Protocol
Djuranvändning och välfärd ska följa NIH Guide för vård och användning av försöksdjur efter protokoll granskade och godkända av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). Mus vävnadsprover från medarbetare Dr. Chuanbin Mao.
1. Mus Tissue Avsnitt Framställning
- Placera en hel mus organ av intresse (hjärna, njure, lever, etc.) in i centrum av en liten plast väl (t.ex. 12-brunnars cellodlingsplatta), och dränka i vävnad inbäddning förening upp till ca 10 mm höjd. Se till att det inte finns någon bubbla som bildas i vävnaden inbäddning föreningen och att organet placeras i önskad orientering (dvs sagittal, koronal, etc.).
- Placera omedelbart vävnader i flytande kväve för blixtfrysning. För långtidsförvaring, lagra de frysta proverna i en -80 ° C frys.
- Ta den frusna mus orgel och tina till -15 ° C i en tempere kontrollerad cryomicrotome.
- Säker vävnad på en stål bas med cirka 500 pl vävnad inbäddning förening och placera på en cryomicrotome sektionefästet så att den önskade snitt orientering presenteras för kniven.
- § vävnaden till en 12 um tjocklek. Placera sektionerade vävnadsskivor på polykarbonatobjektglas och låt torka i 30 minuter vid rumstemperatur. För långtidsförvaring, förvara den frysta bilden i en -80 ° C frys.
2. Cellkultur
Notera: Cellodling utfördes i biologiska säkerhetsskåp (Biosäkerhetsnivå II) under sterila betingelser. HeLa-cellinjen användes som ett modellsystem, och cellerna odlades i fullständigt odlingsmedium med följande konventionella protokoll:
- Varma reagens (dvs trypsin, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och cellodlingsmedium) till 37 ° C.
Notera: Cellodlingsmediet innehåller oorganiskt salts, aminosyror, vitaminer och andra. För en fullständig lista över beståndsdelar hänvisas till formuleringen från tillverkaren. - Skaffa cellprov (t.ex. en ml HeLa cellsuspension) och lägga till den i 9 ml fullständigt cellodlingsmedium i en standard 10 cm cellodlingsplatta. Den initiala cellantalet är cirka 0,5 x 10 6 celler / ml. Hålla celler i kultur vid 37 ° C med 5% CO2 under 2-3 dagar till dess att odlingsytan är täckt vid 70-80% på cellkulturplattan. Spela cellpassager nummer för varje efterföljande omgång.
- Utför cell passage (dvs celldelning) i cellodlingsplatta.
- Sug odlingsmedium, och använd 5 ml 1x PBS för att skölja cellerna. Avlägsna PBS genom att använda en steril aspirationsspetsen, och inkubera cellerna med 2,5 ml trypsin (0,25%) för ~ 5 min vid 37 ° C för att frigöra cellerna från odlingsplattan.
Obs: Den faktiska trypsin behandlingstiden måste optimeras enligt den specifika trypsin product köpts från tillverkaren. Otillräcklig behandlingstid lämnar celler fästa till plattan, medan överdriven behandling leder till celldöd. - Stoppa trypsinaktiviteten genom att tillsätta 7,5 ml fullständigt cellodlingsmedium och sedan likformigt återsuspendera cellerna (total volym 10 ml). Använd cellsuspensionen för kultur (steg 2,2) eller beredning av SCMS prover (steg 2,4).
- Sug odlingsmedium, och använd 5 ml 1x PBS för att skölja cellerna. Avlägsna PBS genom att använda en steril aspirationsspetsen, och inkubera cellerna med 2,5 ml trypsin (0,25%) för ~ 5 min vid 37 ° C för att frigöra cellerna från odlingsplattan.
- Framställa cellprover för SCMS experiment.
- Placera enskilda mikro täckskivor i en 12-brunnar, och tillsätt 1,8 ml cellodlingsmedium och 0,2 ml av cellsuspensionen i brunnen.
- Blanda försiktigt cellerna med mild omrörning av plattan, och inkubera i en 5% CO2 miljö vid 37 ° C under ~ 24 timmar. För att utföra läkemedelsbehandling för att de odlade cellerna, tillsätt en läkemedelsförening-lösning (t.ex., i DMSO (dimetylsulfoxid)) in i 12-brunnars cellodlingsplatta.
