Summary
Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.
Introduction
Divulgação de células tumorais a partir do tumor mamário primário tem sido demonstrado que envolvem as células de tumor não apenas, mas células hospedeiras estromais incluindo macrófagos e células endoteliais. Além disso, a vasculatura tumoral é anormal, com um aumento da permeabilidade. Assim, determinar como células tumorais, macrófagos e células endoteliais interagem para mediar a permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral no microambiente do tumor primário é importante para a metástase compreensão. Compreendendo a cinética da permeabilidade vascular, intravasamento de células tumorais e o mecanismo de sinalização subjacente de interacções multicelulares no microambiente tumoral pode fornecer a informação crucial no desenvolvimento e administração de terapias anti-cancerosas.
O principal meio de estudar a permeabilidade vascular do tumor in vivo tem sido a medição de corantes extravasculares, tais como azul de Evans 2, dextranos de elevado peso molecular (155 kDa)3 e fluoróforo ou proteínas radiofármaco-conjugados (incluindo a albumina) 4 em pontos fixos de tempo após a injecção do corante. Avanços na microscopia, modelos animais e corantes fluorescentes permitiram a visualização de processos celulares e permeabilidade vascular em animais vivos por meio de microscopia intravital 5.
Imaging animal vivo com a aquisição de imagens estáticas, ou sequências de curto lapso de tempo ao longo de vários pontos de tempo não permite a compreensão completa dos eventos dinâmicos no microambiente do tumor 6,7. De facto, a aquisição de imagem estática ao longo de 24 horas demonstraram que a vasculatura tumoral é permeável, no entanto, a dinâmica da permeabilidade vascular não foi observada 6. Assim, estendido de imagem contínua de lapso de tempo de até 12 horas capta a cinética de eventos dinâmicos no microambiente do tumor.
Este protocolo descreve o uso de estendido multiphot time-lapseem microscopia intravital para estudar eventos multicelulares dinâmicos no microambiente tumoral. Vários tipos de células no microambiente do tumor são marcadas com corantes injectáveis ou usando animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes. Utilizando um cateter na veia da cauda corantes vasculares ou proteínas pode ser injectado após o início da imagiologia para adquirir dados de cinética de eventos multicelulares no microambiente tumoral. Para imagens de células vivas do tumor mamário é exposto através da preparação cirúrgica de um retalho de pele. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipado com múltiplos tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores 8. Ao usar filtros apropriados, um algoritmo de subtracção possibilita 4 detectores PMT para adquirir sinais fluorescentes 5 no microambiente tumoral, simultaneamente 9. microscopia de alta resolução multiphoton intravital captura de imagem resolução única célula de interações tumor-estroma no microambiente tumoral, levando a uma melhor understanding da permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral 10-13. Especificamente, imagiologia intravital reveladas altamente localizadas transientes, eventos de permeabilidade vascular estendidos que ocorrem selectivamente em locais de interacção entre uma célula tumoral, um macrófago e uma célula endotelial (definido como o microambiente do tumor de metástase, TMEM 14) 13. Além disso, intravasation células tumorais ocorre apenas em TMEM e é espacialmente e temporalmente correlacionada com a permeabilidade vascular 13. resolução única célula da dinâmica destes eventos foi possível através do uso de microscopia multiphoton lapso de tempo prolongado de células com marcação fluorescente no microambiente tumoral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia do Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use.
1. Geração de fluorescência Tumores marcados e macrófagos associados a tumores
- Gerar células tumorais com marcação fluorescente, atravessando o autóctone rato geneticamente modelo espontânea, mamária câncer de onde o mouse mamária vírus do tumor repetição terminal longa impulsiona o antígeno polioma meio T (MMTV-PyMT) com camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes [isto é, reforçada verde fluorescente proteínas (EGFP), reforçada proteína ciano fluorescente (ECFP) ou Dendra2] 8,9.
- Macrófagos etiqueta fluorescente em animais PyMT com fluorescente etiquetado células tumorais através do cruzamento modelos de ratos geneticamente modificadas com repórteres fluorescentes específicos myeloid- e macrófago [ie, MacGreen 15 ou ratos MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativamente, geram fluorescente etiquetado tumores através de transplante ortotópico de células tumorais com marcação fluorescente PyMT (sing�icos), linhas celulares de cancro da mama humano ou tumores paciente humano derivados primários (xenoenxertos) 11,17.
