Summary
Denne protokol effektivt dirigerer muse embryonale stamceller afledt endelig endoderm til modne luftvejs-epitelceller. Denne differentiering teknik anvender 3-dimensionelle decellulariseret lunge stilladser til direkte lunge afstamning specifikation, i en defineret, serumfrit indstilling kultur.
Abstract
Lunge afstamning differentiering kræver integration af komplekse miljømæssige påvirkninger, der omfatter vækstfaktorsignalering, celle-celle-interaktioner og celle-matrix-interaktioner. På grund af denne kompleksitet, at sammenfatning af lunge udvikling in vitro fremme differentiering af stamceller til lungeepitelceller har været en udfordring. I denne protokol, er decellulariseret lunge stilladser anvendt til at efterligne den 3-dimensionelle miljø af lungen og generere stamcelle-afledte luftvejs-epitelceller. Muse embryonale stamceller først differentieres til endoderm afstamning under anvendelse af en embryoid legeme (EB) dyrkningsmetode med activin A. endoderm celler podes derefter på decellulariserede scaffolds og dyrket ved luft-væske-grænseflade i op til 21 dage. Denne teknik fremmer differentiering af sederede celler til funktionelt luftvejsepitelceller (cilierede celler, klub celler og basale celler) uden yderligere vækstfaktor tilskud. Denne opsætning kultur er defineret, Serum-fri, billig og reproducerbar. Selv om der er begrænset forurening fra ikke-lunge endoderm slægter i kultur, denne protokol kun genererer luftvejsepitelceller befolkninger og ikke giver anledning til alveolære epitelceller. Luftvejsepitel genereret med denne protokol kan bruges til at studere celle-matrix interaktioner under lunge organogenese og sygdom modellering eller lægemiddel-discovery platforme af luftvejs-relaterede patologier såsom cystisk fibrose.
Introduction
Rettet differentiering af pluripotente celler til lungen afstamning er afhængig af præcise signaleringsbegivenheder i mikromiljøet 1,2. På grund af den dynamiske natur af denne proces har det været en udfordring at efterligne de nøjagtige begivenheder af lunge organogenese in vitro. Nylige rapporter har brugt trinvise afstamning restriktionssteder strategier med opløselig vækstfaktor tilskud af todimensionale kulturer for at opnå lunge differentiering 3-8. I trinvise differentiering protokoller, pluripotente celler, uanset om embryonale stamceller (ESC) eller inducerede pluripotente stamceller, blev først differentieret til den endelige endoderm kim lag. Endodermale celler blev efterfølgende presset til en anterior endoderm skæbne og derefter til lunge progenitorceller, som identificeret ved ekspressionen af homeodomænet-holdige transcriptionsfaktor NKX2-1. Disse lunge forfædre blev yderligere differentieret til proksimal (luftvejene) eller distale (alveolære) lunge epitelceller with fortsat vækst faktor tilskud. Sådanne 2-dimensionelle strategier har haft en vis succes med at skabe lungeepitelceller, men der er flere begrænsninger, herunder uklare effektivitet, mulig forurening fra andre endodermale afstamninger, manglen på en 3-dimensional (3D) struktur, og i nogle tilfælde anvendelse af udefinerede kulturer med serum tilskud. Kultur af pluripotente eller differentierede celler på decellulariseret lunge stilladser stigende grad anvendes som et assay til at vurdere den regenerative potentiale sederede celler ved dannelse lungeepitelceller strukturer 3,5,6,8,9. Sådanne rapporter kultur seedede celler på stilladser med fortsat vækst faktor eller serum tilskud.
Lunge udvikling indebærer opdelingen, migration, genekspression og differentiering af individuelle celler som respons på miljømæssige signaler. Den ekstracellulær matrix (ECM) er et gitterværk af glycoproteiner, der ud over at tilvejebringe strukturel støtte, dirigerer tissue morfogenese ved at integrere og regulere disse processer 10,11. Ved at bruge lunge ECM stillads som en naturlig platform for endoderm kultur bedre efterligne in vivo lunge udviklingsmæssige miljø, har vi frembragt stamcelle-afledte luftvejs-epitelceller i en defineret 3D-kultur omgivelser med høj effektivitet og reproducerbarhed.
