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血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症成像

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DOI：

10.3791/54017

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2016年5月31日

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1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

血管钙化是人类心血管疾病的重要预测因子和促成因素。本方案描述了诱导原代培养的血管平滑肌细胞发生钙化的方法，以及利用近红外荧光成像技术对动物主动脉中的钙化程度和巨噬细胞负荷进行定量分析的方法。

摘要

心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因。在冠状动脉、主动脉瓣、主动脉及外周传导动脉中，会形成由富含脂质的巨噬细胞和钙化组成的动脉粥样硬化斑块，这是心血管疾病的典型特征。在人类中，通过计算机断层扫描成像可对血管钙化进行定量；血管钙化的存在是未来心血管事件的强有力预测指标。开发心血管疾病的新疗法，关键在于加深对动脉粥样硬化潜在分子机制的理解。推进对动脉粥样硬化机制的认识依赖于小鼠模型和细胞模型。本文详细描述了一种利用两种光谱 distinct 的近红外荧光成像探针来成像主动脉钙化和巨噬细胞浸润的方法。近红外荧光成像可对整个主动脉中的钙化和巨噬细胞积聚进行离体（ex vivo）定量，有助于进一步理解动脉粥样硬化中炎症与钙化之间的机制关系。此外，还介绍了一种分离和培养动物主动脉血管平滑肌细胞的方法，以及一种诱导培养的平滑肌细胞钙化的方案，该方案适用于小鼠主动脉或人冠状动脉来源的细胞。这种体外（in vitro）血管钙化建模方法可用于识别和表征可能在血管疾病发展中起重要作用的信号通路，以期发现新的治疗靶点。

引言

心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因，其中包括美国，每年导致超过78万例死亡。1 冠状动脉钙化和主动脉钙化是动脉粥样硬化疾病的标志性特征，并可作为心血管事件的强有力预测指标。2-4 在成人中已报道两种主要类型的血管钙化：与动脉粥样硬化相关的内膜钙化，以及与慢性肾病和糖尿病相关的中膜（亦称Mönckeberg）钙化。5 内膜钙化发生在脂质积聚和巨噬细胞浸润血管壁的背景下。5,6 中膜钙化独立于内膜钙化发生，定位于弹性纤维或平滑肌细胞，且不伴随脂质沉积或巨噬细胞浸润。5,7,8 关于血管钙化分子机制的研究依赖于细胞实验和动物模型系统。用于动脉粥样硬化性钙化疾病的啮齿类动物模型包括载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠9,10或低密度脂蛋白受体（LDLR）缺陷小鼠11，并喂饲高脂饮食；而中膜钙化模型则包括基质Gla蛋白（MGP）缺陷小鼠12，或通过近乎全肾切除（五分之六肾切除模型）或喂饲高腺嘌呤饮食诱导尿毒症的大鼠。13

本文重点介绍与MGP缺乏相关的血管中膜钙化模型。MGP是一种细胞外蛋白，可抑制动脉钙化。12 在Keutel综合征患者中已发现MGP基因的突变，该综合征是一种罕见的人类疾病，其特征除短指骨、听力损失和外周肺动脉狭窄外，还包括弥漫性软骨钙化。14-18 尽管较少见，19 但在Keutel综合征中也已有报道出现多条动脉的同心圆状钙化。20 人类MGP基因的常见多态性与冠状动脉钙化风险增加相关，21-23 而循环中去羧基化、无生物学活性的MGP水平升高则可预测心血管死亡率。24 与Keutel综合征患者不同，MGP缺陷型小鼠会发展出严重的血管表型，表现为自出生两周起即出现广泛性自发性动脉钙化，并因主动脉破裂而在出生后6至8周内死亡。12