- Implante marcado por fluorescência de células tumorais em ratinhos singeneicos PyMT com células mielóides marcado com proteínas fluorescentes para gerar animais com células tumorais marcado por fluorescência e as células mielóides 13.
- Injectar 100 ul de 10 mg / kg fluorescente 70 kDa dextrano por via intravenosa (iv) na veia da cauda em ratinhos imunodeficiência combinada grave (SCID) com tumores de xenoenxerto de linhas de células humanas ou tumores primários derivados de paciente para macrófagos etiqueta fluorescente 2 h antes do início de imagens intravital.
2. Setup microscópio e Imagem Preparação
Nota: Este procedimento descreve o set-uppara geração de imagens intravital em um microscópio multiphoton 8.
- Ligue todos os componentes do microscópio e laser, incluindo lasers de dois fótons e os detectores.
- Ligue a caixa de aquecimento a 30 ° C, para pré-aquecer o estágio. Este passo é essencial para manter a temperatura fisiológica do animal.
- Para uso em um local microscópio invertido a inserção estágio feito por encomenda no palco microscópio. O acessório personalizado é uma folha de 1/8 "de espessura de alumínio usinado para caber no espaço fase de inserção e com um diâmetro 1" através de buracos no centro para a imagem latente.
- Limpe a platina do microscópio e inserção fase com 70% de etanol e seca ao ar.
- Coloque uma grande queda de água no 20X, 1,05 NA objetivo microscópio para manter contato óptico com a tampa de vidro.
- tampa de vidro Place (# 1.5 espessura) sobre o porto de imagem na inserção palco microscópio. Fixe no lugar com fita laboratório.
- Use um furador para perfurar de 2 cm x 2 cm, buraconuma almofada de borracha flexível e colocar a almofada de borracha sobre a platina do microscópio, com o furo no bloco alinhado com o orifício na inserção fase costume.
3. Preparação de cauda veia cateter e Reagentes para injecção durante o exame
- Cortar um comprimento de 30 cm de tubagem de polietileno (PE).
- Utilizando uma pinça, mover a agulha de metal de uma agulha G 31 e para trás até que ele quebra da montagem de plástico.
- Usando pinças, inserir a extremidade cega da agulha individual para o tubo de PE.
- Inserir uma agulha G 31 na outra extremidade do tubo de PE.
- Encha uma seringa de 1 cc com fosfato de solução salina estéril tamponada (PBS) e inseri-lo na agulha G 31 e liberar todo o ar para fora do tubo e agulha com PBS. PBS é utilizado para manter a hidratação e a osmolaridade do sangue 9,18, também pode ser usado solução salina isotónica no entanto.
- Encha uma seringa de 1 cc com 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrano-tetrametilrodamina (TMR) Ou pontos quânticos para a rotulagem vascular.
- Preparar todas as outras proteínas de injectáveis, tal como uma isoforma de 165 amino ácido de crescimento endotelial vascular, factor de A (VEGFA 165) numa seringa de 1 cc e colocar em gelo. Injectar 0,2 mg / kg 165 19 VEGFA a uma concentração de 0,05 mg / ml.
4. Inserção da cauda Indwelling Vein Cateter
- Colocar o animal sob anestesia utilizando uma câmara de indução com 5% de isoflurano com O2 como gás de transporte.
- Transferir o mouse para a plataforma cirúrgica, uma vez que está totalmente anestesiado e não responde a uma pitada dedo do pé.
- Abrir linha anestesia com isoflurano para a plataforma cirúrgica, fechar a linha de anestesia para a câmara de indução e colocar o cone do nariz ao longo do focinho do animal. Reduzir o isoflurano de 5% a 2,5%.
- Aplicar pomada oftálmica para os olhos do mouse para prevenir o ressecamento durante a anestesia.
- Aqueça o animal sob a lâmpada de aquecimentodurante mais 2 min para aumentar a circulação na cauda como a circulação diminui com anestesia profunda.
