Introduction
Dråpe MicroFluidics gi en plattform for høy gjennomstrømming biologi ved compartmentalizing eksperimenter i et stort antall vanndråper suspendert i en transportør olje 1. Dråpene har vært brukt i anvendelser så forskjellige som enkelt celle analyse 2, digital-polymerase kjedereaksjon (PCR) 3, og enzymet evolusjon 4. Fluorescent analysene er standard modus for gjenkjenning for dråpe MicroFluidics, som sine lyse signaler og rask tid respons er kompatible med påvisning av sub-nanoliter dråpevolum på kHz priser. Mange programmer krever fluorescens deteksjon i minst to farger samtidig. For eksempel vårt laboratorium som vanligvis utfører PCR-aktivert dråpe sortering eksperimenter som bruker en deteksjonskanal for resultatet av en analyse, og bruker et sekundært bakgrunn fargestoff for å gjøre analysen-negative dråpe tellbar 5.
Typiske deteksjon stasjoner for dråpe MicroFluidics er based på epifluorescence mikroskop, og krever komplisert lette manipulasjoner ordninger for å innføre eksitasjon lys fra frie plass lasere i mikroskop for å være fokusert på prøven. Etter fluorescens avgis fra en dråpe, er det emitterte fluorescerte lyset filtreres slik at hver deteksjons kanal benytter en fotomultiplikatorrøret (PMT) sentrert på et bølgelengdebånd. Epifluorescence mikroskop-basert optisk deteksjonssystemer gir en barriere for å komme på grunn av deres bekostning, kompleksitet, og nødvendig vedlikehold. Optiske fibre gir mulighet til å konstruere en forenklet og robust deteksjon ordningen, ettersom fibre kan manuelt innføres i microfluidic enheter, fjerner behovet for speilbasert lys ruting, og slik at lysbanene til å kobles sammen ved bruk av fiberoptiske kontakter.
I denne artikkelen beskriver vi montering og validering av en kompakt og modulær ordningen for å utføre flerfarget fluorescens deteksjon ved å utnytte en rekke optiske fibre enda enkelt fotodetektoren 6. Optiske fibre er koplet til individuelle lasere og er satt normal til en L-formet strømningskanal med jevne romlige forskyvninger. En fluorescens samling fiber er orientert parallelt med eksitasjon regionene og er koblet til en enkelt PMT. Fordi en dråpe passerer gjennom laserstrålen ved forskjellige tidspunkter, data registrert ved PMT viser en tidsforskyvning som gjør det mulig for brukeren å skille mellom fluorescensen avgitt etter at dråpen er eksitert ved hver distinkt laserstrålen. Denne tidsmessige forskyvning eliminerer behovet for å skille lys som utsendes til separate PMTs ved hjelp av en serie av dikroiske speil og båndpassfiltere. For å bekrefte effektiviteten av detektoren, kvantitere vi fluorescens i dråpe populasjoner innkapsle fargestoffer av forskjellig farge og konsentrasjon. Følsomheten til systemet blir undersøkt for én farge fluorescein deteksjon, og viser evne til å påvise dråper med konsentrasjoner ned til 0,1 nM, en 200x følsomhet improvement sammenlignet med de senere fiberbaserte tilnærminger som er rapportert i litteraturen 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SU8 Master Fabrication
- Designe microfluidic strukturer for tre lag fabrikasjon ved hjelp av design software og har design som skrives ut av en leverandør på kretskort film med 10 mikrometer oppløsning. Detaljene i anordningen utforming er gitt i en vedlagt referanse 6 og kanal geometrier er vist i figur 1. Lagene bør omfatte justeringsmerkene for å sammenstille egenskaper fra hver fabrikasjon lag 8.
- Plasser et pre-renset 3 tommers diameter silisiumskive på en spinn coater og slå på vakuum for å feste den til chucken. Anvende 1 ml av SU8-3050 i midten av skiven og spinn i 20 sekunder ved 500 rpm, og deretter 30 sekunder ved 1750 rpm, noe som gir en sjikttykkelse på 80 um.