与ApoE不同-/- 和LDLR-/- 高脂饮食喂养的小鼠，其发生内膜血管钙化并伴有巨噬细胞诱导的炎症，MGP-/- 小鼠在无巨噬细胞浸润的情况下发生血管中膜钙化。11,25 尽管这些发现表明内膜钙化和中膜钙化存在不同的潜在刺激因素，但介导这两种钙化形式的信号通路机制存在重叠。26 已鉴定出多种参与血管钙化的信号通路，包括炎症介质如肿瘤坏死因子-α和IL-1，以及促成骨因子如Notch、Wnt和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路。27,28 这些信号通路可上调转录因子成骨细胞特异性转录因子2（Runx2）和osterix的表达，进而促进骨相关蛋白的表达例如、骨钙素、硬化素和碱性磷酸酶）在血管系统中介导钙化。28-30 我们及其他研究者已证实，ApoE缺失小鼠中观察到的血管钙化现象-/- 和LDLR-/- 高脂饮食喂养的小鼠以及MGP中观察到的自发性血管钙化-/- 小鼠的所有过程均依赖于骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，本文重点关注的正是这一通路。11,25,31 BMP 是成骨所必需的强效成骨因子，已知在人类动脉粥样硬化中其表达水平升高。32-34体外 研究表明，BMP信号通路参与调控成骨相关因子（如Runx2）的表达。35-37 BMP配体BMP-2的过表达可加速高脂饮食喂养的ApoE缺陷小鼠血管钙化的进展。38 此外，使用特定的BMP信号通路抑制剂，如LDN-193189（LDN）39,40 和/或 ALK3-Fc 可防止 LDLR 中血管钙化的发生-/- 高脂饮食喂养的小鼠和MGP缺陷型小鼠11,25

血管平滑肌细胞（VSMCs）在血管钙化的发展过程中起着关键作用。30,41,42 在MGP缺陷型小鼠中出现的中膜血管钙化，其特征是VSMCs向成骨表型转分化。MGP的缺失导致VSMC标志物（如肌细胞增强因子和α-平滑肌肌动蛋白）的表达下调，同时伴随成骨标志物（如Runx2和骨桥蛋白）的表达上调。这些变化与血管钙化的发生同步出现。25,43,44

小鼠主动脉钙化和炎症的评估通常采用组织化学技术，包括用于早期钙化和成骨活性检测的碱性磷酸酶活性分析，用于晚期钙化的冯科萨（von Kossa）染色和茜素红（Alizarin red）染色，以及靶向巨噬细胞蛋白标志物的免疫组织化学检测方案例如CD68、F4/80、Mac-1、Mac-2、Mac-39,45 然而，这些常规成像技术需要将主动脉组织加工成横截面，该过程耗时且因取样偏差而存在局限性，同时在对整个主动脉的炎症和钙化进行定量方面能力有限。本方案描述了一种利用近红外荧光（NIR）分子成像技术对整个主动脉及中等尺寸动脉的钙化和巨噬细胞积聚进行可视化和定量的方法。 离体 还提供了一种从小鼠主动脉分离和培养原代血管平滑肌细胞（VSMCs）的方法，以及诱导小鼠和人源血管平滑肌细胞钙化的方法。 体外 为了确定血管钙化的分子机制，这些技术为研究者提供了 体内 和 体外 研究动脉粥样硬化性钙化疾病的方法

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方案

所有涉及小鼠的研究均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。本研究中关于小鼠的饲养及所有操作程序均经麻省总医院机构动物护理和使用委员会（研究动物护理小组委员会）批准。所有操作均谨慎执行，以尽量减少动物痛苦。