Rottelunge ECM scaffolds blev dannet ved decellularization samt muse ESC-afledte endodermale celler blev dannet og efterfølgende podet på disse scaffolds. Dobbelt ekspression af CXCR4 & c-kit-proteiner indikerer en definitiv endoderm celleidentitet og celler positive for både SOX2 & NKX2-1 ekspression er identificeret som luftvej (proksimal lunge) progenitorceller. Endelige endoderm celler blev dyrket ved luft væske-grænsefladen (ALI) i op til tre uger til at generere funktionelle luftvejsepitelceller in vitro.
Denne protokol fremmer lunge afstamning differentiering af definitive endoderm så tidligt som 7 dage, observeret med fremkomsten af NKX2-1 + / SOX2 + tidlige proksimale lunge stamfædre. Ved dag 14 og 21 i kultur modne luftvejsepitelceller cellepopulationer emerge herunder cilierede (TUBB4A +), klub (SCGB1A1 +), og basal (TRP63 +, KRT5 +) celler med morfologisk og funktionel lighed med native mus luftveje. Denne protokol viser betydningen af 3D-matrix mikromiljø for at opnå robust differentiering for luftvejsobstruktion epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Animal Care udvalgets retningslinjer Hospital for Sick Children Research Institute.
1. Stillads Forberedelse
- Decellularization af lunger
- Euthanize voksne Wistar-rotter under anvendelse af CO 2 kammer. Placer dyr i kammeret og start 100% CO2 eksponering ved et fyld på 10-30% af kammerets volumen per minut.
- Overhold dyr til bevidstløshed; dette vil forekomme efter ca. 2-3 min. Hvis bevidstløshed ikke forekommer i denne periode, tjek fyld sats og kammer segl. Efter bevidstløshed, observere dyr for falmede øjenfarve og manglende respiration. Hvis begge er observeret, vedligeholde CO2 fyld til 1-2 min og derefter fjerne dyret fra kammer til proceduren.
- Sikker dyr til dissekere overflade ved fastsættelse forpoterne og bagben, og spray ned brystet og maven område med 70% ethanol. Adgang til hjerte og lungs ved at åbne brysthulen under anvendelse af et lodret snit langs brystbenet.
- Gøre små snit gennem membranen først at forårsage lungerne til at trække, hvilket reducerer risikoen for punktering lungerne. Ligere inferior vena cava med en sutur og placere et lille snit i den venstre atrium med små dissekere saks.
- Ved hjælp af en forberedt 10 ml sprøjte med en 25 G nål fyldt med hepariniseret Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) (10 U / ml heparin i HBSS), starte lunge perfusion ved at indsætte kanylen i den højre ventrikel for at skubbe puffer gennem lungekredsløbet (på 2 ml / min). Fortsæt denne procedure, indtil lungerne bliver hvide, og væsken flyder fra venstre atrium er klart.
- Efter perfusion, eksponere luftrøret og Kanyler med en plast kateter nær skjoldbrusken og fastgør på plads med en sutur.
- Opsætning en tyngdekraft perfusionssystem ved at fastsætte en 10 ml sprøjte til en retort stå og klemme. Fjern og discard sprøjtedykkerstemplet. Fastgør den maksimale fyldning punkt på sprøjte tønde på 20 cm over lungerne. Vedhæfte en to-vejs stophane til enden af sprøjten, og en lang plastslange til den anden ende af stophanen til afgivelse decellularization løsning på den kanyle luftrøret. Hæld opløsningen i sprøjten og lad opløsningen for at fylde Attached plastslange og kateteret.
- Lavage lungerne ved at fylde til den samlede lungekapacitet (ca. 12 ml) i 1 min og fjerne plastic kateter fra luftrør for at tillade fluid at strømme ud af lungerne. Fyld ikke sprøjte mere end 10 ml, når lavaging lungerne til at holde trykket under 20 cm H 2 O.
- Gentag lavage af lungerne otte gange med decellularization opløsning efterfulgt af 10 skylninger med phosphatbufret saltvand (PBS).
- Dissekere luftrør og lunger fri fra halsen og brysthulen og fjerne fra dyret. Holde væv i koldt PBS ved 4 ° C indtil forberedelse til vibratome sectioning.
- Euthanize voksne Wistar-rotter under anvendelse af CO 2 kammer. Placer dyr i kammeret og start 100% CO2 eksponering ved et fyld på 10-30% af kammerets volumen per minut.