- Esterilizar a veia da cauda do rato com etanol a 70%.
- Inserir a ponta da agulha de 31 G a partir do cateter construído na secção 3 para dentro da veia lateral da cauda do animal e empurrar a agulha em 2-3 mm.
- Puxar para trás sobre a seringa para ver sangue, assegurando o cateter é colocado na veia da cauda.
- Usar um comprimento de 1 cm de fita de laboratório colocada sobre a agulha para manter a agulha no lugar paralelo à veia ao longo do comprimento da cauda.
5. Pele Flap Procedimento cirúrgico para expor o tumor mamário
- Com o animal na plataforma cirúrgica pincelar o tumor e a superfície ventral, com 70% de etanol. Nota: Como descrito, este procedimento não é realizado completamente assepticamente. Para as sessões de imagem longas onde a infecção pode se tornar um fator de confusão, é recomendado o uso de uma técnica asséptica adequada.
- usando Sterile fórceps, levantar a pele ventral com tesouras e estéreis fazer uma incisão subcutânea ao longo da linha média ventral, aproximadamente 1 cm de comprimento. Evitar a perfuração do peritoneu durante a incisão.
- Suavemente cortar o tecido conjuntivo fixação da glândula mamaria e do tumor para longe do peritoneu para expor o tumor mamário.
- Usando fórceps e tesouras, remover suavemente e cortar a fáscia e gordura a partir da superfície exposta do tumor enquanto se mantém a integridade da vasculatura do tumor e minimizar o sangramento. Este passo é crítico na manutenção da arquitectura do tumor e vasculatura fornecimento do tumor.
6. Preparação animal de Microscopia
- Transferir o animal para o estágio de imagem pré-aquecido com o tumor exposto colocado sobre a lamela na fase de inserção através da objectiva de microscópio para imagiologia. Tomar cuidado para transferir o cateter na veia da cauda suavemente com o animal, de modo a não deslocar a agulha.
- º lugare anestesia nariz cone sobre o focinho do animal para manter o conjunto de anestesia para 3% isoflurano.
- Posicione o animal para que o tumor repousa no buraco da almofada de borracha e faz contato com a lamela de vidro.
- Use duas almofadas de borracha para segurar delicadamente o tumor no lugar e corrigi-los para o palco microscópio com fita laboratório para reduzir o movimento durante a aquisição de imagem.
- Encha a câmara da almofada de borracha com PBS para manter o tecido hidratado e manter contato óptico com a lamela.
- Começar a monitorar os sinais vitais do animal com uma sonda de oxímetro de pulso. Anexar um sensor de clipe para a coxa do animal. Alternativamente, um colar que é configurado para se ajustar em torno do pescoço pode ser utilizado.
- Coloque a caixa de aquecimento sobre o animal para manter 30 ° C 20.
- Lentamente reduzir o nível de isoflurano para 0,5-1% para manutenção da anestesia e manter o fluxo de sangue.
7. Aquisição de Imagem e injeção de fluoresent Corantes e Proteínas injectáveis
- Utilizando o microscópio de focagem ocular sobre as células tumorais fluorescentes sobre a superfície do tumor.
- Selecione uma área de interesse por encontrar áreas com fluxo vasos sanguíneos. A selecção de uma área de interesse, com fluxo vasos sanguíneos é essencial para avaliar a vasculatura tumoral.
- Uma vez que uma região de interesse tiver sido seleccionado alternar o microscópio no modo de imagiologia multifotônica.
- Definir os limites superior e inferior de uma série z. Defina o limite superior da série z usando o ajustador de foco para mover o objetivo para o local de início desejada e clicando no botão posição Z "Top". Determinar o limite superior do Z-série através da visualização da rede de fibras de colagénio na superfície do tumor no canal de segunda geração harmónica (SHG) e observando-se quando não há células, mas apenas as fibras de colagénio são visíveis.
- Definir o limite inferior da série Z movendo o objectivo para a profundidade desejada de imagem (Typically 50 - 150 mm) e clicando no botão posição Z "Bottom".
- Defina o tamanho do passo digitando o valor desejado no campo de tamanho do passo. Determinar o tamanho do passo com base em considerações de resolução e tempo de aquisição (normalmente 2 mm é utilizado para reconstrução 3D de alta resolução e 5 mm de outra forma).