1. 试剂的准备

  1. 全主动脉近红外荧光成像
    注意：一种双膦酸盐衍生的近红外荧光成像探针可通过结合羟基磷灰石来标记血管系统中的成骨活性。46,47 一种组织蛋白酶激活的荧光成像探针可作为血管系统中巨噬细胞蛋白水解和弹性蛋白水解活性的标志物。9 为了同时使用这两种荧光探针，重要的是选择光谱上互不重叠的探针。本文将使用“钙 NIR”表示特异性针对钙化的近红外荧光成像探针，使用“组织蛋白酶 NIR”表示特异性针对组织蛋白酶活性的近红外荧光成像探针。
    1. 配制钙 NIR 和组织蛋白酶 NIR 溶液。根据制造商说明书，向含有 24 nmol 钙 NIR 或组织蛋白酶 NIR 的小瓶中加入 1.2 ml 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻振荡混匀。
      注意：根据制造商说明，钙 NIR 和组织蛋白酶 NIR 溶液在用 PBS 重悬后，若在 2–8 °C 避光保存，可稳定保存 14 天。
  2. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离与钙化
    1. 主动脉消化液：
      1. 使用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）新鲜配制消化液（每根收获的主动脉使用约 3–5 ml），其中含 175 U/ml II 型胶原酶和 1.25 U/ml 弹性蛋白酶。使用 0.22 µm 真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌，并在使用前置于冰上保存。
    2. 细胞培养基：
      1. 在 500 ml 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。
    3. 钙化培养基：
      1. 钙化培养基 A（NaPhos；用于小鼠细胞系）：
        1. 根据需要在 100–500 ml DMEM 中添加 10% 胎牛血清、2 mM 磷酸钠、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。

          或
           
      2. 钙化培养基 B（βGP/Asc/DEX；可用于小鼠或人细胞系）：
        1. 根据需要在 100–500 ml DMEM 中添加 10% 胎牛血清、10 mM β-甘油磷酸二钠、50 µg/ml L-抗坏血酸、10 nM 地塞米松、100 单位/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素。使用前将培养基预热至 37 °C。

2. 尾静脉注射

  1. 尾部注射前，将小鼠置于温和的加热灯下预热5分钟。
  2. 将小鼠固定在管状啮齿类动物固定器中，用酒精棉片消毒尾部。
  3. 使用30 G针头进行尾静脉注射。尾静脉位于尾部两侧。
    1. 推进针头进入尾部时，对注射器施加轻微的前向压力。当注射阻力消失时，即表示已进入静脉。
    2. 以稳定速度注射100 µl钙NIR和/或100 µl组织蛋白酶NIR。注射结束后，暂停5秒，然后拔出针头。
  4. 注射后3–24小时采集主动脉（见第3节）。

3. 小鼠解剖

  1. 以200 mg/kg剂量经腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠。
  2. 将动物仰卧位固定于解剖板上，用胶带将每只足掌固定在板上。在解剖显微镜下用小剪刀从下腹部至胸腔上部沿正中线做一剪切切口。
  3. 用镊子掀开皮肤并去除腹膜，暴露腹腔器官。移除胃肠道器官时，注意不要横断主动脉。
  4. 在膈肌前部做一横向切口，并沿腹部继续延伸切口。使用解剖剪沿肋骨两侧剪断肋骨，并去除附着在胸骨上部的软组织，从而游离胸廓。移除胸廓，暴露肺脏。
  5. 最初将心脏保留在原位（以帮助识别和分离近端主动脉），并小心移除肺脏。仔细移除胸腺、气管和食管，确保主动脉保持完整。
  6. 使用直头精细镊子和显微解剖剪，从髂动脉分叉处至主动脉弓逐段去除主动脉周围的软组织，在清除主动脉周围脂肪时需格外小心图 1A）。去除主动脉弓大分支周围残留的脂肪和软组织（即，头臂干、颈总动脉和锁骨下动脉， 图1B).
    注意：在进行荧光成像时，去除主动脉周围的脂肪非常重要，因为脂肪会增加背景信号。
  7. 从胸腔中取出心脏，小心地将其从近端主动脉分离并弃去。在髂动脉分叉处横断远端主动脉。使用胰岛素针头从主动脉弓处向主动脉内注射生理盐水，以冲洗残留的血细胞。连同主动脉弓的分支血管一起剥离主动脉，将其完整地从体内移除。
  8. 将主动脉置于冰上的生理盐水中，直至准备成像。