- Tyk sektion generation
- Forbered ca. 15 ml 2% og 4% (vægt / volumen) agarose, og nok 6% (w / v) agarose til indlejring alle lapper i små rektangulære blokke. agarose med lavt smeltepunkt pulver i PBS opløses ved mikrobølgeopvarmning. Overfør agarose til 50 ml rør på en varmeblok og opretholde temperaturer over 40 ° C for at undgå gelering.
- Dissekere decellulariseret lunge ved slutningen af hver lobar bronchus at frigøre hver lap (craniale, midten, tilbehør og caudale højre lapper og venstre lap) under anvendelse lille saks. Pat tør hver lap ved anvendelse af absorberende ark for at fjerne overskydende PBS og placere inside 2% (vægt / volumen) agarose mens det på varmeblokken.
- Fjern hver lap efter 5 min af belægning i agarose, placere i en petriskål og skal overfladen gel til 1 min på en kold plade.
- Anbring forsigtigt lapper tilbage til 4% (vægt / volumen) agarose, cool efter 5 min, og gentag coating gang mere med 6% (w / v) agarose.
- Efter sekventiel coating af hver lap, indkapsle hver lap separat i 6% (vægt / volumen) agarose ved brug af metal base-forme med mindst 3 mm agarose omgiver væv fra kanterne. Orient hver lap med pincet ved at placere lappen største flade kant ved overfladen af metal støber vender forsøgslederen. Denne kant vil være den side fastgjort til modellen plade for vibratome sektionering.
- Tillad blokke at gelere på kold plade i mindst 30 minutter før sektionering med vibratome. Store blokke i et fugtigt kammer i op til 12 timer ved 4 ° C før vibratome sektionering.
- Opsætning af vibratome ved at fylde sektionering kammer med kold PBS 12. Oprethold kold temperatur overalt sektionering med det omgivende isbad. Fjern blokke fra metal forme og bruge et barberblad til at skære ned overskydende agarose omkringliggende lapper, og samtidig holde ca. 3 mm fra kanten af vævet.
- Fastgør væv til midten af prøven plade ved hjælp lim, og nedsænke plade i than PBS-fyldte sektionering kammer. Opsætning sektionering grænser på vibratome ved at vælge følgende hastighed, amplitude, og tykkelse værdier henholdsvis: 0,2 mm / sek, 1,85 mm, og 350 um.
Bemærk: Både langsgående og tværgående sektioner af lap orientering er acceptable. - Afsnit hver lap fuldstændigt. Skæres manuelt sektioner gratis ved hjælp lille saks, hvis et afsnit ikke er helt adskilt ved kniven for enden af sektionen sekvens. Indsamle scaffold sektioner forsigtigt og opbevares i PBS på is, indtil det næste trin.
Bemærk: Sektioner genereret vil omfatte både de proximale og distale lunge områder og kan bruges til recellularization begge kilder; dog vil de fleste af overfladen omfatte distale lunge.
- Dekontaminering af stillads sektioner
- Overfør de 350 micron tykke stillads sektioner fra PBS til mikrocentrifugerør (op til 30 sektioner / rør) og behandle med nuklease (90 U / ml i PBS) (se liste over materialer) for 12 - 24 timer ved stuetemperatur, påen rotator.
- Efter nukleasebehandling, overleveringsstrækningerne ved anvendelse af pincetter til nye mikrocentrifugerør og behandle med antimikrobiel opløsning (200 U / ml penicillin streptomycin og 25 ug / ml amphotericin B i PBS) under sterile betingelser i 6 timer ved stuetemperatur, på en rotator.
Bemærk: Stilladser kan gemmes i antimikrobiel opløsning i op til en uge ved 4 ° C før brug. - Efter dekontaminering trin med antimikrobiel opløsning, skylles stilladser to gange med PBS under sterile betingelser og overføre til serum fri differentiering medier (SFDM) før podning med celler.
2. endodermal Cell Fremstilling
- Definitive endoderm induktion
- Vedligehold mus ESC linjer under feeder-fri, serum frie kultur ved hjælp 2i vilkår 13. Start endoderm induktion ved fjernelse celler fra vedhængende pluripotente kultur ved trypsinisering.
- Resuspender celler i SFDM og frø ved en densitet på 20.000celler / ml i lav adhærente plader til tre dage uden skift af medium for at tillade EB-dannelse.