- Defina o intervalo de time-lapse, alternando para o painel de Time-Lapse e inserindo o lapso de tempo desejado no campo Time-Lapse. Para resolução temporal ideal definido o intervalo de tempo de 0 segundos para imagiologia contínua. Nota: Para longa de imagem time-lapse é recomendado para definir o intervalo de tempo para 10 seg entre as aquisições para repor o líquido de imersão objectivo.
- Uma vez que os parâmetros de imagiologia têm sido determinado, injectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR.
- Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 155 kDa dextrano-TMR tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas no line.
- Lentamente injetar 155 kDa dextrano-TMR para o rato, com um volume máximo de 200 mL, e substituir a seringa com seringa contendo PBS. Passo crítico: Executar a injeção devagar e tomar as devidas precauções para evitar solução fora da veia.
- Comece a aquisição do Z-stack imagens de lapso de tempo, clicando nos botões de lapso de tempo Z-Stack e para deprimir-los e, em seguida, clicar no botão de gravação.
- Se outros dextranos fluorescentes, ou seja, isotiocianato de 10 kDa dextrano-fluoresceína (ITCF), ou proteínas, ou seja, VEGFA 165, foram preparados com antecedência, injetá-las após o início da aquisição da imagem para a = 0 min início.
- Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 10 kDa dextrano-FITC ou VEGFA 165 tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas na linha.
- Lentamente injetar injetáveis no rato através do cateter na veia da caudae substituir a seringa com uma seringa contendo PBS.
- Cada 30-45 minutos, injectam-se lentamente 50 mL de PBS ou soro fisiológico para manter a hidratação do animal.
8. A eutanásia
- Ao término de aquisição de imagem, eutanásia do animal.
- Aumentar o isoflurano a 5%.
- Mantenha o animal com menos de 5% de isoflurano até 30 segundos depois ela deixa de respirar e remover o animal do palco.
- Realizar deslocamento cervical para assegurar a eutanásia completa.
Processamento 9. Imagem
- Adquirir imagens em arquivos TIFF de 16 bits para cada canal individual em cada ponto de tempo e economizar sequencialmente.
- Realizar a separação de sobreposição espectral (ou seja, GFP e PCP), a eliminação de deriva xy ea geração de filmes a partir de sequências de lapso de tempo usando métodos estabelecidos no ImageJ 9. Executar reconstruções de superfície 3D de imagens de alta resolução 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
microscopia de lapso de tempo intravital estendida permite imagiologia resolução única célula de processos multicelulares no microambiente do tumor. Por células tumorais rotulagem fluorescente, macrófagos, do espaço vascular, e visualizando a rede de fibra de colagénio utilizando o segundo sinal de geração de harmónicas, vários compartimentos no microambiente tumoral são rastreados simultaneamente durante o exame. As células de tumor marcadas com proteínas fluorescentes pode ser gerada em ratinhos transgénicos, como foi feito em ratinhos MMTV-PyMT-Dendra2, com células de tumor mamário marcadas com Dendra2 (Figura 1A). Ao cruzar esses camundongos transgênicos com ratos Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP, que têm macrófagos marcados com ECFP, ambas as células tumorais e macrófagos são rotulados nos ratinhos MMTV-PyMT. Com a estratégia de dupla marcação das células tumorais e macrófagos, a interacção directa dos dois tipos de células podem ser visualizados em tempo real (Figura 1A). Além disso, o cancro da mama linhas celulares humanas ou células de tumores de pacientes transduzidas com GFP pode ser utilizado para marcar células de tumor. Os macrófagos podem ser marcados utilizando marcado por fluorescência 70 kDa dextrano que se acumula nos macrófagos fagocíticos (Figura 1B). Estes métodos têm promovido o estudo de eventos multicelulares dinâmicas, tais como a motilidade tumor de células-macrófagos streaming, a permeabilidade vascular e intravasation de células tumorais. Para visualizar as alterações na permeabilidade vascular do tumor, um elevado peso molecular de dextrano marcado fluorescentemente (155 kDa ou superior é recomendada 9,13,21,22) ou quantum dots são utilizados para marcar o espaço vascular (Figura 1). 155 kDa dextrano ou quantum dots são grandes o suficiente para que eles não são facilmente difundir através dos espaços interendoteliais 23.