4. 主动脉成像

  1. 成像主动脉 离体 收获后立即通过近红外荧光反射成像进行检测。25
    1. 将荧光成像仪设置为适当的多通道波长，以定量分析之前所述的经钙NIR和组织蛋白酶NIR注射小鼠主动脉中的荧光信号强度。25 根据制造商说明，钙 NIR 可被约 650–678 nm 的光激发，在约 680–700 nm 范围内产生最大发射；组织蛋白酶 NIR 可被约 745–750 nm 的光激发，在约 770 nm 处产生最大发射。

5. 小鼠主动脉血管平滑肌细胞的原代分离

  1. 按照上述说明执行步骤3.1-3.7。
  2. 将主动脉置于冷的HBSS中，直至解剖操作完成。仔细去除残留的主动脉周围脂肪和软组织，仅保留主动脉。
  3. 在无菌细胞培养超净台中，将主动脉转移至35 mm × 10 mm细胞培养皿中的主动脉消化液内。置于37 °C培养箱中孵育30分钟，期间轻轻间歇性摇动。消化完成后，主动脉呈现拉伸或松散状外观。
  4. 使用解剖显微镜和无菌镊子，去除主动脉外层的外膜，同时保持中膜完整。一种去除外膜的技术是在主动脉一端剥离其外层，然后像脱袜子一样将外层从下方的中膜上完整剥离并移除。
  5. 去除外膜层后，将剩余的主动脉放入盛有细胞培养基的新培养皿中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育保存。2 2-4 小时。
  6. 在无菌操作台内，使用无菌的3 mm显微解剖剪将主动脉切成1–2 mm宽的环状片段。
  7. 将这些组织环放入新的培养皿中，加入主动脉消化液，在37 °C下轻轻间歇摇动孵育120分钟。孵育期间，用移液器将溶液反复吹打数次，以重悬细胞。
  8. 向消化液中加入5 ml温热的细胞培养基，混匀后转移至15 ml锥形离心管中。
  9. 将试管在200 × g下离心5分钟。
  10. 吸弃培养基，并用所需体积的细胞培养液重悬细胞（例如，5 ml。
  11. 将每根主动脉分离得到的全部细胞接种至一个25 cm²培养瓶中2 细胞培养瓶，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2采用先前所述的标准技术进行细胞传代培养。25,48 在培养的最初7-10天内，每72-96小时更换一次培养基。当细胞接近汇合时，应更频繁地补充培养基（每48小时一次）。
    注意：培养出足够数量的细胞可能需要数周时间。
  12. 待细胞长满后，使用预热至37℃的胰蛋白酶消化传代细胞 °C.
    1. 向每个培养瓶中加入 0.5–1.0 ml 胰蛋白酶，孵育 3–5 分钟；根据需要每 30–60 秒轻轻敲击瓶壁，使细胞从瓶壁脱落。
    2. 待细胞从培养瓶底部脱落之后，向含有胰酶的细胞中加入10 ml细胞培养基。在200 × g条件下离心5分钟。吸除细胞沉淀中的培养基和胰酶。用所需体积的新鲜细胞培养基重悬细胞（例如，5-10 ml）转移至新的培养瓶（同时将部分细胞转移至腔室载玻片）。
  13. 在细胞首次传代时，采用标准免疫细胞化学技术确认平滑肌细胞谱系，方法如前所述。49 使用针对α-平滑肌肌动蛋白的抗体。

6. 诱导培养的平滑肌细胞钙化

  1. 将5.12中获得的细胞以每孔2.0 ml细胞培养基的总体积接种于6孔板中。注意：建议每孔起始细胞数量为1 × 105个。
  2. 将细胞在6孔板中于钙化培养基A或B中培养至少7天。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
  3. 每48小时更换一次细胞培养基。

7. 使用 von Kossa 染色法评估血管平滑肌细胞钙化

注意：冯科萨（von Kossa）法用于检测组织或培养细胞的细胞外基质钙化，其原理是利用银离子取代与磷酸盐结合的钙离子。50 在光照和有机化合物存在下，银离子被还原并以金属银的形式显色。未反应的银离子可通过硫代硫酸钠处理去除。50 冯科萨染色的实验步骤如下：

