, 1,5 ml Ag mit 1,5 ml NaCl, respectively. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. SERS-Spektren von Ferbam und Ampicillin auf Silber-Nanopartikel beschichtet Filtermembran Von oben nach unten:. Kontrolle von 50% Acetonitril, 10 ppb Ferbam, die Kontrolle über Wasser, 1 ppm Ampicillin sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Figur.
Abbildung 4. SERS-Spektren von verschiedenen Volumen von 100 ppb Ferbam auf Silber-Nanopartikel beschichtet Filtermembran Von oben nach unten:. 3 ml Ferbam, 5 ml Ferbam, 7 ml Ferbam, 9 ml Ferbam sind. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version zu sehen von dieser Figur.
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Discussion
Einer der kritischen Schritte in diesem Protokoll ist das Silber-Nanopartikel-Synthese, wo gleichmäßige Silber-Nanopartikel der Schlüssel für konsistente Ergebnisse sind. Die Erwärmungszeit und die Konzentrationen von Vorstufen werden müssen präzise gesteuert. Die durchschnittliche Größe von 80 nm AGNPS Zubereitung ist, die durch die Zetasizer gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer kritischer Schritt ist das Salz Aggregation, wo die Salzkonzentration und Aggregationszeit müssen genau gesteuert werden. Darüber hinaus ist die Wahl der Membran ebenfalls kritisch, da die Membran mit einer kleineren Porengröße effektiver zu stoppen Ag-Nanocluster gefunden wurde. Für die spezielle Membran in dieser Studie verwendet wird, gibt es einen vorderen und hinteren Seite, wo die Frontseite müssen bis in den Halter gelegt werden, um die Spritze zu verbinden. Wenn es nach unten gelegt wurde, war die Beschichtung sehr viel weniger wirksam. Vermeiden von Blasen, wenn durch die Membran hindurchgeht, ein weiterer Schlüssel zu einer erfolgreichen Beschichtung.
Für die Fehlersuche von diesem Test im Anschluss an die Schritteempfohlen. Wenn keine oder nur geringe Signal erkannt wird, überprüfen Sie die folgenden Ursachen. Die Hauptursache könnte die Ag-Nanopartikel sind nicht genug aggregiert in den Poren der Filtermembran eingefangen werden. Erhöhung der Salzkonzentration und / oder Inkubationszeit kann die Aggregation zu verbessern. Andernfalls überprüfen, dass die Rückseite des Filtermembran nach oben zeigt und dass das Volumen oder die Konzentration von Probe in die Membran eingelegt, ist nicht zu niedrig ist. Wenn das Signal des Zielmoleküls nicht konsistent ist, überprüfen Sie die folgenden Ursachen: die Größenverteilung der Silber-Nanopartikel können zu breit oder die Nanopartikel sind nicht gleichmäßig über die Membran verteilt, vermutlich wegen zu viel Aggregation von Nanopartikeln oder zu schnell durch die Membran passiert.
Im Vergleich mit den vorherigen Daten zur Verwendung von Ag als Dendriten SERS-Substrat, 30-31 die Empfindlichkeit dieser filterbasierten SERS-Assay ist viel höher auf Ferbam Erkennung. Dies beruht auf dem Vorteil der filterbasierten System, das la fließen kannRGE Probenmenge, so dass mehr Analytmolekülen auf die SERS-Substrat konzentriert sind. Ein weiterer Vorteil der filterbasierten System über das Lösungs-Methode ist die einfache Bedienung und fieldable Messung, da keine Zentrifugation erforderlich ist, die NP-Analyt-Komplex zu sammeln. Die Beschränkung dieses Verfahrens ist, kann sie nicht direkt für komplexe flüssige Matrizes wie Milch verwendet werden, da die komplexen Komponenten, die die Membranporen blockieren kann. Die Vorbehandlung ist erforderlich störende Komponenten zu entfernen, bevor die Membran passiert.