- Fjerne skiven og bake på en 135 ° C varmeplate i 30 minutter. La wafer avkjøles til romtemperatur før du går videre til neste trinn.
- Utsett belagt wafer til 1. lagmaske under en kollimert 190 mW, 365 nm LED i 3 min. Etter eksponering, plasserer wafer på en 135 ° C kokeplate i 1 minutt, deretter avkjøles til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
- Plasser wafer på spin coater og slå på vakuum for å feste den til chucken. Anvende 1 ml av SU8-3050 i midten av skiven og spinn i 20 sekunder ved 500 rpm, og deretter 30 sekunder ved 5000 rpm, noe som resulterer i et lag som gir en ekstra tykkelse på 40 um.
- Ta av wafer og bake på en 135 ° C kokeplate i 30 min, deretter avkjøles til romtemperatur før du går videre til neste trinn.
- Juster 2. lagmaske på geometri mønstret i 1,3 og eksponere den belagte wafer til en kollimert 190 mW, 365 nm LED for 3 min. Etter eksponering, plassere på en 135 ° C kokeplate for 4 min 30 sek, deretter avkjøles til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
- Plasser wafer på spin coater og slå på vakuum for å feste den til chucken. Anvende 1 ml av SU8-3050 i midten av skiven og spinn i 20 sekunder ved 500 rpm, deretter 30sekund ved 1000 rpm, noe som resulterer i et lag som gir en ekstra tykkelse på 100 um.
- Ta av wafer og bake på en 135 ° C kokeplate i 30 min, deretter avkjøles til romtemperatur før du går videre til neste trinn.
- Juster 3. lagmaske på geometri mønstret i 1,3 og eksponere den belagte wafer til en kollimert 190 mW, 365 nm LED for 3 min. Etter eksponering, plassere på en 135 ° C kokeplate for 9 min, deretter avkjøles til romtemperatur før du fortsetter til neste trinn.
- Utvikle maskene ved neddykking i et omrørt bad av propylenglykol-monometyleter-acetat i 30 minutter. Vask wafer i isopropanol og bake på en 135 ° C kokeplate i 1 min. Plasser utviklet mester i en 100 mm petriskål for polydimethylsiloxane (PDMS) støping.
2. PDMS enheten fabrikasjon
- Forbered 10: 1 PDMS ved å kombinere 50 g silikon base med 5 g av herdemiddel i en plastkopp. Bland innholdet med et multiverktøy utstyrt med en rørepinne. Degidet blandingen inne i en eksikator i 30 minutter, eller inntil alle luftbobler er fjernet.
- Hell PDMS for å gi en tykkelse på 3 mm over master og plassere tilbake i eksikator for videre avgassing. Når alle bobler er fjernet, bake til enheten ved 80 ° C i 80 min.
- Skjær enheten fra formen ved hjelp av en skalpell og sted på en ren overflate med mønstrede siden opp og punch fluidumsforbindelsene innløp og utløp med en 0,75 mm biopsi punch. Enheten må kuttes slik at de 120 mikrometer og 220 mikrometer høye geometrier er tilgjengelig fra siden av enheten.
- Plasma behandle enheten, med funksjonen side opp, sammen med en pre-renset 2 inches med 3 inches glass lysbilde på en mbar O 2 plasma i 20 sekunder i en 300 W plasma renere. Binde PDMS-enheten ved å plassere det mønstrede side av PDMS apparatet på plasma-behandlede side av glass-slide. Plasser enheten i en 80 ° C ovnen og stek den sammensatte enhet for 40 min.
- Render kanalenehydrofob ved hjelp av en sprøyte for å spyle enheten med et fluorert overflatebehandlingsfluid. Umiddelbart bake til enheten ved 80 ° C i 10 minutter for å fordampe løsningsmidlet.
3. Utarbeidelse av optiske komponenter
- Klargjør laser eksitasjon fiber ved å fjerne isolasjonen fra siste 5 mm av en 105 mikrometer core, 125 mikrometer kledning, NA = 0,22 optisk fiber.