imagens de alta resolução contínua facilita a captação de eventos e da permeabilidade vascularquantificação da cinética de extravasamento de dextrano e afastamento em TMEM (Figura 2 e um filme). Como o espaço vascular é facilmente definido pelo 155 kDa dextrano no início da sequência de lapso de tempo (como em 0 'da Figura 2) dextrano fluorescente extravascular pode ser quantificado em cada quadro da seqüência de lapso de tempo. Figura 2 e filme 1 demonstram o extravasamento de 155 kDa dextrano-TMR injectado através de um cateter na veia da cauda numa MMTV-PyMT-Dendra2; Rato Csf1r-PCP. células marcadas com Dendra2 tumorais (verde) e os macrófagos marcados com PCP (ciano) são utilizados para identificar TMEM em animais vivos. A estrutura TMEM no local da permeabilidade vascular é descrito numa caixa branca. O espaço vascular é marcado com 155 kDa de dextrano-TMR (vermelho) para visualizar fluir vasculatura e extravasamento de conteúdo vasculares durante eventos de permeabilidade vascular. O pico de 155 kDa dextrano-TMR extravasamentoa Figura 2 é visto entre 29 'e 34'. dextrano extravascular é vista na seta branca nos painéis de topo e na ponta de seta vermelha nos painéis inferiores, que mostra apenas o canal dos 155 kDa dextrano-TMR. O dextrano 155 kDa-TMR limpa a partir do tecido e é visto como uma diminuição do sinal de TMR extravascular como visto em 97 'na Figura 2. Após a compilação da sequência de lapso de tempo em ImageJ dextrano extravascular é quantificada.
Além disso a observação de eventos espontâneos no microambiente tumoral, é importante para estudar o mecanismo molecular subjacente dos fenómenos identificados. Injetar corantes ou proteínas para induzir permeabilidade vascular pode fornecer informações sobre os eventos de sinalização que regulam a permeabilidade vascular vasculares adicionais. A Figura 3 demonstra a diferença de extravasamento de 10 kDa dextrano-FITC (verde) e 155 kDa dextrano-TMR (vermelho).alto peso molecular 155 kDa dextrano-TMR é administrado imediatamente antes do início da imagem time-lapse. Cinco Z-stacks são adquiridos na sequência de lapso de tempo para definir uma linha de base antes de 10 kDa dextrano-FITC é injetado. Após a aquisição do 5 th Z-empilhar a 10 kDa dextrano-FITC é administrada através do cateter da veia da cauda, sem interrupção de aquisição de imagem. A dextrano-FITC é visto entrando a vasculatura com extravasamento de imediato, enquanto a 155 kDa dextrano-TMR permanece confinada ao espaço vascular (Figura 3, 0 'e 6'). O dextrano 10 kDa FITC-extravasa completamente a partir do vaso sanguíneo e limpa dos tecidos deixando a 155 kDa dextrano-TMR no vaso sanguíneo (Figura 3 como pode ser visto, a 56 'e Filme 2). Utilizando um ponto de tempo antes da injecção, a cinética de dextrano 10 kDa FITC-extravasamento pode ser prontamente comparada com 155 kDa de dextrano-13 TMR. O extravasamento imediata de 10 kDa dextrAN-FITC após a injecção é significativamente diferente do de retenção de 155 kDa dextrano-TMR na vasculatura e os eventos espontâneos permeabilidade vascular 13. Controlos experimentais adicionais podem ser realizadas incluindo a indução de permeabilidade vascular através da ruptura mecânica do endotélio ou através VEGFA 165 permeabilidade mediada por 13. A cinética de extravasamento de 155 kDa dextrano-TMR de eventos espontâneos de permeabilidade pode ser comparado com 10 kDa, dextrano, e outros meios de induzir a permeabilidade vascular de compreender os eventos e sinais envolvidos em eventos de permeabilidade vascular no microambiente tumoral.