Obs: Den slutliga läkemedelskoncentrationen (t ex 10 nM, 100 nM, 1 | iM, och 10 | iM) och treatment tid (t.ex. 4 timmar) varieras i enlighet med det specifika syftet studier. Celler är fästa vid mikrotäckskivor och redo för de gemensamma säkerhetsmetoderna experimenten (steg 6).
3. Single-sond Fabrication
- Placera dubbla hål kvarts slang (innerdiameter (ID) 127 um, ytterdiameter (OD) 500 pm) i en laser mikropipett avdragare och dra en dubbel-borrning kvarts nål. Använd följande parametrar som utgångspunkter: Värme = 400, Fil = 3, Vel = 80, Del = 150, och Pul = 250 (alla enheter är tillverkarens enheter). Se till att dras med dubbla hål kvarts nål har en avsmalnande spets för optimal sond egenskaper. Skär dras spetsen så att det finns ~ 5 mm lång av unpulled dubbla hål kvarts kapillär vänster vid den andra änden.
Obs: Den faktiska parametrarna för laser avdragare bör optimeras i enlighet med de särskilda villkoren för instrumentet. - Skära en ~ 80 mm sektion av smält kiseldioxid kapillär (ID 40 um, OD. 105 nm) som lösningsmedel ger kapillär, och sätt in den i ett hål i den platta änden av den dubbla hål kvarts nål.
- Skär en ~ 40 mm sektion av kvarts kapillär (ID 40 um, OD 105 nm) och använda en rakkniv att raka ~ 5 mm av polyimidbeläggningen från mittpunkten. Använd en propanflamma för att snabbt värma och dra smält kapillär i en nano-elektro (ESI) emitter med en fin avsmalning. Skär en nano-ESI emitter (~ 7-10 mm lång), och för in den i den andra borrningen i den platta änden av den dubbla hål kvarts nål. Alternativt kan du använda laser avdragare för att producera en fin avsmalning.
- Applicera en minimal mängd (~ 1-2 l) UV-härdande harts på den platta änden av den dubbla hål kvarts nål, och stelna hartset med hjälp av en LED-UV-lampa för ~ 20 sekunder för att säkra lösningsmedel ger kapillär och nano- ESI emitter. De förfaranden för att montera de enskilda delarna till en enda-prob visas i figur 1a.
- Skär en standard mikroskop glass slide (1 "x 3") till hälften på längden. Placera den enkel sonden på en ände av objektglaset så att nano ESI emitter är riktad utåt. Tillämpa det vanliga epoxi till kroppen av den inre-sonden så att den blir fastsatt på glasskivan (figur 1b). Lämna över natten för härdning. Koppla den fabricerade singel-sonden med den integrerade enkel sond setup (Figur 1c), som är fäst till en masspektrometer såsom illustreras i figur 1d.
4. Bygg integrerade Single-sond MS Setup
- Ändra jonkällan gränssnittet fläns masspektrometer och tillverka stativ (med justerbar position och höjd) för den digitala stereoskop (figurerna 1e och 1f).
- Borra en jonkälla gränssnitts fläns med två hål som gör det möjligt för fästande av en aluminium optisk ombord. Gör en glidskena anordning och en höjdjusteringsstången (fäst tillett XY-objektbordet för fina ställning tuning), så att den digitala stereoskop-systemet kan fästas på aluminium optiska kortet (Figur 1e).
- Fäst modifierade digitala stereomikroskop, en USB digitalt mikroskop, en miniatyr manual XYZ översättning scenen med en flexibel klämma innehavaren, motoriserade XYZ översättning scensystem till aluminium optiska styrelse, som är monterad på den anpassade jonkällan gränssnitt fläns masspektrometer (figurerna 1c och 1f). Använd flexibla klämhållaren för att fixera glasskiva fäst med en enda sond.
- Fäst enda sonden inställning till masspektrometer (figur 1F). Justera flexibla klämhållaren och miniatyr XYZ scenen för att placera emitter enda sonden framför inloppet till masspektrometer. Använd USB digitalt mikroskop (med justerbar synvinkeln) på den sida av en enda sond för att ge en inzoomad bild av ett enda pmantel spets eller nano-ESI emitter, och den digitala stereoskop (med justerbar höjd) ovanför den enkel sonden för att visa cellerna och sondspetsen.
