血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症成像

摘要

血管钙化是人类心血管疾病的重要预测因子和促成因素。本方案描述了诱导原代培养的血管平滑肌细胞发生钙化的方法，以及利用近红外荧光成像技术对动物主动脉中的钙化程度和巨噬细胞负荷进行定量分析的方法。

摘要

心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因。在冠状动脉、主动脉瓣、主动脉及外周传导动脉中，会形成由富含脂质的巨噬细胞和钙化组成的动脉粥样硬化斑块，这是心血管疾病的典型特征。在人类中，通过计算机断层扫描成像可对血管钙化进行定量；血管钙化的存在是未来心血管事件的强有力预测指标。开发心血管疾病的新疗法，关键在于加深对动脉粥样硬化潜在分子机制的理解。推进对动脉粥样硬化机制的认识依赖于小鼠模型和细胞模型。本文详细描述了一种利用两种光谱 distinct 的近红外荧光成像探针来成像主动脉钙化和巨噬细胞浸润的方法。近红外荧光成像可对整个主动脉中的钙化和巨噬细胞积聚进行离体（ex vivo）定量，有助于进一步理解动脉粥样硬化中炎症与钙化之间的机制关系。此外，还介绍了一种分离和培养动物主动脉血管平滑肌细胞的方法，以及一种诱导培养的平滑肌细胞钙化的方案，该方案适用于小鼠主动脉或人冠状动脉来源的细胞。这种体外（in vitro）血管钙化建模方法可用于识别和表征可能在血管疾病发展中起重要作用的信号通路，以期发现新的治疗靶点。

引言

心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因，其中包括美国，每年导致超过78万例死亡。¹ 冠状动脉钙化和主动脉钙化是动脉粥样硬化疾病的标志性特征，并可作为心血管事件的强有力预测指标。^2-4 在成人中已报道两种主要类型的血管钙化：与动脉粥样硬化相关的内膜钙化，以及与慢性肾病和糖尿病相关的中膜（亦称Mönckeberg）钙化。⁵ 内膜钙化发生在脂质积聚和巨噬细胞浸润血管壁的背景下。^5,6 中膜钙化独立于内膜钙化发生，定位于弹性纤维或平滑肌细胞，且不伴随脂质沉积或巨噬细胞浸润。^5,7,8 关于血管钙化分子机制的研究依赖于细胞实验和动物模型系统。用于动脉粥样硬化性钙化疾病的啮齿类动物模型包括载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠^9,10或低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷小鼠¹¹，并喂饲高脂饮食；而中膜钙化模型则包括基质Gla蛋白（MGP）缺陷小鼠¹²，或通过近乎全肾切除（五分之六肾切除模型）或喂饲高腺嘌呤饮食诱导尿毒症的大鼠。¹³

本文重点介绍与MGP缺乏相关的血管中膜钙化模型。MGP是一种细胞外蛋白，可抑制动脉钙化。¹² 在Keutel综合征患者中已发现MGP基因的突变，该综合征是一种罕见的人类疾病，其特征除短指骨、听力损失和外周肺动脉狭窄外，还包括弥漫性软骨....

方案

所有涉及小鼠的研究均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。本研究中关于小鼠的饲养及所有操作程序均经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（研究动物护理小组委员会）批准。所有操作均谨慎执行，以尽量减少动物痛苦。

1. 试剂的准备

1. 全主动脉近红外荧光成像
   注意：一种双膦酸盐衍生的近红外荧光成像探针可通过结合羟基磷灰石来标记血管系统中的成骨活性。^46,47 一种组织蛋白酶激活的荧光成像探针可作为血管系统中巨噬细胞蛋白水解和弹性蛋白水解活性的标志物。⁹ 为了同时使用这两种荧光探针，重要的是选择光谱上互不重叠的探针。本文将使用“钙 NIR”表示特异性针对钙化的近红外荧光成像探针，使用“组织蛋白酶 NIR”表示特异性针对组织蛋白酶活性的近红外荧光成像探针。
   1. 配制钙 NIR 和组织蛋白酶 NIR 溶液。根据制造商说明书，向含有 24 nmol 钙 NIR 或组织蛋白酶 NIR 的小瓶中加入 1.2 ml 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻振荡混匀。
      注意：根据制造商说明，钙 NIR 和组织蛋白酶 NIR 溶液在用 PBS 重悬后，若在 2–8 °C 避光保存，可稳定保存 14 天。
2. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离与钙化
   1. 主动脉消化液：
      1. 使用 H....