- Klargjør 2 nd farge laser eksitasjon fiber ved å gjenta 3.1 for en 2 nd identisk fiber.
- Forberede fibrene for oppsamling av fluorescens-signalet ved å gjenta 3,1 for en 200 um kjerne, 225 um kledning, NA = 0,39 optisk fiber.
- Inspiser tips av alle fibrene - hvis tipsene ikke ender i en flat overflate, re-spalte ender med en fiberspiss.
- Fest en laser fiber coupler til en 50 mW, 405 nm laser og fest en av de 105 mikrometer kjernefibre til laseren. Lede den avisolerte enden på sensorens av lasereffektmeter, og bruke de fine justeringer av laseren kobleren for å maksimere den lasereffekt.
- Gjenta 3.5 for en nm laser 50 mW, 473.
- Monter en 446/510/581/703 nm quad båndpassfiltre på PMT bruker linse rør for å blokkere laserlys og overføre slippes fluorescens. Fest fiber coupler slik at lyset reiser gjennom filtrene før du treffer PMT.
- Fest fiber fra 3,3 til enheten montert på 3,7.
4. Offline Mixed Emulsion Generation
- Skaff en flyt fokus MicroFluidics dropmaker enhet med en 60 nm x 60 mikrometer åpning.
- Fyll en 1 ml sprøyte med HFE 7500 oljer med 2% ionisk fluor 9.
- Fyll en serie på 1 ml sprøyter med følgende kombinasjoner av fluorescein (FITC) og dekstran-konjugerte blå fargestoffer (CB) i PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, og 10 nM FITC / 100 nM CB.
- Monter dropmaker enhet på scenen av en omvendt mikroerhåndtere og de vandige og olje sprøyter på sprøytepumper. Par sprøytene til enheter ved hjelp av PE-to rør.
- Løpesprøytepumper ved 500 pl / t for olje- og 250 pl / t for de vandige oppløsninger, skape en blanding av 80 um dråper som inneholder løsningene fra 4,3. For hver type vandig prøve, bruke en fersk dropmaker enhet for å eliminere kryssforurensning. Samle ~ 200 ul emulsjon fra hver fargestoff-formasjon inn i en tom sprøyte.
- Etter at de 4 dråper typene er samlet i en enkelt samlesprøyten, blandes emulsjonen ved gjentatte ganger å dreie sprøyten.
- Gjenta trinn 4.2 til 4.6 med vandige oppløsninger som inneholder 0,1, 1, 10 og 100 nM FITC i PBS.
5. Optical Fiber Insertion
- Plasser microfluidic chip fabrikkert i trinn 2 på scenen av en invertert mikroskop kombinert med et digitalt kamera som kan <100 usekunder lukkerhastigheter.
- Arbeid forsiktig fra siden, insert fiber koblet til 473 nm laser i lengst oppstrøms 120 mikrometer kanal, tar seg ikke å punktere gjennom til hovedstrømningskanalen.
- Sett fiber er koplet til 405 nm laser i den ytterste nedstrøms 120 pm høyt sidekanal, som gir fiberavstand på 300 um.
- Sett PMT-koplet fiber inn i det 220 um høye kanal normalt på de to laser eksitasjon fibre.
6. Fluorescence Detection of Mixed emulsjoner
- Monter en 5 ml sprøyte fylt med HFE 7500 med 2% ionisk fluor til avstands olje innløpet til detektoren med PE-to rør.
- Monter sprøyten som inneholder blandede FITC / CB emulsjon på en vertikalt orientert sprøytepumpe og par til enhetens dråpe reinjeksjon innløp ved hjelp av PE-to rør. Koble en lengde på PE-to rør fra enheten utgang til en avfallsbeholder.
- Prime enheten ved å kjøre hver av pumpene på 1000 mL / t til bådeolje og dråper er sett til å være regelmessig kombinere i enheten, og flyter nedstrøms.
- Justere strømningshastighetene slik at avstands olje kjører på 6000 mL / t og dråpene ved 100 ul / time, noe som gir betydelig avstand mellom dråpene som reiser gjennom deteksjons regionen.