Obs: Använda motsvarande jonkällan fläns, kan detta integrerade enda probsystem kopplas till andra typer av masspektrometrar utrustade med omgivande jonisering källor.
5. Omgivnings MSI
- Tina provsektionen vid rumstemperatur och placera den på motoriserade XYZ översättning scensystem under en enda sond. Justera provposition genom att ändra koordinaterna i styrmjukvaran.
- Användning av sprutan för att pumpa provtagningslösningsmedlet vid en lämplig hastighet (t.ex. 0,2 | il / min), och applicera jonisering spänningen (t.ex., 5 kV). Valet av samplingslösningsmedlet är flexibelt, och de vanligaste är MeOH: vatten (9: 1) och acetonitril. De döda volymen av nano ESI emitter uppskattades till ~ 3 nl, och tiden mellan probe-surface kontakt och jon signal iakttagelse är vanligtvis mindre än en sekund 15.
Obs: Den anpassade jonkällan gränssnitt fläns möjliggör jonisering spänning som skall levereras från masspektrometern till ett ledande förbundet genom en krokodilklämma. Jonisering spänningen överförs sedan genom ett ledande union till lösningsmedlet inuti kapillären och de enda sondkanaler, och applicerades på den nano-ESI emitter för att jonisera de analyter samplade. Se till att jonisering spänningen är avstängd när du ansluter krokodilklämma med den ledande förbundet. - Justera höjden av den inre-sonden så att den vilar precis ovanför ytan av provet och kan utföra yta-extraktion av metaboliter. Lyft försiktigt Z-steget, och sedan använda USB digitalt mikroskop (vid sidan av enkel sonden) för att övervaka avståndet förändringen mellan den enda sondspetsen och vävnadsytan. Övervaka förändringar i masspektrumet under denna höjdjustering, och stoppa hissing Z-stadiet när en ändring av jonen signalen från lösningsmedels bakgrunden till vävnads metaboliter observeras.
- Upprepa steg 5,3 tre gånger för att ställa tre olika punkter i scenen styrprogram för automatiserad yta plattas justering. Placera spetsen av den inre-sonden vid tre punkter på provytan på ett avstånd av ca 10 mm från varandra. Utför höjdjustering genom att trycka upp och ner ikoner, och låsa de tre punkterna i läge under "Plan-metoden".
- Ange andra parametrar för rastrering över den del av intresse i provet med hjälp av detta program. För mus njursnitt presenteras här, använder en 10,0 pm / sek rastrering hastighet och 20 pm avstånd mellan raderna. Den motordrivna scensystemet har en 0,1 pm minimal ökning rörelse. Avståndet mellan den enda-sondspetsen och vävnads erhålles från steg 5,3.
- Inrätta ett förfarande för den automatiserade förvärv av MS-spektra från masspektrometern. for hög massupplösning MSI på musen njure prov, använda följande parametrar: massa upplösning 60.000 (m / AM), ~ 5 kV positiv läget 1 Micro, 150 ms max insprutningstiden, och AGC vidare. Alla förvärvade MS spektra representerar enskilda rader av MS bilden hade samma antal svep med enhetlig tidsavstånd mellan varje avsökning, vilket tyder på att pixelstorlekar för bilder som produceras var jämnt fördelad.
- Starta MSI datainsamling. Starta MS förvärvssekvensen för masspektrometer, och sedan initiera rastrering sekvensen för XYZ styrprogrammet.
- Till exempel i MS datainsamlingsprogram utnyttjas här, gå till "Sekvens setup", välj "Ny sekvens", generera en uppsättning filer för en ny sekvens numreras från 01 till X, där X är antalet linjer som används för önskad MS bilden tas, och sedan på "Kör sekvens".
- Använda en hemmagjord elektronisk anordning så att programvaran för att producera en contact stängning signal för masspektrometer för att samla in uppgifterna. Kretsschemat visas i den kompletterande figuren (figur S1) som referens.
- Konstruera MS bilder obehandlade MS-filer med hjälp av lämpliga MSI visualiseringsprogram. Till exempel, när du använder mjukvarupaket utvecklats av Laskin grupp vid PNNL 17, utföra följande steg.