- Efter tre dage forsigtigt overføre EB'er i 50 ml koniske rør under anvendelse af en 10 ml pipette og tillade dem at samles i bunden i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Omhyggeligt Aspirer medier og tilføjer frisk SFDM medier suppleret med 50 ng / ml activin A.
- Frøceller tilbage på lave adhærerende plader ved en 1: 2 densitet og kultur i yderligere tre dage for at opnå definitive endoderm differentiering.
- Endelig endoderm berigelse
- Saml dag 6 EB'er, dissociere med trypsin og mærke for c-KIT og CXCR4 udtryk ved hjælp konjugerede fluorescerende antistoffer 14.
- Sorter mærkede celler under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for ekspression af begge mærker til opnåelse af en beriget endelig endoderm befolkning 15.
3. Recellularization Setup
- Luft-væske-grænsefladesetup kultur
- Overfør hver decellulariseret stillads sektion (trin 1.2.9) fra SFDM på en hydrofob flydende membran (8 um porestørrelse) med sterile pincetter. Sørg stillads sektioner er jævnt fordelt på membran.
- Forbered 6- eller 12-brøndsplader ved at fylde brøndene med 1 eller 0,5 ml SFDM hhv. Anbring forsigtigt membraner i brønde, så membranen at flyde oven på medier, hvilket skaber en setup air-væskekultur.
- Podning af 3D stilladser
- Efter FACS for endelige endoderm markører (trin 2.2.2) tæller sorteret celler ved hjælp af et hæmocytometer, spin ned på 400 xg i 5 min og resuspender i SFDM. Resuspender celler til opnåelse af et volumen indeholdende cirka 100.000 celler / 10 pl / stillads.
- At recellularize stilladser, pipette 10 pi celler direkte på hver forberedt sektion fra trin 3.1.2.
- Erstat SFDM medier i kulturer hver 48 timer. Aspireres de gamle medier ved at holde pladen ved en lille hældningfor at undgå at forstyrre kulturen. Tilsæt langsomt frisk SFDM til kultur langs siden af brønden for at forhindre synkende af flydende membran.
- Oprethold værelser med flydende kulturer i op til 21 dage for at opnå differentiering af sederede celler i at modne luftvejsepitel.
Bemærk: Recellularized sektioner kan forarbejdes til vævsfarvning og immunofluorescens (IF) mikroskopi som helst tidspunkt under celledyrkning 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som skitseret i denne protokol, til robust differentiering af definitiv endoderm modne luftvejs epitelceller kan opnås ved hjælp af udvidet kultur af seedede celler på decellulariseret lunge stillads sektioner. Det anbefales, at decellulariserede stilladser karakteriseres for at sikre (1) værtsceller er helt fjernet, og (2) ekstracellulære matrixproteiner er bevaret inden anvendelse stilladser til differentiering. Decellularization kan vurderes ved anvendelse af væv farvning med hæmatoxylin og eosin (H & E) og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), som illustreret i figur 1A. Høj forstørrelse scanningselektronmikroskop (SEM) -analyse af stilladser bekræfter fraværet af værtsceller og intakte matrix arkitektur, som illustreret i figur 1B. Yderligere karakterisering af det resterende stillads ved trækprøvning og immunfarvning for matrixproteiner kan udføres for at sikre preservation af ECM følgende decellularization 16.
Ikke-adhærerende kultur af økonomiske og sociale råd i SFDM medier til seks dage resulterer i dannelsen af celleaggregater (EBS), som vist i figur 2A. Tre dage med activin A behandling resulterer i en endelig endoderm induktion. Lineage begrænsning af ESC til definitiv endoderm kan bekræftes ved opregulering og ekspressionen af endoderm afstamning-associerede gener og proteiner 17, og kan ikke gøres gældende morfologisk. Endoderm-induktion effektivitet varierer fra 50-70% afhængig af ESC linjen anvendes. Eksperimenter blev udført i mus ESC linier: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (dsRed -MST), og 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), mens alle data vist i dette manuskript bruger R1 celle linje. Den dobbelte positive CXCR4 + / c-KIT + endelig endoderm befolkning er frasorteret som illustreret i figur 2B, podetonto 3D lung scaffolds, og dyrket i op til 21 dage ved luft-væske-grænsefladen i SFDM. Det er vigtigt at sortere og berige for definitiv endoderm som begrænset organisation og differentiering opnås med dyrkning af usorterede celler fra heterogene dag 6 EB'er som illustreret i figur 2C. Strukturer dannet af sorterede celler på stilladserne minder om at udvikle lunge (embryonal dag 13,5) som vist i figur 2C-D. Det er vores erfaring, har en seeding tæthed på 100.000 sorteret celler / stillads gav den bedste stillads genoprettelse af bestanden.
