Summary
Dette håndskrift beskriver en blød litografi-baseret teknik til at konstruere ensartede arrays af tredimensionale (3D) epitelvæv med defineret geometri omgivet af ekstracellulær matrix. Denne metode kan underkastes en lang række celletyper og eksperimentelle sammenhænge og giver mulighed for high-throughput screening af identiske gentagelser.
Introduction
Udviklingen af forgrenede epitelvæv, kendt som forgrening morfogenese, reguleres af celleafledte, fysiske og miljømæssige faktorer. I mælkekirtlen, forgrening morfogenese er en iterativ proces, hvorigennem styret kollektiv cellemigrering skaber en trælignende arkitektur. Det første skridt er primære knop dannelse fra mælkekanalerne, efterfulgt af gren initiering og forlængelse 1,2. Invasion af grene i det omgivende stroma induceres af den systemiske afgivelse af steroidhormoner ved puberteten. Nye primære knopper derefter starter fra enderne af eksisterende filialer, og denne proces fortsætter med at skabe en epitelial træ 3. Selv om der er identificeret mange vigtige biokemiske signaler, en omfattende forståelse af cellens biologiske mekanismer, der styrer denne komplekse udviklingsproces øjeblikket mangler. Desuden mekanistiske undersøgelser af påvirkninger af specifikke signaler er vanskelige at dekonstruere fra erfamenter in vivo, så præcise spatiotemporale forstyrrelser og målinger er ofte ikke muligt.
Tre-dimensionelle (3D) kultur teknikker, såsom hele orgel kultur, primære organoids, og cellekultur modeller, er nyttige værktøjer til systematisk at undersøge mekanismerne bag vævsmorfogenese 4-6. Disse kan være særligt nyttige til bestemmelse af påvirkninger af specifikke faktorer enkeltvis, såsom mekaniske kræfter og biokemiske signaler, på en række celle- adfærd, herunder migration, proliferation og differentiering. 6 Engineered cellekulturmodeller, navnlig let aktivere den forstyrrelse af individuelle celler og deres mikromiljø.
Én sådan kultur model bruger en mikrofabrikation tilgang til ingeniør model brystepitelceller væv med kontrolleret 3D-struktur, der konsekvent og reproducerbart danner grene, der vandrer kollektivt ved induktion med enppropriate vækstfaktorer. Den største fordel ved modellen er evnen til præcist at manipulere og måle effekterne af fysiske og biokemiske faktorer, såsom mønstre af mekanisk belastning, med høj statistisk konfidens. Denne teknik, sammen med datamodellering, er allerede blevet anvendt til at bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokemiske signaler i vejledning af den normale udvikling af brystepitelceller væv og andre forgrenede epitel 7-11. Præsenteret her er en detaljeret protokol til opbygning disse model væv, som let kan udvides til andre typer af celler og ekstracellulær matrix (ECM) geler, og som tjener som et potentielt værktøj til test af terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsninger
- Til fremstilling af en 5 mg / ml opløsning af insulin, fortyndes den pulveriserede insulin lager med 5 mM saltsyre (HCI) i dH2O (500 mg insulin i 100 ml opløsningsmiddel). Fremstilling af 100 ml opløsningsmiddel ved tilsætning af 50 pi koncentreret HCI til 100 ml destilleret vand (dH 2 O).
- For at gøre en 1x opløsning af PBS, fortyndes 10x phosphatbufret saltvand (PBS) stamopløsning til 1x med dH2O under sterile betingelser.
- Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) elastomer opløsning som følger: Bland PDMS præpolymer sammen med hærdningsmidlet i en 10: 1 (vægt: vægt) forhold.
- Forbered celledyrkningsmediet som følger: til 500 ml lager Dulbeccos modificerede Eagle-medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), der tilsættes 10 ml sterilt føtalt bovint serum (FBS), 500 pi gentamicin reagens, og 500 pi af 5 mg / ml insulin.
- Til fremstilling af 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-opløsning, der tilsættes 1% (w: V) opløsning af BSA pulver til 1x PBS og blandes.