- Klicka på "Brows fil." Välj den första filen som erhålls från MSI experimentet. Ange var starterna filen och avslutas under "Antal rader". Välj ett område av m / z-värden för MS bildintervall under "Enter MZ Range".
- Tryck på "Start" -knappen för att starta processen image skapande. När MS bilden är gjord, klicka på "Spara bild" under "Verktygsfält" för att lagra bilder i datorn.
6. situ Live SCMS
- Ställ in en enda sondsystemet enligt instruerajoner för MSI. Justera lösningsmedel (t.ex. MeOH / H2O eller acetonitril) flödeshastighet (t.ex. ~ 25 Nl / min).
- Tvätta de odlade cellerna, som är fästa på mikrotäckglasskivor, med PBS för att avlägsna kulturmedia och extracellulära läkemedelskomponenter. Placera cell som innehåller glasskiva på motoriserade XYZ översättning scensystem för experiment.
Obs: Du kan också använda färsk cellodlingsmedium (utan innehåller fetalt bovinserum) att skölja de odlade cellerna. Mindre jon undertryckande har observerats. Dessutom kan cellen överlever under längre tid under experimentet där omgivningstemperaturen (~ 20 ° C) är signifikant lägre än odlingstemperaturen (37 ° C). Typ läkemedel, lösningskoncentration, och behandlingstiden varierar i olika studier. - Fokusera den digitala stereomikroskop (ovanför provet) på spetsen av den inre-prob för att övervaka cellpenetration under analysen. Använd USB digitalt mikroskop (på side av ett enda prob) för att övervaka arbetsvillkoren för nano-ESI emitter på enkel sonden.
- Använd motoriserade XYZ scenen styrprogram och digital stereomikroskop (ovan celler) för att hitta en cell av intresse och exakt positionera enda sondspetsen över provet. Starta MS datainsamling innan den gemensamma-sondspetsen sätts in i cellen.
- Använd följande parametrar som referenser för MS-analys med hjälp av en hög upplösning masspektrometer: massupplösningen 100.000 (m / AM), ~ 3 kV positiv och negativ läge, 1 Micro, 150 ms max insprutningstiden, AGC-läget på. Automatiserad förvärv av MS-spektra görs genom att klicka på "Start" i MS datainsamlingsprogram.
- Lyft motordriven Z-steget genom att klicka på ikonen för att penetrera cellmembranet och hålla inspelningen MS signal som genereras från cellen. En tidsfördröjning på 1-2 sekunder brukar observeras mellan sond insättning och detekteringssignalen MS. Som den andra bekräftelse avcellpenetration, en dramatisk förändring av de MS-signaler kan observeras vid penetreringen av cellmembranet. MS signalerna från intracellulära föreningar som vanligtvis kan pågå i ~ 15-20 sekunder innan en signifikant minska.
- Lägre ned den cell som innehåller plattan för att dra den enkelsondspetsen ut från cellen. Det tar vanligtvis <15 sek för jon signalerna för de cellulära föreningar att närma bullernivån. Låt lösningsmedlet flödet för ~ 3 min för att fullständigt spola den enkel sonden. Samtidigt placerar motoriserade XYZ scensystemet för att lokalisera nästa cell som skall analyseras. Varje cell experiment kräver ~ 3 min till åstadkommas.