- Slå på lasere, starte datainnsamlingsprogram, og justere PMT gevinst å gi signaler som er mer enn 100x grunnlinjen støynivå. Juster laser makt, slik at alle doublet toppene er godt synlig på et enkelt, lineært skalert timetrace.
- Erverve 60 sek av PMT spenning timetrace på minst 20 kHz. Importere data inn computing program som Matlab og måle høyden av toppene i de registrerte dubletter ved hjelp av tilpassede computing program script.
MERK: Dette er gitt som tilleggsinformasjon. - Gjenta trinn 06.02 til 06.07 med FITC-bare blandet emulsjon opprettet i 4.7, med 405 nm laser slått av.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikasjon av en PDMS anordning som gjør det mulig for innføring av optiske fibre krever en flertrinnsfotolitografi fremgangsmåte for å opprette kanaler med varierende høyde (figur 1). Først blir en 80 um høye lag av SU-8 spunnet på en silisiumskive og mønstret ved hjelp av en maske for å skape fluidhåndtering geometri. Deretter blir ytterligere 40 um lag av SU-8 slynget på skiven, og mønstret ved hjelp av en annen maske for å skape trekk som vil danne 120 um høye laserfiber innføringskanaler. Endelig, 100 um mer SU-8 slynget på skiven, og mønstret for å gi 220 um høy deteksjonsfiber innføringskanaler. Hoved er utviklet og benyttet for å støpe en PDMS-enhet, som i sin tur er bundet til et objektglass. Den endelige fabrikasjon inneholder 80 mikrometer høy flyt geometri, via hull slått i toppen av enheten og 120 mikrometer og 220 mikrometer høye optiske fiberkanaler tilgjengelig gjennom den siden avenhet.
Geometrien av den innretning som anvendes for deteksjon er vist i figur 2. Eksternt generert 80 um emulsjoner er re-injisert inn i en dråpe reinjisering port og adskilt av avstands olje før de strømmer inn i en L-form deteksjonskanal. To laser koplet fibre innføres i 120 um høye kanaler tilveiebringe eksitasjon ved adskilte romlige lokasjoner i strømningskanalen. Fordi flermodusfibere er satt inn i disse kanalene ha en 125 um ytterdiameter, og en 105 pm kjernediameter, er hele tverrsnittet av strømningskanalen belyses av laserlyset. I vår enhet påvisning strømningskanalen gjør en brå 90 graders sving etter den siste laser eksitasjon regionen for å skape nær optisk tilgang for en 225 mikrometer OD fiber brukes til å oppdage slippes fluorescens. Jo større fiber blir brukt på grunn av sin høye numerisk apertur (NA = 0,39), som er lik en standard mikroskopobjektiv.
En dråpe strømmer gjennom deteksjons kanal støter adskilte eksitasjon områder foran hver av de laser-koplede optiske fibre (figur 3A). Singelen PMT koblet til deteksjonsfiber postene som sendes ut fluorescens med en tidsmessig forskyvning kartene til eksitasjon kilde. For en dråpe som inneholder fargestoffer som eksitere ved 473 nm (region "1" på figur 3A) og ved 405 nm (region "2" i figur 3B), inneholder den resulterende PMT-signal et signal dublett med en toppseparasjons som korrelerer med den tiden det tar en dråpe å flytte fra en eksitasjon region til den neste. Ved tidsmessig koder for spektral-data på denne måte, er det behov for ytterligere lys filtrering og separate PMTs for hver fluorofor farge eliminert. Figur 3B viser signal dubletter for et tog av 4 dråper med forskjellige farvekombinasjoner. Den første toppen i dobbel svarers til fluorescensen avgitt etter eksitasjon ved 473 nm laser i region "1" og den andre topp tilsvarer fluorescens avgitt etter eksitasjon ved 405 nm laser i region "2".