Differentiering til lungerne afstamning er observeret så tidligt som 7 dage efter stillads kultur. Luftvejsepitelceller progenitorceller positive for NKX2-1 og SOX2 påvises ved anvendelse IF konfokal analyse som vist i figur 3A. SOX2 positive, NKX2-1 negative celler er sandsynlige pluripotente endodermale celler, som ikke har differentieret til lungerne lineage. Med længere kultur disse celler kan begynde at udtrykke NKX2-1 eller undergå apoptose uden tilstrækkelig støtte i mikromiljø. IF analyse af dag 21 kulturer afslører en moden luftvejs epithelial population indeholdende TUBB4A + cilierede celler, SCGB1A1 + klub celler, og TRP63 + / KRT5 + basale celler som vist i Figur 3B. SEM-analyse af overfladen af dag 21 kulturer afslører morfologisk lighed stamcelle-afledte kulturer til muse luftvejene.
Begge isolerede matrixproteiner (collagen I, collagen IV, fibronektin, laminin) og decellulariseret rotte nyre scaffolds var ude af stand til at fremme lunge-slægt differentiering når podet med endelig endoderm og dyrkes under de samme betingelser som beskrevet ovenfor 16. Dette viser, at 3D mikromiljø skabt af lunge-afledte scaffolds adskiller sig fra nyre-afledte scaffolds i sin evne til at fremme lunge-slægt differentiering af seeded endodermale celler.
Figur 1. Decellularization teknik fjerner cellulære komponenter og bevarer ECM. (A) H & E (top panel) og DAPI (nedre panel) farvning af naturlige og decellulariseret lungevæv viser fraværet af kerner efter decellularization. Right panel viser eksempler på vævssnit fra lungerne uden optimal decellularization. Pilespidser viser resterende kerner på stilladser på grund af ufuldstændig decellularization, fremhæver betydningen af at optimere teknik før recellularization. Scale bar = 25 um. (B) SEM billeder af naturlige og decellulariseret lunge, der viser fravær af celler og bevarelse af matrixarkitektur på decellulariserede stilladser. Scale bar = 10 um. Klik herfor at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sorteret ESC-afledte endelige endoderm resultater i optimal recellularization. (A) Dag 6 embryoide organer (EBS) efter tre dages activin En behandling for at fremme en endelig endoderm differentiering. (B) EBS er ordnet efter FACS til dual udtryk for overflademarkører CXCR4 og c-KIT til at isolere den endelige endoderm befolkning. Denne population vil blive podet på decellulariserede stilladser. (C) H & E farvning af recellularized stilladser på dag 7 og dag 21 i kultur. Venstre panel repræsenterer organiseret, luftvejs-lignende strukturer efter podning med sorterede celler og højre panel repræsenterer uorganiseret, stærkt proliferative usorterede celler på stilladserne fremhæver betydningen af sortering af celler før recellularization. Scalebar = 30 um. (D) H & E farvning af embryonale dag 13,5 mus lunger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Udvidet kultur endelig endoderm på naturlige lunge stilladser dirigerer differentiering for luftvejsobstruktion epitelceller. (A) proksimal lunge stamceller (NKX2-1 + / SOX2 +) detekteres efter syv dages dyrkning på decellulariserede stilladser. Scale bar = 15 um. (B) venstre billede viser modne pseudostratified epitelial celle (CDH1 +) strukturer foret med kælder membranprotein laminin på den basale side af strukturer. Center og højre billede viser modne luftvejsepitel komplet med cilierede celler (TUBB4A +), CluB-celler (SCGB1A1 +) og basale celler (KRT5 + / TRP63 +). Venstre billede skala bar = 30 um; center og højre billede skala bar = 15 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne protokol genererer modne ESC-afledte luftvejsepitel kun bruger naturlige lunge stilladser til direkte differentiering uden anden tilskud. Denne opsætning kultur er defineret, serumfrit, billig og reproducerbar. Ingen vækst faktor tilskud af basen differentiering medier er påkrævet. Tidligere offentliggjorte metoder til at generere stamcelle-afledte lungeepitelceller har anvendt 2-dimensionelle strategier med vækstfaktor tilskud til fremme af afstamning begrænsning 3,4,8,18,19. Den her beskrevne teknik er fordelagtig i løbet af disse metoder til flere grunde, herunder: definerede dyrkningsbetingelser, høj differentiering effektivitet til funktionelle luftvejs celler, begrænset forurening fra andre endodermale slægter (skjoldbruskkirtel, lever, bugspytkirtel), og en 3D-differentiering microenvironment. Denne teknik giver lignende resultater med muse-afledt ECM og kan derfor ændres for at generere decellulariserede scaffolds ved anvendelse muselunger. Rat-afledte økonomiske og sociale råd differentieret til definitiv endoderm og podet på stilladser ved hjælp af denne protokol også differentiere til luftvejs epitel.