Representative Results
Den enkel sond användes med framgång för den omgivande MSI analys av sektionerad mus njurvävnad 15. Enheten använder mekanismen för ytan flytande mikro-extraktion (Figur 1a), vilket ger effektiv analyt extraktion från ett litet område, vilket leder till rikliga jon signalerna intensiteter i MSI resultat. Till exempel har signalintensiteterna med mer än 10 7 uppnåtts för vissa rikliga metaboliter (Figur 2A). Ett stort antal metaboliter detekterades på detta sätt, inklusive ett antal sfingomyelin (SM) och fosfatidylkolin (PC) arter såsom [SM (34: 1) + Na] + (725,5575 m / z), [PC (32: 0) + H] + (734,5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782,5696 m / z), och [PC (38: 5 + Na)] + (814,5726 m / z). Dessa föreningar identifierades med hög massupplösning och mass noggrannhet när den kombineras toa högupplösande mass-spektrometer. Till exempel var identifieringen uppnås med mindre än 4 ppm m / z massa noggrannhet (dvs skillnaden mellan de observerade och teoretiska värden) för varje metabolit (figur 2b) i resultat som presenteras här. Dessutom tandem MS analyser (dvs MS / MS) genomfördes också för säkrare identifiering av arter av intresse. 15
På grund av förmågan att utföra en effektiv flytande mikro-extraktion på ett litet område, kan den enkelsondanordningen användas för att utföra hög rumslig upplösning MSI experiment under omgivningsbetingelser 15. Till exempel har detaljerade MS bilder av mus njursnitt erhållits visar den geografiska fördelningen av utvalda metaboliter (Figur 2c). Den rumsliga upplösningen i den MS bilden bestämdes vara 8,5 | j, m, efter den mycket använda metriska av att ha den transiti. på plats av en skarp bestäms funktionen inom en 20-80% intensitet förändring av MS-signal 18 I fallet med fosfolipid [PC (38: 5 + Na)] + på musen njure avsnittet funktionen övergången mellan den inre medulla och den yttre märgen sker över en scan cykel i chronogram, visar en intensitetsförändring som är större än 20-80% intervall. Baserat på provrörelsehastighet (10,0 pm / sek) och MS datainsamlingshastighet (0,85 sek / spektrum), provet rör sig avståndet i en MS skanna cykel (8,5 pm), det vill säga, MSI rumsliga upplösningen, kan beräknas (Figur 2d). Denna rumsliga upplösningen är bland de högsta som hittills uppnåtts för omgivande MSI tekniker som utförs på biologiska prover.
För SCMS enkel sonden kunde uppnå analys av enskilda levande HeLa-celler 16. Spetsen storleken av den inre-sonden är typiskt mindre än 10 | j, m (figure 3a), som är tillräckligt liten för att direkt införas i många typer av eukaryota celler, vars diameter är ~ 10 | j, m, för extraktion och MS-analys. Insättningsprocessen av ett enda sondspetsen i en cell kan övervakas visuellt med hjälp av en digital stereomikroskop (figur 3b), och cellmembranet penetration kan bekräftas genom den snabba och betydande förändring av masspektra från PBS (eller färsk cellkultur medium) till intracellulära föreningar (figurerna 3C och 3D). Försöken kan utföras på både positiva och negativa joner lägen att upptäcka bredare typer av molekylslag. Till exempel har 18 olika lipidförening identifierats i positiv mod, inklusive sfingomyeliner (SM) och fosfatidylkoliner (PC), medan adenosin fosfater (AMP, ADP och ATP) detekterades i negativ jon-läge (fig 3c och d). Tidsfördröjningen mellan enkelsondinför into en cell och detekteringssignalen var typiskt mindre än två sekunder, så att en nära realtidsdetektion av cellulära metaboliter. SCMS också tillämpas på experiment där cellerna behandlades med cytostatika (t.ex. OSW-1, paklitaxel och doxorubicin) 19]. Motsvarande läkemedel kan detekteras inom HeLa-celler efter 4 timmars behandling vid en serie koncentrationer (dvs 10 nM, 100 nM, 1 | iM, och 10 ^ M) i DMSO (dimetylsulfoxid), med användning av de obehandlade cellerna (bara lägga DMSO ) som kontrollerna. MS-signaler av droger inte var närvarande i det extracellulära PBS eller kontrollen (figur 3e), men har påvisats inom de enskilda celler med hjälp av singel-sonden MS-tekniken (endast 100 nM behandlingsresultat visas i figur 3f). Eftersom cellerna sköljdes med PBS (eller färsk cellodlingsmedium) för att avlägsna extracellulära föreningar och föroreningar, detektion av endogena metaboliter (t.ex. cell lipider end adenosin fosfater) och exogena föreningar (t.ex. cytostatika) visar att Single-sonden MS teknik kan användas för att analysera intracellulära föreningar.
Figur 1. Tillverkning och installation av ett enda sond för omgivningens MSI och SCMS analys. A) tillverkningsprocedurer för den inre-sonden. B) Ett fotografi av en fabricerad enda sond fäst till en glasskiva. C) Ett fotografi av den enda sondinställnings ansluten till en masspektrometer. d) Diagram över enkel sonden inställning i kombination med en masspektrometer. Under ett experiment, är samplings lösningsmedel kontinuerligt tillgänglig från sprutan, är joniseringen spänning som appliceras på den ledande unionen från masspektrometern används två digitala mikroskop användas för att övervaka prov placering, den motoriserade XYZ stadiumSystemet används för att styra prov rörelse, och en masspektrometer används för analys. e) Fotografi av den kundanpassade digitala stereoskop system. f) fotografi som visar den digitala stereoskop fäst vid jonkällan gränssnittet fläns genom en optisk kortet. Klicka här för att en större version av denna siffra.