Effekten av deteksjons ordningen ble testet ved å detektere en blandet emulsjon av dråper inneholdende fargestoffer som opphisse ved 405 nm (dekstran-konjugerte blå, CB) og ved 473 nm (fluorescein, FITC). Dråper ble strømmet gjennom deteksjons regioner på omtrent 50 Hz og data ble registrert i 60 sek, deretter etter behandlet med et dataprogram script. Dataene er plottet i figur 4, og viser klart skille mellom de fire re-injiseres dråpe typer. På grunn av at deteksjonssystemet ikke skille mellom forskjellige farger av lys som sendes ut, blir hver dråpe beskrevet ved sin maksimale totale fluorescens etter å være spent i region "1" (topp 1) og i region 2 (topp 2).
(figur 5). Dataene viser evnen til å detektere fargestoff konsentrasjon som varierer fra 0,1 til 100 nM FITC på en enkelt detektor med samme gjenkjenning innstillinger.
Figur 1. Flerlags fotolitografi. Den microfluidic enheten er fabrikkert ved å skape en mester med tre ulike funksjons høyder. Først blir en 80 um høye lag av SU-8 spunnet på og mønstret ved hjelp av en maske for væskekanalene. Deretter ble 40 um mer SU-8 spunnet på 120 um og høye funksjoner som er mønstret med en 2 nd maskere gjennom begge de SU-8 lag for å gi geometri for å få plass til 125 um høye optiske fibre. Etter dette, en00 um mer SU-8 spinnes på, og formet med en 3 rd maske for å gi 225 um høye egenskaper. Etter å ha utviklet, PDMS molding, og plasma binding til glass, inneholder den resulterende enhet store kanaler som er tilgjengelige fra side til fiber innsetting, i tillegg til standard lukkede væskekanaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Enhets design og optisk layout. Fluidumsforbindelsene partier av anordningen består av en dråpe reinjector og en oljeavstands, koblet til en L-formet kanal. Fibre som er koplet til de enkelte lasere er innsatt vinkelrett på strømningsretningen. En deteksjons fiber er innført vinkelrett på laser fibrene for å samle fluorescerende lys. Dette lyset blir filtrert gjennom abandpass filter, før han ble oppdaget av en enkelt PMT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Temporal koding av flerfarget informasjon. (A) Dråper strømme gjennom eksitasjon regioner "1" og "2" på forskjellige tidspunkter, noe som gir tidsforskyvning som gir identifikasjon av det utsendte lys. (B) av data fra et tog av 4 forskjellige dråper som strømmer gjennom deteksjons kanal. Den første toppen av hver dublett svarer til fluorescensen avgitt etter eksitasjon i region "1" og den andre topp i hver dobbelt svarer til fluorescensen avgitt etter eksitasjon i region "2". Høyden på dråpestopper er proporsjonale mengden fargestoff spent på engitt bølgelengde, bortsett fra når spektral blø oppstår på grunn av bruk av fargestoffer med overlappende eksitasjon spektra. Bredden av toppene bestemmes av hvor lang tid det tar en dråpe å krysse en eksitasjon region. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Multicolor påvisning av en blandet dråpe befolkning. Spredningsplott som viser maksimal dråpe intensiteter for en blandet populasjon dråpe etter eksitasjon og emisjon ved en 473 nm laser (topp 1) og en 405 nm laser (topp 2). Dråpene inneholder kombinasjoner av fluorescein (FITC) og kaskade blå (CB) på nM konsentrasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
Figur 5. Enkel fargegjenkjenning på svært variert dråpe befolkningen. Histogram av utslipp med en blandet dråpe befolkning som inneholder 0,1-100 nM av fluorescein etter eksitasjon av en 473 nm laser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiberoptisk påvisning krever innretting av optiske fibre med hensyn til væskekanaler. Fordi vår enhet benytter føringskanaler fabrikkert med flerlags fotolitografi, plassering av masker i forhold til hverandre er av stor betydning. Dersom fiberføringskanalene er for nær fluidkanalen, er det en potensiell fare for væskelekkasje; hvis føringskanalene er plassert for langt borte eller feiljustert, kan fluorescens signal ufarlig for påvisning fiber bli betydelig redusert. Riktig justering kan bli hjulpet ved å utforme justeringsmerkene, som konsentriske sirkler inn masker for å bli samlokalisert i løpet bilde mønster. I tillegg, manuell innføring av fiberoptikk i anordningen er en delikat prosess med potensial for å bryte spissene av fibrene inne i anordningen, gjør dem ubrukelige. Besøksforbud fiber mot glasset lysbilde festet til PDMS enhet og sette inn fibrene sakte mens observere med mikroskopet er nøklene til SUCCessful fiber innsetting. Siste, reinjeksjon av pre-dannede emulsjoner bør skje med et minimum av håndtering. Ideelt sett, når emulsjonen er fremstilt og satt direkte inn i en tom sprøyte, det bør ikke bli overført til den brukes for dråpe reinjeksjon.
