延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

摘要

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内 在单细胞分辨率下。

摘要

在肿瘤微环境中，宿主间质细胞与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤进展、血管生成、肿瘤细胞播散及转移。肿瘤微环境中的多细胞相互作用可导致一些短暂性事件的发生，包括肿瘤细胞的定向运动和血管通透性变化。以往对肿瘤血管通透性的定量研究常依赖终点实验来测量血管染料的外渗情况。然而，由于多细胞相互作用和血管通透性具有短暂性，这些动态事件的动力学过程难以通过终点实验揭示。通过使用可注射染料或荧光蛋白标记细胞和血管系统，高分辨率的时间延时活体显微成像技术实现了对肿瘤微环境中瞬时事件的直接、实时可视化观察。本文介绍一种利用多光子显微镜在活体小鼠中进行长时间活体成像的方法，以直接观察肿瘤微环境中的多细胞动态过程。该方法详细描述了细胞标记策略、乳腺皮瓣的手术制备、经尾静脉导管注射可注射染料或蛋白的操作，以及时间延时图像的采集过程。通过该方法获得的时间延时序列有助于可视化并定量分析肿瘤微环境中细胞运动和血管通透性等细胞事件的动力学特征。

引言

研究表明，肿瘤细胞从原发性乳腺肿瘤的扩散不仅涉及肿瘤细胞本身，还包括宿主的间质细胞，如巨噬细胞和内皮细胞。此外，肿瘤血管结构异常，通透性增加¹。因此，明确肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞如何相互作用，从而介导原发性肿瘤微环境中血管通透性和肿瘤细胞内渗，对于理解转移过程具有重要意义。阐明肿瘤微环境中血管通透性、肿瘤细胞内渗的动力学特征以及多细胞相互作用的潜在信号机制，可为抗癌疗法的研发与应用提供关键信息。

研究肿瘤血管通透性的主要方法 体内 一直是通过测量伊文思蓝等血管外染料来实现的²高分子量葡聚糖（155 kDa）³ 以及荧光团或放射性示踪剂偶联的蛋白质（包括白蛋白）⁴ 在染料注射后的固定时间点进行观察。显微镜技术、动物模型和荧光染料的进步使得通过活体显微成像技术在活体动物中可视化细胞过程和血管通透性成为可能。⁵.

通过获取静态图像或在多个时间点进行短时间延时成像，无法全面理解肿瘤微环境中发生的动态事件^6,7。事实上，尽管在24小时过程中采集的静态图像显示肿瘤血管具有通透性，但并未观察到血管通透性的动态变化过程⁶。因此，长达12小时的连续延时成像能够捕捉肿瘤微环境中动态事件的动力学特征。

本方案描述了....

方案

所述所有操作必须遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并须事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 生成荧光标记的肿瘤和肿瘤相关巨噬细胞

1. 通过将小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列驱动多瘤病毒中T抗原表达的自发性、同源性、基因工程小鼠乳腺癌模型（MMTV-PyMT）与携带荧光报告基因的转基因小鼠杂交，获得荧光标记的肿瘤细胞即， 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、增强型青色荧光蛋白（ECFP）或 Dendra2^8,9.
2. 通过将遗传工程小鼠模型与髓系和巨噬细胞特异性荧光报告系统杂交，在PyMT动物中用荧光标记的肿瘤细胞对巨噬细胞进行荧光标记即， MacGreen¹⁵ 或 MacBlue 小鼠 Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP¹⁶] .
3. 或者，通过原位移植荧光标记的PyMT肿瘤细胞（同源移植）、人乳腺癌细胞系或来源于患者的原发性人肿瘤组织（异种移植）来生成荧光标记的肿瘤^11,17.
   1. 将荧光标记的PyMT肿瘤细胞植入带有荧光蛋白标记髓系细胞的同系小鼠体内，以构建肿瘤细胞和髓系细胞均带有荧光标记的动物模型¹³.
4. 在活体成像开始前2小时，通过静脉尾静脉注射将100 µl浓度为10 mg/kg的荧光标记7....