  1. 从细胞培养板中吸除培养基。
  2. 在室温下用 1 ml 10% 福尔马林固定细胞 20 分钟。
  3. 移除福尔马林，并用蒸馏水洗涤固定后的细胞 5 分钟。
  4. 将细胞置于 60–100 W 灯泡下，与 1 ml 5% 硝酸银溶液孵育 1–2 小时。
  5. 吸除硝酸银溶液，并用蒸馏水洗涤 5 分钟。
  6. 将细胞置于 1 ml 5% 硫代硫酸钠（w/v）水溶液中 5 分钟，以去除未反应的银。
  7. 用蒸馏水冲洗细胞 5 分钟，重复洗涤 3 次。此时 von Kossa 染色样本已可用于标准倒置光学显微镜成像。
  8. 可选步骤：用 1 ml 细胞核快红染液复染 5 分钟，随后用蒸馏水洗涤三次（每次 5 分钟）。

或者

8. 使用近红外荧光成像评估血管平滑肌细胞钙化

注意：与识别小鼠主动脉内的钙化类似，钙近红外染料（calcium NIR）可 readily 结合培养细胞沉积的钙化矿物质。利用该技术，可通过配备长波长滤光片的荧光显微镜和酶标仪对钙化进行成像和定量分析 体外 钙化。钙NIR的长波长发射特性允许同时使用发射波长较短的荧光染料来检测其他特征。钙NIR染色的实验步骤如下：

  1. 如第1.1.1节所述，向含有24 nmol钙NIR的小瓶中加入1.2 ml的1×PBS。
  2. 将钙NIR储备液用相应的钙化或对照培养基按1:100稀释。
  3. 吸弃培养板中的细胞培养基，并更换为含钙近红外染料的培养基。
  4. 将培养板置于含钙的NIR培养基中，37 °C过夜孵育。
  5. 吸弃孔板中的培养液，用 PBS 洗涤孔板一次。
    注意：此时可向孔中加入原始培养基，对细胞进行活体成像。否则，请继续执行以下步骤。
  6. 将细胞置于1 ml 10%福尔马林中，室温固定20分钟。
  7. 移除甲醛溶液，用蒸馏水洗涤固定后的细胞 5 分钟，重复洗涤 3 次。
  8. 可选步骤：对目标蛋白进行免疫荧光染色或其他复染。8,9
  9. 使用适当的荧光激发波长对钙离子近红外染料进行成像或检测（例如，钙离子NIR可被650-678 nm的光激发，并使用~680-700 nm的发射滤光片。

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结果

MGP中的主动脉钙化-/- 通过钙的近红外荧光成像检测野生型小鼠的钙化情况。在野生型小鼠的主动脉中未检测到钙的近红外荧光信号，表明无钙化现象。图2). 在MGP缺陷型小鼠的主动脉中检测到强烈的钙NIR信号，这与严重的血管钙化一致。来自野生型和MGP-/- 小鼠经茜素红染色25 (图 3A-B），证实了MGP缺陷小鼠存在广泛的血管钙化，而在野生型小鼠中未检测到钙化。为了确定MGP缺陷相关的血管钙化是否依赖于BMP信号通路，MGP-/- 小鼠从出生第1天开始接受LDN、ALK3-Fc或对照溶剂处理。在第27天注射钙NIR，次日取材主动脉。通过钙NIR检测发现，BMP信号通路的药物抑制可减轻主动脉钙化。图2）。与钙NIR研究结果类似，经LDN和ALK3-Fc处理的MGP-/- 与溶剂处理的MGP小鼠相比，小鼠的钙染色（茜素红染色）减弱<...