Flerfarget påvisning krever at toppene i et signal dublett være adskilt fra hverandre, og at signalene fra på hverandre følgende små dråper ikke overlapper. Påvisningen oppsett som vi bruker her anvender et par på 125 um optiske fibre adskilt ved et senter-til-senteravstand på 300 um, noe som gir et ikke-belyste området på ~ 175 nm eksitasjon mellom regionene. Dette tillater en 80 um dråpe som skal eksiteres av bare en lyskilde på en gang, og sikrer at hver av toppene i en dublett er utelukkende et resultat av en type laser eksitasjon. Konstruksjoner hvor avstanden mellom eksitasjon regionene er lik den dråpediameter gi problematiske signaler med overlappende dubletter emisjonstopp. Than bredde av et signal dublett korrelerer til den tid det tar for den fremre kant av en dråpe for å skrive inn de første eksitasjon regionene til den tid den bakre kant av dråpene til å forlate den endelige magnetisering region, en avstand på ~ 500 mikrometer i enhet vi beskrive. For å opprettholde tydelighet av tilstøtende detekterte dråper, signal dubletter trenger å bli adskilt ved et lavt signalområde er minst like bredt som signalet dublett. For konfigurasjonen beskrevet her, er 80 mikrometer dråper fordelt på minst 1 mm fra hverandre.
Selv om flerfargedeteksjon med en enkelt fotodetektor muliggjør betydelige besparelser i form av kostnader og kompleksitet i forhold til standard teknikker, er det et visst tap av robusthet fordi lyset ikke blir filtrert av bølgelengde. Dette kan være problematisk når det oppdages dråper som inneholder flere fluoroforer som opphisse ved de samme bølgelengder, fordi fluorescensen kilden er utvisket. Disse begrensningene kan være overcome ved å utføre forsøk med ikke-overlappende eksitasjon profiler, eller ved å utforme forsøk hvor spektral blø spissen ikke forekommer i en "kanal", hvor en sensitiv analyse blir utført. Dette er forenlig med mange dråpemikrofluid deteksjon søknader, hvor en lys bakgrunn fargestoff benyttes til å indikere tilstedeværelsen av en dråpe, og en andre fluoroforen blir brukt til å rapportere resultatet av en molekylærbiologisk analyse 10,11.