- Til fremstilling af en 4 mg / ml opløsning af neutraliseret bovin type I collagen, tilsættes 50 pi 10x Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) puffer, 30 pi 0,1 N natriumhydroxid (NaOH), 30 pi celledyrkningsmedium, og 400 pi stock kollagen til en afkølet 1,5 ml mikrocentrifugerør. Bland langsomt ved pipettering op og ned; undgå at indføre bobler. For at fjerne eventuelle bobler, kortvarigt centrifugeres blandingen ved 4 ° C.
- Der fremstilles en fikseringsopløsning ved at fortynde 16% paraformaldehyd 1: 4 (v: v) i 1 x PBS.
- Forbered en kerner mærkning løsning ved at fortynde lager kerner mærkning løsning 1: 1000 (v: v) i 1x PBS.
- Der fremstilles en 0,3% phosphatbufret saltvand og detergent (PBST) opløsning ved blanding 1x PBS med 0,3% (vol: vol) detergent.
- Forbered blokerende buffer ved fortynding gedeserum 1:10 (vol: vol) i 0,3% PBST.
- Der fremstilles en primær antistofopløsning for et bestemt protein af interesse ved at fortynde primary antistof (fx kanin-anti-fokal adhæsion kinase (FAK)) 1: 200 (vol: vol) i blokerende buffer.
- Forbered et sekundært antistof ved at fortynde en fluorescerende probe-konjugeret antistof (fx ged anti-kanin) 1: 1.000 (vol: vol) i blokerende buffer.
2. Udarbejdelse af Elastomere Frimærker for 3D Micropatterning
Bemærk: Elastomere stempler er lavet med PDMS.
- Lav en PDMS løsning på samme forhold som beskrevet i trin 1.3 og bland grundigt. Placer blandingen i et vakuumkammer i 15-30 min for at fjerne eventuelle luftbobler, som blev indført under blandeprocessen.
- Hæld afgasset opløsning i en plastik vejer båd eller en petriskål indeholdende et silicium mester der litografisk mønstrede med træk af ønskede geometri. For de bedste resultater, helbrede PDMS løsningen ved 60 ° C i ~ 12 timer.
Bemærk: De silicium mestre er meget tilpasses; denne protokol bruger rektangulære strukturer med dimensioner på 50um x 200 um x 50 um afstand 200 um fra hinanden. Silicium mastere kan fremstilles ved anvendelse af standard fotolitografiske teknikker. Kort beskrevet en epoxy-baseret fotoresist spin-coated på toppen af en siliciumskive. En maske med angivelse af de ønskede stempel funktioner er placeret på toppen af fotoresist-belagt wafer, som derefter udsættes for UV-lys. De ønskede funktioner ikke er blokeret af masken udsættes for lys og den fotoresist på disse steder bliver tværbundet, mens den resterende del af fotoresist coatingen er opløselig og kan vaskes væk. - Efter PDMS er hærdet rundt om de ønskede funktioner på silicium mester, fjerne PDMS og mester fra plastikbeholder. Adskil forsigtigt PDMS fra silicium wafer og fjerne overskydende PDMS fra omkring prentet funktioner ved hjælp af en ren barberblad.
- Nu skære PDMS mønstrede med påtrykt funktioner i individuelle rektangulære frimærker (~ 8 mm x 5 mm) med et barberblad. Opbevar disse feature-side-up i en kelen 100-mm-diameter petriskål.
- Derudover bruger PDMS løsningen beskrevet i trin 1.3 at gøre understøtninger for de rektangulære frimærker.
- Ved hjælp af en spin-coater, spredt ~ 2-3 g af PDMS opløsning jævnt på en 100 mm-diameter Petri skål og hærde PDMS for ~ 12 timer ved 60 ° C som i trin 2.1. Derefter, under anvendelse af et barberblad, sender en tyndt lag af PDMS i rektangler (~ 5 mm x 2 mm).
Bemærk: Der er behov for to understøtninger for hver PDMS frimærke foretaget i trin 2.3. Bærerne kan lagres i 100-mm-diameter petriskål, der indeholder de PDMS frimærker. - Før kan bruges PDMS frimærker og understøtninger til celledyrkning, der steriliseres ved nedsænkning i 70% ethanol og tør bruge en aspirator i et biosikkerhed skab (cellekultur hætte).