结果

延长的活体延时显微技术能够以单细胞分辨率对肿瘤微环境中的多细胞过程进行成像。通过荧光标记肿瘤细胞、巨噬细胞、血管腔隙，并利用二次谐波信号成像胶原纤维网络，可在成像过程中同时追踪肿瘤微环境中的多个区室。表达荧光蛋白的肿瘤细胞可在转基因小鼠中构建，例如在 MMTV-PyMT-Dendra2 小鼠中，乳腺肿瘤细胞被标记为 Dendra2（图 1A）。通过将这些转基因小鼠与 Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP 小鼠杂交，后者巨噬细胞被标记为 ECFP，从而在 MMTV-PyMT 小鼠中实现肿瘤细胞和巨噬细胞的同时标记。采用肿瘤细胞与巨噬细胞双重标记策略，可实时可视化观察两种细胞类型的直接相互作用（图 1A）。此外，也可使用转导了 GFP 的人乳腺癌细胞系或患者来源的肿瘤细胞来标记肿瘤细胞。巨噬细胞可通过荧光标记的 70 kDa 右旋糖酐进行标记，该分子可富集于吞噬性巨噬细胞中（图 1B）。这些方法推动了对动态多细胞事件的研究，例如肿瘤细胞-巨噬细胞协.......

讨论

肿瘤微环境中自发发生的细胞相互作用可导致肿瘤细胞运动性及内渗行为的改变。对活体肿瘤组织进行高分辨率活体成像，能够可视化呈现那些具有高度瞬时性的多细胞动态过程^10,13,24终点 体内 离散时间点获取的检测数据或延时成像图像可提供有关肿瘤微环境中分子机制的关键信息。活体成像研究已被用于观察肿瘤微环境中持续数天的生物学过程，为血管生成、肿瘤细胞迁移以及对药物治疗的反应等提供了新的认识。^25-30然而，由于所研究过程的时间尺度限制，这些检测方法可能无法捕捉肿瘤微环境中瞬时事件的动力学特征^7,31区分多个瞬时事件与恒定过程是活体显微镜的一大显著优势。

本方案中描述的活体成像技术可通过荧光标记多种细胞谱系和结构，直接观察肿瘤微环境中的细胞动态。相较于单光子共聚焦显微镜，多光子显微镜能够实现更深层的成像，常规成像深度可达300 µm²⁴。以2 µm为步进、采集50 - 100 µm的Z轴序列图像，其分辨率足以对细胞间的相互作用（包括细胞相互延伸时形成的突起）以及肿瘤微环境中的血管结构进行三.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
155 kDa 葡聚糖-四甲基罗丹明异硫氰酸酯	Sigma Aldrich	T1287	用 1×PBS 以 20 mg/ml 浓度重悬
70 kDa 葡聚糖-德克萨斯红	Life Technologies	D-1830	用 1×PBS 以 10 mg/ml 浓度重悬
10 kDa 葡聚糖-异硫氰酸荧光素	Sigma Aldrich	FD10S	用 1×PBS 以 20 mg/ml 浓度重悬
Qdot 705 ITK 氨基（PEG）量子点	Life Technologies	Q21561MP	取 25 μl 稀释至 175 μl 1×PBS 中用于注射
MMTV-PyMT 小鼠	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP 小鼠（Csf1r-Gal4/VP16, UAS-ECFP）	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP 小鼠	Jackson Laboratory	18549
1×PBS	Life Technologies
异氟烷（Isoethesia）	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
氧气	AirTech
1 ml 注射器，结核菌素滑动针头	BD	309659
30 G × 1（0.3 mm × 25 mm）针头	BD	305128
聚乙烯医用微管	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	内径 0.28 mm，外径 0.64 mm
显微镜盖玻片	Corning	2980-225	厚度 1.5，22 × 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT 脉搏血氧仪、软件及传感器	Kent Scientific
实验室胶带	Fisher Scientific	159015R
软橡胶垫	McMaster-Carr	8514K62	超软聚氨酯薄膜，厚度 3/16”，12" × 12"，40 Oo 邵氏硬度，平面背衬
硬橡胶垫	McMaster-Carr	8568K615	高强度氯丁橡胶板，厚度 1/4"，12" × 12"，50 A 邵氏硬度
显微镜	Olympus		该显微镜为基于 Olympus IX-71 支架定制的双激光多光子显微镜，配备 20× 1.05 NA 物镜。
7 孔打孔器套装	McMaster-Carr	3429A12	孔径范围 1/4" 至 1"，适用于锤击式打孔