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讨论

动脉钙化是人类心血管疾病的一个重要危险因素，可能直接促进心血管事件的发病机制。1,5,52 在动脉粥样硬化病变的薄纤维帽中，内膜钙沉积被认为会增加局部生物力学应力，从而导致斑块破裂。53,54 中膜钙化通过增加动脉僵硬度影响临床预后，进而可诱发心肌肥厚并影响心脏功能。55 因此，阐明血管钙化的分子机制将有助于深入理解人类疾病，并可能发现新的治疗靶点。

本文描述了一种利用近红外荧光（NIRF）成像技术在动脉粥样硬化和血管钙化的小鼠模型中检测主动脉钙化和巨噬细胞积聚的方法。9 将NIRF探针准确地注射至尾静脉至关重要，该技术需要经过大量练习才能熟练掌握。56 此外，必须彻底清除主动脉周围的脂肪组织，因为这些脂肪可在与钙NIR和组织蛋白酶NIR信号相同波长处产生自发荧光信号。与传统的组织学方法相比，使用NIRF探针在评估血管钙化和炎症方面具有诸多重要优势。与常规组织学技术不同，这些探针可实现对整个主动脉钙化程度和巨噬细胞浸润的定量分析。此外，它们在检测主动脉钙化早期变化方面比组织...

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披露

麻省总医院已申请与BMP I型受体小分子抑制剂以及应用ALK3-Fc治疗动脉粥样硬化和血管钙化相关的专利，MD、PBY、KDB和RM可能享有专利使用费。

致谢

本工作得到了萨诺夫心血管研究基金会（MFB 和 TET）、霍华德·休斯医学研究所（TM）、哈佛医学院拉杜纪念奖学金（DKR）、亚琛工业大学医学院 START 计划（MD）、德国研究基金会（DE 1685/1-1，MD）、国立眼科研究所（R01EY022746，ESB）、勒杜克基金会（多学科项目：阐明骨形态发生蛋白信号在肺部及全身血管疾病发病机制中的作用，PBY、KDB 和 DBB）、国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（R01AR057374，PBY）、国立糖尿病与消化及肾脏疾病研究所（R01DK082971，KDB 和 DBB）、美国心脏协会研究员转教职人员奖 #11FTF7290032（RM）以及国立心肺血液研究所（R01HL114805 和 R01HL109506，EA；K08HL111210，RM）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 ml 锥形管Falcon352096
30 G 针头BD305106
α-平滑肌肌动蛋白抗体SigmaSAB2500963
腔室载玻片Nunc Lab-Tek154461
胶原酶 2 型 WorthingtonLS004176
地塞米松SigmaD4902
杜尔贝科改良伊格尔培养基Life Technologies11965-084
无钙杜尔贝科磷酸盐缓冲液Gibco14190-144
弹性蛋白酶SigmaE1250
胎牛血清Gibco16000-044
精细镊子RobozRS-4972
全弧带齿镊子RobozRS-5138
甲醛（10%）Electron Microscopy Sciences15740
汉克平衡盐溶液Gibco14025-092
人冠状动脉平滑肌细胞PromoCellC-12511
带针胰岛素注射器TerumoSS30M2913
L-抗坏血酸SigmaA-7506
微型弹簧解剖剪刀（13 mm）RobozRS-5676
微型弹簧解剖剪刀（3 mm）RobozRS-5610
近红外荧光探针，组织蛋白酶（ProSense-750EX）Perkin ElmerNEV10001EX
近红外荧光探针，成骨（OsteoSense-680EX）Perkin ElmerNEV10020EX
生理盐水Hospira0409-4888-10
核固红Sigma-AldrichN3020
Odyssey 成像系统Li-CorOdyssey 3.0
青霉素/链霉素Corning30-001-CI
硝酸银（5%）Ricca Chemical Company6828-16
磷酸氢二钠七水合物Sigma-AldrichS-9390
硫代硫酸钠SigmaS-1648
ß-甘油磷酸二钠盐水合物SigmaG9422
组织培养瓶，25 cm2Falcon353108
组织培养皿（35 mm × 10 mm）Falcon353001
六孔组织培养板Falcon353046
胰蛋白酶Corning25-053-CI
小动物固定管Kent ScientificRSTR551
真空驱动过滤系统MilliporeSCGP00525

参考文献

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