3. Fremstilling af 3D epitelvæv
- I et bio kabinet, tilsættes en dråbe på ca. 50 pi 1% BSA i PBS til toppen af hvert frimærke. Placer dråben dækket frimærker ved 4 ° C i en minimum af 4 timer for at sikre, at BSA adsorberer til overfladen af stemplet.
- Aspirer BSA-opløsning fra PDMS frimærker.
- Vask overfladerne af stempler to gange med celledyrkningsmedium (50 pi per vask pr stempel bør være tilstrækkelig), aspirering efter hver vask.
- Håndter de steriliserede PDMS frimærker og støtter ved hjælp af buede stål pincet i rustfrit. I et biosikkerhed skab, lægge ud en 35-mm-diameter vævskulturskål for hver PDMS frimærke. I hver skål, fastsætter to PDMS understøtninger adskilt af en afstand lidt mindre end længden af PDMS frimærker.
- Under anvendelse af pincetten, steriliseres så mange cirkulære dækglas (15 mm i diameter, # 1), som der er PDMS frimærker anvendelse af 70% ethanol. Aspirer den overskydende væske fra dækglas, mens du holder dem med en pincet. Opbevar de vaskede dækglas i en separat 100-mm-diameter petriskål.
- Dispensere ~ 50 pi af kollagen blandingen jævnt coate overfladen af hver PDMS stempel.
- Samle ophver kollagen-coatede PDMS stempel med pincet og vend forsigtigt dem. Sænk de omvendte stempler oven på PDMS understøtter lagt ud i 35-mm-diameter vævskultur diskes således, at kollagen er mellem stemplet og bunden af vævskulturskål. Inkuber skåle ved 37 ° C i 30 minutter.
- Dispensere ~ 50 pi af den resterende kollagen blandingen på hver af de cirkulære dækglas (senere, vil disse blive placeret på toppen af de konstruerede væv helt at indkapsle dem i collagen) og inkubere dem ved 37 ° C i 30 minutter.
- Opnå en 100 mm diameter vævskultur skål indeholdende epithelceller (ex. EpH4 muse mammaepitelceller) på ~ 40% sammenflydning. Aspirer celledyrkningsmediet og vask en gang med 10 ml 1x PBS. Tilsæt 2 ml trypsin til cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
- Tilsæt 8 ml frisk dyrkningsmedium til vævskulturskål indeholdende trypsinerede celler, løsgøre tilbageværende vedhæftende celler fra skålen. Bland forsigtigt ved pipettering og flytte celleblandingen til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 100 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten fra konisk rør og resuspender cellepelleten i celledyrkningsmediet. Anvendelse af et hæmocytometer, tælle cellerne for at bestemme koncentrationen af suspensionen. Justere lydstyrken suspensionen til opnåelse af en slutkoncentration på ~ 10 6 -10 7 celler / ml.
- Fjern de gelerede kollagen prøver fra inkubatoren. Ved hjælp af en pincet, forsigtigt løfte PDMS stempler lige opad for at frigøre dem fra det støbte kollagen og kassere dem.
- Dispensere ~ 30 pi af den koncentrerede cellesuspension på overfladen af hver kollagen gel indeholdende støbte hulrum ønskede geometri. Overhold cellerne under et lysfelt mikroskop med en 10X / 0,25 NA mål, mens forsigtigt at ryste den retter side til side for at fremme celle afregning inden for hulrum. De hulrum skal fyldes inden ~ 5 min.
- Til rEFlyt overskydende celler fra hele hulrummene, vippe hver vævsdyrkningsskål på sin side og forsigtigt dispensere ~ 400 pi cellekulturmedium over overfladen af kollagengelen. Aspirere væsken og gentag vask 1-2 gange mere, kontrol af kollagengeler under mikroskopet i mellem hver vask.
- Efter de overskydende celler er blevet fjernet fra omkring celle-fyldte hulrum i kollagen skimmel, placere vævskulturskåle i en cellekultur inkubator ved 37 ° C i 15 minutter. Så ved hjælp af en pincet, vend forsigtigt collagencoatede klasse dækglas og placere dem på toppen af cellen fyldt kollagen forme, således at collagen fra dækglassene danner en hætte over cellen fyldt hulrum. Inkuber prøverne ved 37 ° C i 15 minutter.