Figura 1. Estratégias para a marcação das células e a vasculatura no microambiente tumoral. (A) ratinho transgénico MMTV-PyMT com células tumorais marcadas com Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) e macrófagos marcados com PCP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). vasculatura tumoral é marcado com 155 kDa de dextrano-TMR administrado por cateter da veia da cauda. (B) derivadas de pacientes tumores de xenoenxerto Tn1-GFP com macrófagos marcados com 70 kDa dextran-Texas Red e vasculatura marcados com pontos quânticos utilizando o cateter na veia da cauda. Barra de escala, 50 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A visualização da permeabilidade vascular transitório. (A) Microscopia intravital (IVM) lapso de tempo de 155 kDa dextrano-TMR (vermelho) extravasamento e tumor intravasation celular em TMEM (caixa branca). As células tumorais marcadas com Dendra2 (verde, TC), macrófagos com ECFP (ciano, M) e blovasos od com 155 kDa dextrano-TMR (vermelho, BV). sites de permeabilidade dos vasos sanguíneos (seta branca). (B) Isolado canal 155 kDa dextrano-TMR. As setas vermelhas marcam o extravasamento dextrano (branco). Barra de escala, 50 mm. Filme de microscopia de lapso de tempo no filme 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Visualizing vários dextranos fluorescente etiquetado. IVM lapso de tempo de diferença em extravasamento de 155 kDa dextrano-TMR (vermelho) e 10 kDa dextrano-FITC (verde). Os macrófagos são rotulados com ECFP (ciano) e colágeno em azul (SHG). A sobreposição de vermelho 155 kDa dextrano-TMR e verde 10 kDa dextrano-FITC na vasculatura é amarelo. extravasamento rápida do verde 10 kDa dextrano-FITC de pico é de 6 min. scale bar, 50 mm. Filme de microscopia de lapso de tempo no filme 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. Visualizando a permeabilidade vascular transitória espontâneo com IVM time-lapse. Microscopia de lapso de tempo (como visto na Figura 2) da permeabilidade dos vasos sanguíneos transitória visualizado em um rato MMTV-PyMT transgênico com células tumorais marcadas com Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) e macrófagos marcados com PCP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Extravasamento de 155 kDa dextrano-TMR extravasamento (vermelho no painel esquerdo, o painel direito branco) é observada no ponto de ramificação do vaso sanguíneo do tumor. Plocação clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
2. Filme Visualizando extravasamento de múltiplos dextranos marcados com fluorescência por IVM lapso de tempo. Microscopia lapso de tempo (como pode ser visto na Figura 3) de extravasamento de 155 kDa dextrano-TMR (vermelho) e 10 kDa de dextrano-FITC (verde) de uma transgénico rato MMTV-PyMT com os macrófagos marcados com PCP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG de colágeno é rotulado em azul. Red 155 kDa dextrano-TMR permanece na vasculatura do tumor para a duração do time-lapse, enquanto o verde 10 kDa dextrano-FITC extravasa rapidamente e limpa a partir dos vasos sanguíneos e tecido. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
interacções celulares que ocorrem espontaneamente no microambiente do tumor pode levar a alterações na motilidade de células tumorais e intravasamento. De alta resolução de imagem intravital do tecido tumoral ao vivo permite a visualização da dinâmica multicelulares que podem ser 10,13,24 altamente transitória. Ponto final em ensaios in vivo ou imagens de lapso de tempo adquiridos com pontos de tempo discreto pode fornecer informações essenciais sobre mecanismos moleculares de processos no microambiente do tumor. Estudos de imagiologia intravital têm sido usados para estudar processos no microambiente tumoral que ocorrem ao longo de vários dias, gerando novos conhecimentos sobre a angiogénese, a migração de células do tumor e da resposta ao tratamento medicamentoso 25-30. No entanto, estes ensaios podem não captar a cinética de eventos transitórios no microambiente do tumor devido à escala de tempo dos processos a ser estudada 7,31. Distinguir vários eventos transitórios de processos constantes é um anúncio significativovantage da microscopia intravital.