Sammenlignet med standard teknikker, har vår tilnærming to fordeler: 1) romlig registrerte eksitasjon regioner eliminerer behovet for komplisert lys filtrering, og 2) bruk av fiberoptikk fjerner behovet for et mikroskop og optisk maskinvare for direkte lys. Fordi vi adressere felles tekniske bekymringer med microfluidic deteksjonssystemer, har tidligere etterforskere utviklet metoder for å løse lignende bekymringer. For eksempel, Martini et al. Frekvens-kode flerfarget fluorescens registrertav en enkelt detektor ved å projisere en eksitasjon kilde gjennom unikt mønster "bar code" filtrerer 12. Vår bruk av en optisk fiber matrise tillater utnyttelse av en tilsvarende tidsmessig kodeskjema ved hjelp av standard, hyllevare komponentene. Litteraturen viser optiske rekke optiske koblingsteknikker som er mer kontrollert at den enkle fiber innsetting at vi beskrive. Bliss et al. Bruke væskefylte optiske bølgeledere for nøye kontrollert levering og henting av lys fra bestemte microchannel steder 13, Martinez Vasquez et al. Bruke bølgeledere laser etset inn smeltet Silica underlag for å levere eksitasjon lys 14, og Vishnubhatla et al. Er i stand til nettopp dikte fiber innsetting kanaler som bruker en kombinasjon av laser stråling og kjemisk etsing 15. Hver av disse teknikkene krever ytterligere trinn utover de som brukes for å fremstille basis fluidic arkitekturen av et microfluidic chip. Selv om disse fremstillingsfremgangsmåtene kan være nødvendig for svært sensitive deteksjon søknader, har vi funnet at fiber innsetting i en støpt PDMS kanal er tilstrekkelig for de fleste av de vanlige anvendelser i vårt laboratorium. Deteksjonssystemet var i stand til å oppdage FITC konsentrasjoner ned til 100 pM i 80 mikrometer dråper, omtrent tilsvarende påvisning av ~ 17.000 fluoroformolekyler. Denne følsomhet er tilstrekkelig for de fleste anvendelser deteksjon i vårt laboratorium som benytter en epifluorescens-basert system, den mest vanlige av disse blir PCR-aktivert cellesortering av assay-positive dråper som inneholder den tilsvarende 10 6 fluoroformolekyler 11. Den følsomhet sammen også gunstig til nylig rapportert sensitiviteter av andre optiske fiberbaserte systemer - for eksempel er det 200x mer følsom enn deteksjonsgrensen på 20 nM av Alexa Fluor 488 rapportert i> 100 mikrometer dråper 7.
We har presentert en kompakt og modulær dråpemikrofluidflerfargedeteksjon ordningen som et alternativ til mer kostbare, kompliserte og plasskrevende epifluorescens mikroskop baserte systemer. De nødvendige deteksjons komponenter som brukes her (lasere, fiber, fiber adaptere, filter og PMT) kan kjøpes for <$ 10.000, noe som gjør den multi-farge dråpe deteksjon tilgjengelig for et stort antall etterforskere, og slik at den enkelte etterforskere for å ha råd til flere deteksjonsstasjoner i et laboratorium. Systemet fjerner også noen kompetansebaserte etableringshindringer, som en grad av fortrolighet er nødvendig å justere ledig optiske systemer i forbindelse med en epifluorescence mikroskop. I tillegg den lille fotavtrykk av påvisninger oppsett gjør den ideell for bærbare og diagnostiske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photomasks | CadArt Servcies | ||
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml syringes | BD | 309628 | |
| 10 ml syringes | BD | 309604 | |
| 27 gaugue needles | BD | 305109 | |
| PE 2 polyethylene tubing | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
| Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref #10 | ||
| Dextran-conjugated cascade blue dye | Life Technologies | D-1976 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma | 28803 | |
| Quad bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/581/703-25 | |
| PMT | Thorlabs | PMM02 | |
| Fiber port | Thorlabs | PAFA-X-4-A | |
| lens tube | Thorlabs | SM1L05 | |
| Patch cable with 200 μm core / 225 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| Patch cable with 105 μm core / 125 μm cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector | Thorlabs | Custom | |
| 125 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T08S13 | |
| 225 μm fiber stripping tool | Thorlabs | T10S13 | |
| laser fiber adapter | OptoEngine | FC/PC Adapter | |
| 405 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MDL-III-405 | Distributor for CNI lasers |
| 473 nm CW laser at 50 mW | OptoEngine | MLL-FN-473-50 |
References
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).
- Hindson, B. J., Ness, K. D. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).
- Agresti, J. J., Antipov, E. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLOS ONE. 8 (4), (2013).
- Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics. Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).
- Guo, F., Lapsley, M. I. A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis. Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).
- Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
- DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants. Anal Chem. 85 (21), (2013).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip. 12, 882 (2012).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops. Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).
- Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer. Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).
- Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis. Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).
- Martinez Vazquez, R., Osellame, R. Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides. Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).
- Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching. Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).