- Når collagen hætter har klæbet til den celle-fyldte collagen skimmel, dispensere ~ 2-2,5 ml celledyrkningsmedium langsomt over dækglas på toppen af gelerne. Kultur prøverne ved 37 ° C i 1-3 dage.
Note:24 timer efter indledende podning kan de epitelvæv behandles med vækstfaktorer, såsom epidermal vækstfaktor (EGF) eller hepatocytvækstfaktor (HGF) for at inducere forgrening.
4. Immunofluorescens og billedanalyse
- Aspirer celledyrkningsmediet fra vævsdyrkningsskåle og tilføje nok fikseringsopløsning til at dække celleholdige geler. Inkubér retter på stuetemperatur i 15 minutter på et rysteapparat ved 200 rpm.
- Aspirer fiksativ, fylde vævskulturskåle med 1x PBS, og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter på et rysteapparat ved 200 rpm. Gentag to gange for i alt tre vaske.
- For at mærke kerner: Aspirer PBS fra vævskulturskål og erstatte med Hoechst løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 15-20 min. For at plette for FAK eller en anden markør, der kan påvises med antistoffer, springe til trin 4.5.
- Aspirer nukleare opløsning mærkning og vask celleholdige gels tre gange med 1x PBS som i trin 4.2. Farvede prøver kan opbevares i 1x PBS ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
- At farve for et protein af interesse: Aspirer PBS fra vævskulturskåle, tilsættes 300 pi 0,3% PBST, og inkubere prøven ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Aspirer PBS, dække gelerne med blokerende buffer, og inkuber på et rysteapparat (200 rpm) ved stuetemperatur i ~ 4 timer.
- Aspirer blokerende buffer, dække gelerne med primær antistofopløsning, og inkuber på et rysteapparat ved 200 rpm natten over ved 4 ° C.
- Aspirer primære antistofopløsning, tilsæt 0,3% PBST-opløsning, og der inkuberes på et rysteapparat ved 200 rpm ved stuetemperatur i 30 min. Aspirer PBST og gentage hver 30 min i 3-4 timer.
- Gentag trin 4.7 og 4.8, denne gang inkubering med det sekundære antistof opløsning. Wrap vævskulturskåle med aluminiumfolie for at forhindre fotoblegning af det sekundære antistof. Efter final vask, kan farves prøver opbevares i 1x PBS ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
- For at visualisere prøver, bruge en 10X / 0,30 NA mål fokuseret på midplane af epitelvæv.
- For at visualisere cellekerner, billede faste prøver mærket med en nuklear markør ved hjælp af en 10X / 0,30 NA mål under UV-belysning.
- At visualisere prøver farvet for et protein af interesse, billede under anvendelse af en 10X / 0,30 NA mål på et inverteret fluorescensmikroskop.
- At skabe frekvens kort af protein farvning af flere væv (typisk 50 eller flere) af identisk indledende geometri, første import hver af billeder ved hjælp af standard billedanalyse software (se Materialer) og konvertere dem til 8-bit gråtoner.
- Til tærsklen disse billeder, konvertere dem til binær (dvs. halvtone / sort og hvid) ved at definere en gråtoner cutoff point; gråtone værdier under tærsklen bliver sort, og dem over tærsklen bliver hvidt. Derefter kombinerehver af de individuelle binære billeder til et enkelt billede stak.
- Dernæst registrere de stablede billeder (dvs. justere eller matche dem) i analysen software. Mange Billedanalyse software pakker kommer med en frit tilgængelig registrering plugin.