Zusammenfassend zeigen wir eine einfache und empfindliche Filterbasis SERS Assay, der auf die Erkennung von Verunreinigungen oder Verfälschungen in flüssigen Lebensmittelmatrix und Umweltproben angewandt werden könnte. Um die Nachweisgrenze drücken, Optimierung der Parameter, wie NP Größe und Menge, Salzkonzentration, Probenvolumen und Geräteparameter benötigt.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | N/A |
| Ferbam | Chem Service | N-11970-250MG | 98+% |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | 99.0+% |
| Sodium citrate dehydrate | Sigma Aldrich | W302600 | 99+% |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | 99.5+% |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters | Fisher Scientific | VVLP01300 | 0.10 µm Pore Size, hydrophilic |
| Polycarbonate Filter Holders | Cole-Parmer | EW-29550-40 | 13 mm diameter |
| Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | N/A |
| Nutating Mixers | Fisher Scientific | 05-450-213 | N/A |
| DXR Raman spectroscope | Thermo Scientific | IQLAADGABFFAHCMAPB | Laser power: 1 mW Exposure time: 5 sec |
References
- Albrecht, M. G., Creighton, J. A. Anomalously intense Raman spectra of pyridine at a silver electrode. J. Am. Chem. Soc. 99 (15), 5215-5217 (1977).
- Schatz, G. C., Young, M. A., Van Duyne, R. P. Electromagnetic mechanism of SERS. Surface-enhanced Raman scattering. , Springer Berlin Heidelberg. 19-45 (2006).
- Matijevic, E. Preparation and properties of uniform size colloids. Chem. Mater. 5 (4), 412-426 (1993).
- Nickel, U., zu Castell, A., Pöppl, K., Schneider, S. A silver colloid produced by reduction with hydrazine as support for highly sensitive surface-enhanced Raman spectroscopy. Langmuir. 16 (23), 9087-9091 (2000).
- Khanna, P. K., Subbarao, V. V. V. S. Nanosized silver powder via reduction of silver nitrate by sodium formaldehydesulfoxylate in acidic pH medium. Mater. Lett. 57 (15), 2242-2245 (2003).
- Henglein, A., Giersig, M. Formation of colloidal silver nanoparticles: capping action of citrate. J. Phys. Chem. B. 103 (44), 9533-9539 (1999).
- Sun, X., Li, Y. Colloidal carbon spheres and their core/shell structures with noble-metal nanoparticles. Angew. Chem. Int. Edit. 43 (5), 597-601 (2004).
- Lu, L., et al. Seed-mediated growth of large, monodisperse core-shell gold-silver nanoparticles with Ag-like optical properties. Chem. Commun. (2), 144-145 (2002).
- Aslan, K., Wu, M., Lakowicz, J. R., Geddes, C. D. Fluorescent core-shell Ag@SiO2 nanocomposites for metal-enhanced fluorescence and single nanoparticle sensing platforms. J. Am. Chem. Soc. 129 (6), 1524-1525 (2007).
- Lu, Y., Yin, Y., Li, Z. Y., Xia, Y. Synthesis and self-assembly of Au@ SiO2 core-shell colloids. Nano. Lett. 2 (7), 785-788 (2002).
- Link, S., Wang, Z. L., El-Sayed, M. A. Alloy formation of gold-silver nanoparticles and the dependence of the plasmon absorption on their composition. J. Phys. Chem. B. 103 (18), 3529-3533 (1999).
- He, L., et al. Rapid Detection of Ricin in Milk Using Immunomagnetic Separation Combined with Surface Enhanced Raman Spectroscopy. J. Food. Sci. 76 (5), N49-N53 (2011).
- Zheng, J., He, L. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for the Chemical Analysis of Food. Compr. Rev. Food. Sci. F. 13 (3), 317-328 (2014).
- He, L., Haynes, C. L., Diez-Gonzalez, F., Labuza, T. P. Rapid detection of a foreign protein in milk using IMS-SERS. J. Raman. Spectrosc. 42 (6), 1428-1434 (2011).