Decellulariserede stilladser kan opbevares i dekontaminering opløsning ved 4 ° C i op til 7 dage før recellularization. Stilladser holdt til længere varigheder kan være funktionel, men vi har ikke testet for at bekræfte dette. For at opnå en effektiv organisation og differentiering det er nødvendigt at berige for definitiv endoderm ved FACS efter induktion med activin A. Ikke-endoderm celler i dag 6 EB'er ofte udtrykker pluripotens markør Oct4, og hvis podet på stilladser vil fortsætte med at formere sig uden organisation og specifikation til lunge afstamning. Den såning tæthed kan også justeres på grundlag af cellelinje-specificitet at opnå fuldstændig recellularization af stilladser.
En begrænsning af denne protokol er i sin manglende evne til at fremme differentiering til alveolære epitelceller. selvom NKX2-1 + / Sox9 + distale stamceller opdages efter syv dages kultur på stilladser, denne population er ikke til stede på dag 14 og dag 21. Markører for moden type I alveolære epitelceller (AQP5) og type II alveolære epitelceller (SFTPB, SFTPC) registreres ikke på noget tidspunkt i løbet af stillads kultur. Dette kan skyldes et krav om yderligere vækstfaktor tilskud og submerse dyrkningsbetingelser til at fremme alveolær afstamning specifikation, mens som beskrevet her, matrixproteiner og resterende matrix-bundne vækstfaktorer på decellulariserede scaffolds er tilstrækkelige til at fremme luftvejene afstamning differentiering.
Det kritiske skridt for at fremme differentiering af definitiv endoderm for luftvejsobstruktion epitelceller hjælp lunge stilladser er optimering af decellularization processen. Cellulære komponenter skal fjernes helt, mens matrixkomponenter bevares. Tissue farvning for nukleart materiale ved hjælp af DAPI, ultra-structkan anvendes ural analyse af stilladser med scanning og transmissionselektronmikroskopi, og DNA-assays for at bekræfte fjernelse af alle cellulære bestanddele. ECM proteinsammensætning af stilladser kan vurderes ved anvendelse IF farvning og immunoblot analyse for matrixproteiner: kollagen I, kollagen IV, elastin, fibronectin, heparin sulfat proteoglycaner og laminin 16.
Disse stamcelle-afledt lunge epitel kan anvendes i sygdomsmodeller og lægemiddel-discovery platforme af luftvejs-relaterede patologier, såsom cystisk fibrose. Potentialet af disse celle-matrix konstruktioner i regenerative applikationer såsom vævsreparation og celleterapi kan undersøges ved in vivo transplantation af gensplejsede konstruktioner i forskellige musemodeller. Endvidere kan denne 3D In vitro fremgangsmåde til luftvejene differentiering let tilpasses til at studere forskellige parametre der foretager lunge afstamning specifikation ved at manipulere vækstfaktor tilgængelighed og celle-matrix-signaleringaf kulturer under forskellige stadier af differentiering på stilladser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende økonomiske interesser at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Rossant og Dr. Bilodeau for Nkx2-1 mcherry ESC anvendes til forsøg er afbildet i figur 1-3. FACS blev udført i The SickKids-UHN flowcytometri Facility. Dette arbejde blev støttet af driftstilskud fra de canadiske Institutes for Health Research og en infrastruktur tilskud (CSCCD) fra den canadiske Foundation of Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