- Brug hvert billede i en stabel som en skabelon for tilpasningen af det næste billede, således at billederne i hele stakken flugter ved formering. Endelig overlay (projekt) billederne i den linie billedstak baseret på gennemsnitlig intensitet danner et enkelt billede med en pixel frekvens kortet. Dette billede kan derefter farvekodet hjælp billedredigeringsprogram valg 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversigtsdiagram af mamma-epitelvæv mikrofabrikation
En generel skematisk af mikrofabrikation procedure skitserer det eksperimentelle arbejde flow er vist i figur 1. Slutresultatet er en vifte af epitelvæv med identisk geometri og afstand, der er fuldstændig indlejret i en ECM gel. Et repræsentativt eksperiment anvender EpH4 musebryst epitelceller dyrket i en gel af bovin type I collagen i en koncentration på 4 mg / ml. For at sikre den højeste kvalitet af manipuleret væv, bør de teknikker, der er skitseret i protokollen følges nøje. 2A og 2B viser lav og høj forstørrelse synspunkter arrays af rektangulære brønde, der er blevet støbt ind i en type I collagen gel før celle såning. Formen af brøndene er bestemt af formen af funktionerne på silicium master. Det er vigtigt at løfte the PDMS skimmel lige op fra kollagen for ikke at fordreje hulrummet geometri. Figur 2C viser rektangulære brønde i en type I collagen gel, der er blevet fyldt med mammaepitelceller (overskydende celler er blevet vasket af overfladen af kollagen). I dette eksempel hver 200 um x 50 um rektangulære brønd indeholder ca. 80-100 celler.
Tilsætning af vækstfaktorer inducerer morfogenese
24 timer efter podning, kan vævene behandles med vækstfaktorer, såsom HGF eller EGF og dyrkes i flere dage til at modellere forgrening morfogenese. Typisk grene begynder at danne så tidligt som 4 timer efter vækstfaktorstimulering. Figur 3A viser repræsentative resultater fra rektangulære brystepitelceller væv i et type I collagen gel 24 timer efter mikrofabrikation procedure, hvorefter cells har klæbet til collagen og til hinanden. Ingen grene observeres før vækstfaktor tilsætning. Figur 3B viser et repræsentativt rektangulært væv, der har undergået forgrening 24 timer efter tilsætningen af HGF ved 10 ng / ml. I dette tilfælde forekommer grene ved enderne af vævene (i modsætning til midten), hvor cellerne oplever den højeste mekaniske belastning 9. Flere væv af samme indledende geometri i samme gel kan derefter afbildes til bestemmelse population gennemsnit af gren placering og gren længde, muliggør high-throughput analyse.
Immunofluorescens-farvning til visualisering proteinlokalisering
Immunofluorescens-farvning af vævsarrays i kulturen model tillader os at bestemme proteinlokalisering inden for et væv med høj statistisk konfidens. Figur 4A viser reprætative resultater fra en forgrening rektangulær mamma epitelvæv farvet for fokal adhæsion kinase (FAK). Oprettelse frekvensplaner af væv af identisk geometri kan anvendes til at visualisere den gennemsnitlige rumlige lokalisering af proteiner af interesse inden for de væv, der kan sammenlignes med lokaliseringen af andre proteiner samt forgrening aktivitet. Figur 4B viser en frekvens kort over gennemsnittet FAK farvning for 50 væv viser FAK berigelse ved de korte ender af rektangulære væv, hvor branching typisk forekommer.
Figur 1. Skematisk skitserer mikrofabrikation procedure. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billeder taget under mikrofabrikation processen. (A) Lav og (B) og høje forstørrelse fase-kontrast billeder af rektangulære hulrum i type I collagen oprettet ved hjælp af en elastomer PDMS skimmel. (C) Hulrum fra (A) og (B) er fyldt med mammaepitelceller. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. mikrofabrikerede væv gennemgår forgrening morfogenese. (A) Fase-kontrast billede af en repræsentativ rektangulær væv 24 timer efter mikrofabrikation. (B) Fase-kontrast billede af en fornyetpresentative rektangulære væv, der er begyndt at gennemgå forgrening 24 timer efter tilsætning af HGF ved 10 ng / ml. Hvide pile angiver nydannede grene. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Immunofluorescens-farvning af mikrofabrikerede væv. (A) Immunfluorescensfarvning for FAK i et mamma-epitelvæv efter gren initiering. (B) En frekvens kort over gennemsnittet FAK farvning i 50 væv. Scale barer, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fonden. ASP blev delvist understøttet af en Charlotte Elizabeth Procter hædrende Fellowship.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).