结果

MGP中的主动脉钙化^-/- 通过钙的近红外荧光成像检测野生型小鼠的钙化情况。在野生型小鼠的主动脉中未检测到钙的近红外荧光信号，表明无钙化现象。图2). 在MGP缺陷型小鼠的主动脉中检测到强烈的钙NIR信号，这与严重的血管钙化一致。来自野生型和MGP^-/- 小鼠经茜素红染色²⁵ (图 3A-B），证实了MGP缺陷小鼠存在广泛的血管钙化，而在野生型小鼠中未检测到钙化。为了确定MGP缺陷相关的血管钙化是否依赖于BMP信号通路，MGP^-/- 小鼠从出生第1天开始接受LDN、ALK3-Fc或对照溶剂处理。在第27天注射钙NIR，次日取材主动脉。通过钙NIR检测发现，BMP信号通路的药物抑制可减轻主动脉钙化。图2）。与钙NIR研究结果类似，经LDN和ALK3-Fc处理的MGP^-/- 与溶剂处理的MGP小鼠相比，小鼠的钙染色（茜素红染色）减弱<.......

讨论

动脉钙化是人类心血管疾病的一个重要危险因素，可能直接促进心血管事件的发病机制。^1,5,52 在动脉粥样硬化病变的薄纤维帽中，内膜钙沉积被认为会增加局部生物力学应力，从而导致斑块破裂。^53,54 中膜钙化通过增加动脉僵硬度影响临床预后，进而可诱发心肌肥厚并影响心脏功能。⁵⁵ 因此，阐明血管钙化的分子机制将有助于深入理解人类疾病，并可能发现新的治疗靶点。

本文描述了一种利用近红外荧光（NIRF）成像技术在动脉粥样硬化和血管钙化的小鼠模型中检测主动脉钙化和巨噬细胞积聚的方法。⁹ 将NIRF探针准确地注射至尾静脉至关重要，该技术需要经过大量练习才能熟练掌握。⁵⁶ 此外，必须彻底清除主动脉周围的脂肪组织，因为这些脂肪可在与钙NIR和组织蛋白酶NIR信号相同波长处产生自发荧光信号。与传统的组织学方法相比，使用NIRF探针在评估血管钙化和炎症方面具有诸多重要优势。与常规组织学技术不同，这些探针可实现对整个主动脉钙化程度和巨噬细胞浸润的定量分析。此外，它们在检测主动脉钙化早期变化方面比组织.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 锥形管	Falcon	352096
30 G 针头	BD	305106
α-平滑肌肌动蛋白抗体	Sigma	SAB2500963
腔室载玻片	Nunc Lab-Tek	154461
胶原酶 2 型	Worthington	LS004176
地塞米松	Sigma	D4902
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life Technologies	11965-084
无钙杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144
弹性蛋白酶	Sigma	E1250
胎牛血清	Gibco	16000-044
精细镊子	Roboz	RS-4972
全弧带齿镊子	Roboz	RS-5138
甲醛（10%）	Electron Microscopy Sciences	15740
汉克平衡盐溶液	Gibco	14025-092
人冠状动脉平滑肌细胞	PromoCell	C-12511
带针胰岛素注射器	Terumo	SS30M2913
L-抗坏血酸	Sigma	A-7506
微型弹簧解剖剪刀（13 mm）	Roboz	RS-5676
微型弹簧解剖剪刀（3 mm）	Roboz	RS-5610
近红外荧光探针，组织蛋白酶（ProSense-750EX）	Perkin Elmer	NEV10001EX
近红外荧光探针，成骨（OsteoSense-680EX）	Perkin Elmer	NEV10020EX
生理盐水	Hospira	0409-4888-10
核固红	Sigma-Aldrich	N3020
Odyssey 成像系统	Li-Cor	Odyssey 3.0
青霉素/链霉素	Corning	30-001-CI
硝酸银（5%）	Ricca Chemical Company	6828-16
磷酸氢二钠七水合物	Sigma-Aldrich	S-9390
硫代硫酸钠	Sigma	S-1648
ß-甘油磷酸二钠盐水合物	Sigma	G9422
组织培养瓶，25 cm2	Falcon	353108
组织培养皿（35 mm × 10 mm）	Falcon	353001
六孔组织培养板	Falcon	353046
胰蛋白酶	Corning	25-053-CI
小动物固定管	Kent Scientific	RSTR551
真空驱动过滤系统	Millipore	SCGP00525