Figur 2. Resultat från en omgivande MSI studie av en mus njure sektion med hög spatial och massupplösningen. A) En representant masspektrum från enkel sonden MSI. Den maximala ljusstyrkan upptäckta metaboliter kan nå 3,39 x 10 7 (godtyckliga enheter). B) Ett urval av de upptäckta metaboliter presenteras med deras massa noggrannhet. C)MS bilder av [PC (32: 0) + H] + och [PC (34: 1) + Na] + tagna från en mus njursektion vid 8,5 ^ m rymdupplösning. PC: fosfatidylkolin. Skala bar: 2 mm; 0,20 mm (infälld) d) Fastställande av rumslig upplösning på MS bilden för. [PC (38: 5) + Na] + (anpassad med tillstånd från referens 15). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Resultat från en omgivande SCMS analys av läkemedelsbehandlade HeLa-celler med hög massupplösning. A) inzoomad fotografi av ett enda sondspetsen som visar en typisk storlek av <10 mikrometer i diameter. B) Fotografera taget på platsen för single-sond insättning i en HeLa-cell. Skala bar: 50 pm.c) En typisk positiv jon läge masspektrum med identifieringarna av ett antal PC (fosfatidylkolin) arter. d) En representativ lista av metaboliter upptäckts från SCMS analys av HeLa-celler både i positiva och negativa joner lägen. ef) Masspektra för kontroll och behandlade (100 nM OSW-1) celler (anpassad med tillstånd från referens 16). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1. Kretsschema för den elektroniska anordning som används för att producera kontakt stängning signal för masspektrometer för att samla in data. Klicka här för att se eller ladda ner denna siffra.
Discussion
Den enda sonden är en multifunktionell enhet som kan användas för både MSI och SCMS experiment. Den enda sond setup (inklusive översättning scensystem, mikroskop, ion källgränssnittet fläns, etc.) är utformad som en add-on komponent som kan flexibelt anpassas till den befintliga masspektrometer. En snabbt utbyte mellan den enda sonden inställning och den konventionella ESI jonkällan kan åstadkommas inom en minut. I princip, genom att använda den lämpliga jon källgränssnittet fläns, den enkel sonden konfiguration kan anpassas till de andra masspektrometrar. Dessutom kan provtagnings lösningsmedel innehållande en mängd olika reagens användas med det enda sond setup för reaktiva MSI och SCMS experiment, vilket i hög grad förbättrar detekteringen av bredare intervall av biomolekyler. Förutom djurvävnader och cellinjer, är den enda sonden också i stånd att analysera andra biologiska system, såsom växter. Därför, med samma experimentuppställning ochliknande användarutbildning, kan utföras ett flertal studier med hjälp av ett enda instrument och av samma användare, vilket möjliggör effektiva och mångsidiga experiment som ska utföras med minsta träningstid och instrumentering kostnad.
Nyckelkomponenten i enkel sonden MS teknik är själva sonden. Kvaliteten på den enda sonden har en betydande inverkan på dess prestanda, som till stor del avgör kvaliteten på både MSI och SCMS experiment. Vid tillverkning enkel sonder, se till att kapillärerna inne i dubbla innerdiameter är ordentligt limmade för att eliminera risken för läckage lösningsmedel under experimenten. Det är viktigt att använda en minimimängd av UV-härdbar epoxi, så att öppningarna och kapillärer inte är igensatta under sondens tillverkning.