A técnica de imagem intravital descrito neste protocolo permite a visualização direta da dinâmica celular no microambiente do tumor por meio de rotulagem de fluorescência de múltiplas linhagens e estruturas celulares. Microscopia Multiphoton permite uma maior profundidade de imagem ao longo de fóton único microscopia confocal com profundidades de 300 mm realizada rotineiramente 24. Aquisição de Z-pilhas de 50 - 100 um, com 2 uM passos é de alta resolução suficiente para gerar reconstrução 3D de interacções celulares, incluindo células de protuberâncias que tornam medida que se estendem uma para a outra 13 e estruturas vasculares no microambiente tumoral. Filmes e reconstruções 3D a partir de sequências de imagens de lapso de tempo permitir a quantificação da motilidade celular (velocidade e a direccionalidade) e, utilizando alterações na intensidade do sinal de fluorescência dos corantes injectáveis, a permeabilidade vascular.
A fim de captar speventos celulares ontaneous o número de imagens individuais capturados numa única sequência deve ser optimizado para permitir uma taxa de aquisição de imagem, que capta a cinética do evento, mas que também abrange um espaço físico suficiente para aumentar a probabilidade de captar qualquer evento individual durante uma única seqüência de lapso de tempo. Os parâmetros de imagem espaciais que precisam ser considerados incluem; o número de fatias de um Z-pilha, o número de campos de visão com Z-pilhas adquiridos e a distância axial entre fatias individuais em um Z-pilha. Portanto, a definição desses parâmetros antes de iniciar a aquisição de imagem é um passo crítico no protocolo. Usando o microscópio multiphoton, a aquisição de 30 quadros (500 mm x 500 mm) em uma série z é de aproximadamente 60 seg. Uma vez que a duração de intravasamento célula tumoral pode ser observada na ordem de 13 minutos, a captura de vários Z-pilhas para a reconstrução 3D da intravasamento, o tempo de aquisição de um Z-pilha foi limitada to 60 seg. Por conseguinte, um único campo de visão com um máximo de 30 fatias de um Z-pilha foi adquirida. Além disso, uma vez que a reconstrução 3D de células foi desejada, o passo axial entre Z-fatias foi fixada em 2 uM. Isto permite uma informação suficiente sobre os volumes de celulares para permitir a reconstrução 3D. Estes parâmetros têm de ser optimizados para qualquer software microscópio e imagiologia utilizado baseado na cinética dos eventos vivos a ser estudados.
A modificação da almofada de borracha na platina do microscópio e do cateter IV na veia da cauda ter tanto permitiu um aumento significativo no tempo de imagem. As formas de borracha almofada um poço para permitir a hidratação mantida do tumor, minimizando deriva XY na lamela de vidro. A combinação da câmara de aquecimento com a administração de PBS mantém a hidratação e temperatura fisiológica dos animais. Estas condições combinadas manter a perfusão vascular e o fluxo de sangue para permitir a imagiologia prolongada de eventos celulares nos VAS tumoraisculature incluindo a permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral.
Uma limitação desta técnica é o número de marcadores fluorescentes que podem ser utilizados para visualizar as células no microambiente tumoral. Geração de ratos transgénicos com outros tipos de células (isto é, células endoteliais, fibroblastos ou pericitos) contendo a proteína fluorescente pode ser difícil e demorado. No entanto, as aplicações futuras potenciais pode utilizar uma combinação de marcação da proteína fluorescente de tipos de células do estroma com células tumorais implantadas e 70 kDa dextrano rotulagem dos macrófagos. Ao utilizar uma combinação destas estratégias de rotulagem e cruzando ratinhos transgénicos novas combinações de marcadores celulares podem ser gerados para avaliar o movimento e eventos celulares no microambiente tumoral.
Ao contrário de experimentos de pontos de extremidade baseados em imunofluorescência, microscopia de alta resolução intravital permite a visualização de espontânea e transitóriaeventos no microambiente tumoral. O procedimento de imagiologia intravital aqui descrito revela novos efeitos e interacções celulares no microambiente do tumor que não pode ser decifrada a partir de imagens estáticas. Com nova informação sobre os tipos de células que interagem ou processos, e a cinética destes eventos, hipóteses podem ser gerados para investigar as vias de sinalização que conduzem estas interacções.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela mama Departamento de Defesa Cancer Research Program sob o número prêmio (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, e do Programa Integrado Imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