- Wei, W. Y., White, I. M. A simple filter-based approach to surface enhanced Raman spectroscopy for trace chemical detection. Analyst. 137 (5), 1168-1173 (2012).
- Cheng, M. L., Tsai, B. C., Yang, J. Silver nanoparticle-treated filter paper as a highly sensitive surface-enhanced Raman scattering (SERS) substrate for detection of tyrosine in aqueous solution. Anal. Chim. Acta. 708 (1), 89-96 (2011).
- Fierro-Mercado, P. M., Hernández-Rivera, S. P. Highly sensitive filter paper substrate for SERS trace explosives detection. Int. J. Spectrosc. 2012, 716527 (2012).
- Tran, C. D. Subnanogram detection of dyes on filter paper by surface-enhanced Raman scattering spectrometry. Anal. Chem. 56 (4), 824-826 (1984).
- Wu, D., Fang, Y. The adsorption behavior of p-hydroxybenzoic acid on a silver-coated filter paper by surface enhanced Raman scattering. J. Colloid Interface Sci. 265 (2), 234-238 (2003).
- Wigginton, K. R., Vikesland, P. J. Gold-coated polycarbonate membrane filter for pathogen concentration and SERS-based detection. Analyst. 135 (6), 1320-1326 (2010).
- Berthod, A., Laserna, J. J., Winefordner, J. D. Analysis by surface enhanced Raman spectroscopy on silver hydrosols and silver coated filter papers. J Pharm Biomed Anal. 6 (6), 599-608 (1988).
- Ackermann, K. R., Henkel, T., Popp, J. Quantitative Online Detection of Low-Concentrated Drugs via a SERS Microfluidic System. ChemPhysChem. 8 (18), 2665-2670 (2007).
- Walter, A., März, A., Schumacher, W., Rösch, P., Popp, J. Towards a fast, high specific and reliable discrimination of bacteria on strain level by means of SERS in a microfluidic device. Lab. Chip. 11 (6), 1013-1021 (2011).
- Lee, S., et al. Fast and sensitive trace analysis of malachite green using a surface-enhanced Raman microfluidic sensor. Anal. Chim. Acta. 590 (2), 139-144 (2007).
- Guo, H., et al. Analysis of Silver Nanoparticles in Antimicrobial Products Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS). Environ. Sci. Technol. 49 (7), 4317-4324 (2015).
- Narayanan, V. A., Begun, G. M., Stokes, D. L., Sutherland, W. S., Vo-Dinh, T. Normal Raman and surface enhanced Raman scattering (SERS) spectra of some fungicides and related chemical compounds. J. Raman. Spectrosc. 23 (5), 281-286 (1992).
- Kang, J. S., Hwang, S. Y., Lee, C. J., Lee, M. S. SERS of dithiocarbamate pesticides adsorbed on silver surface; thiram. Bull. Korean. Chem. Soc. 23 (11), 1604-1610 (2002).
- Li, Y. T., et al. Rapid and sensitive in-situ detection of polar antibiotics in water using a disposable Ag-graphene sensor based on electrophoretic preconcentration and surface-enhanced Raman spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 43, 94-100 (2013).
- Clarke, S. J., Littleford, R. E., Smith, W. E., Goodacre, R. Rapid monitoring of antibiotics using Raman and surface enhanced Raman spectroscopy. Analyst. 130 (7), 1019-1026 (2005).
- Zheng, J., Pang, S., Labuza, T. P., He, L. Semi-quantification of surface-enhanced Raman scattering using a handheld Raman spectrometer: a feasibility study. Analyst. 138 (23), 7075-7078 (2013).
- Zheng, J., Pang, S., Labuza, T. P., He, L. Evaluation of surface-enhanced Raman scattering detection using a handheld and a bench-top Raman spectrometer: A comparative study. Talanta. 129, 79-85 (2014).