Den enkel proben har använts för att genomföra hög rumslig och massupplösningen omgivnings MSI på biologiska prover 15. Den stora fördelen med omgivande MSI övericke-omgivande metoder är att provberedningen hålls på ett minimum med något behov av en vakuumprovtagnings miljö, vilket gör det prov som skall analyseras i en nära infödd stat 8. En av de stora hindren för de flesta andra omgivnings MSI teknik har varit en brist på rumslig upplösning 1. Jämfört med desorption baserad MSI tekniker (såsom DESI och LAESI), den lilla spets storlek enda sonden möjliggör en mer robust och effektiv yta flytande mikro-extraktion utföras över ett litet område, vilket leder till en hög rumslig upplösning av 8,5 pm, vilket är bland de högsta som uppnåtts med hjälp av omgivnings MSI tekniker 15. Dessutom justerar komponenterna i provtagningslösningsmedlet ger extra flexibilitet för att utföra experimenten. Till exempel provtagning lösningsmedel innehållande reagens (t.ex. dicationic föreningar) har använts för att utföra reaktiva MSI experiment, vilket möjliggör en betydande ökning av antalet metaboliter identifierats per experiment 20. Den andra fördelen med enkel sonden är integrerad design, som ger enkel drift under hela datainsamlingsprocessen. Eftersom avståndet mellan spetsen och vävnadsytan är mycket känslig för jon signalintensitet och stabilitet, att erhålla en plan vävnadssektion och ledande yta plattas justering för att minimera avståndet variansen är en nyckel för högkvalitativa MSI experiment. Härav följer att de enda sond MSI tekniker är inte lämpliga för att erhålla höga rumsliga MS bilder av ojämna ytor.
Förutom att tillverka en högkvalitativ sond, noggrant avstämma instrumentet är avgörande för en framgångsrik MSI experiment. Bland alla frekvenssteg, justering av höjden av den inre-sondspetsen ovanför vävnads ytsektion är den mest kritiska. Vid justering sonden höjd, pumpa provtagning lösningsmedel och slå på jonisering spänningen, så att endast de lösningsmedel bakgrunds jon signalerna kan vara Observed. Sedan övervaka förändringen av masspektrum medan noggrant reducerar prob-yta avstånd genom att lyfta det motoriserade Z-stadiet tills kan observeras god och stabil jon signaler från vävnadssektionen; denna sond höjd kommer att användas för MSI datainsamling under experimentet. Dessutom är en optimerad lösningsmedlets flödeshastighet väsentlig för MSI experiment. Justera flödet med den optimerade probhöjden. Se till att det inte finns något lösningsmedel sprids på vävnadsytan (dvs., är flödeshastigheten för hög) eller bubbelbildning inuti nano ESI emitter (dvs., flödeshastighet är för låg).
Den enda sonden är en multifunktionell enhet för bioanalys. Förutom MSI experiment, är det kapabel att genomföra nära realtid in situ SCMS att belysa detaljerad kemisk information från levande eukaryota celler 16, vilket är en stor fördel jämfört med andra vakuumbaserade SCMS tekniker (t.ex. MALDI 10 och SIMS 21 (t.ex. dicationic föreningar) användas i SCMS experiment och ett bredare utbud av cellbeståndsdelar kan upptäckas i en levande enda cell än någonsin tidigare (pågående forskning, data visas ej). Även om den analys i realtid kommer att ge de kemiska profiler av levande enstaka celler, på grund av cellpenetration av membran och utvinning av cellinnehållet, kommer cellen som undersöks avlivas efter experimentet, vilket innebär att den inre-sonden SCMS teknik är fortfarande en destruktiv metod. Dessutom kan sondspetsen och nano-ESI emitter i enkel sonden lätt igensatt för oerfarna användare. För att minska risken för enheten igensättning, säkerställa att undvika att röra kärnan när du sätter enkelsondspetsen i en cell. Om tilltäppning inträffar, kan anordningen regenereras genom att värma upp tilltäppta sondspetsen eller nano-ESI emitter användning av en hembyggd värmeslinga 16. En annan begränsning av den enda sonden SCMS tekniken är att endast de vidhäftande celler (dvs celler fästa till ytor) kan analyseras med hjälp av aktuella inställningar. Emellertid genom att införliva den cellmanipulering systemet i den inre-sonden MS apparat, bredare typer av celler kan studeras i framtiden.
Liknande den MSI experimentet, erhålla en högkvalitativ sond och en optimerad lösningsmedlets flödeshastighet är kritisk för SCMS studier. När avstämning av lösningsmedelsflödet, är det enda sondspetsen placeras ovanför provet (dvs, ingen kontakt med cellen eller odlingsmedium), och se till att det inte finns något lösningsmedel droppar från sondspetsen eller blåsbildning på insidan av nano-ESI emitter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Single-probe fabrication | |||
| Dual bore quartz tubing, 1.120’’ × 0.005” × 12” | Friedrich & Dimmock, Inc, Millville, NJ | MBT-005-020-2Q | |
| Micropipette laser puller | Sutter Instrument Co., Novato, CA | Model P-2000 | |
| Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 110 µm | Molex, Lisle, IL | TSP040105 | |
| UV curing resin | Prime Dental, Prime-Dent, Chicago, IL, USA | Item No. 006.030 | |
| LED UV lamp | Foshan Liang Ya Dental Equipment, Guangdong, China | LY-C240 | |
| Epoxy resin | Devcon, Danvers, MA | Part No. 20945 | |
| Inline MicroFilter | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-520 | |
| Microunion | IDEX Health & Science LLC, Lake Forest, IL | M-539 | |
| Microscope slide (glass) | C & A Scientific - Premiere, Manassas, VA | 9105 | |
| Syringe | Hamilton, Reno, NV | 1725LTN 250UL | |
| Mass spectrometer | |||
| LTQ Orbitrap Mass sprectrometer | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | LTQ Orbitrap XL | |
| Xcalibur 2.1 Software | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | XCALIBUR21 | |
| Fance Stage Control | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| MSI QuickView | Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA | ||
| Contact closure device | |||
| USB-6009 Multifunction DAQ | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| DR-5V SDS Relay | Panasonic, Kadoma, Japan | DR-SDS-5 | |
| Logic Gates 50 Ohm Line Driver | Texas Instruments, Dallas, TX | SN74128N | |
| Single-probe setup | |||
| Motorized linear stage and controller (3 sets) | Newport, Irvine, CA | Conex-MFACC | |
| Miniature XYZ stage | Newport, Irvine, CA | MT-XYZ | |
| Translation XY stage | ThorLab, Newton, NJ | PT1 and PT102 | |
| Thermo LTQ XL ion source interface flange | New Objective, Woburn, MA | PV5500 | |
| Digital stereo microscope, 250X - 2,000X | Shenzhen D&F Co., Shenzhen, China | Supereyes T004 | |
| USB Digital Photography Microscope | DX.com, HongKong, China | S02 25~500X | |
| Syringe pump | Chemyx Inc., Stafford, TX | Nexus 3000 | |
| Solid Aluminum Optical Breadboard, 8" x 8" x 1/2" | Thorlabs, Newton, NJ | MB810 | |
| Flexible clamp holder | Siskiyou, Grants Pass, OR | MXB-3h | |
| Solvents | |||
| Methol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34860 Chromasolv | |
| Water | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | W4502 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 34967 Chromasolv | |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro, Manasas, VA | 10-013-CV | |
| 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Gibco/Life Technologies, Long Island, NY | 10100-139 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro, Manasas, VA | 30-002-CI | |
| 10 mM HEPES (pH 7.4) | Cellgro, Manasas, VA | 25-060-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Cellgro, Manasas, VA | 46-013-CM | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 12604-013 | |
| 12-well plates | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 351143 | |
| T25 flask | Corning Inc., Corning, NY | Falcon 3055 | |
| Micro Cover Glasses, Round, No. 1 | VWR International, Radnor, PA | 48380-046 | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | VWR International, Radnor, PA | BDH1115-1LP | |
| Tissue imaging | |||
| Cyro-Cut Microtome | American Optical Coporation | ||
| Tissue-Tek, Optimum cutting temperature (OCT) | Sakura Finetek Inc., Torrance, CA | 4583 | |
| Microscope slide (polycarbonate) | Science Supply Solutions, Elk Grove Village, IL | P11011P | |
References
- Vickerman, J. C. Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI? Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).
- Schwamborn, K. Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation. J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).
- Schwamborn, K., Caprioli, R. M. MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures. Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).
- Kraft, M. L., Klitzing, H. A. Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry. Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).
- Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).
- Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).
- Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. Mass spectrometry imaging under ambient conditions. Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms. Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).
- Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry. Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).
- Shrestha, B., et al. Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry. PLoS One. 9 (12), e115173 (2014).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).
- Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Thomas, M., et al. Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition. 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).
- Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface. Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).
- Zhou, Y., et al. OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action. J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).
- Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).
- Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations. Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).
