Summary
For at forstå patofysiologien af slagtilfælde, er det vigtigt at anvende pålidelige modeller. Dette dokument vil beskrive en af de mest hyppigt anvendte slagtilfælde modeller i mus, betegnet den midterste cerebrale arterie (MCAO) model (også betegnet den intraluminale fibres sutur model) med reperfusion.
Abstract
Slagtilfælde er en førende dødsårsag i verden og fortsætter med at være en af de hyppigste årsager til langsigtede voksne handicap. Omkring 87% af slagtilfælde er iskæmisk oprindelse og forekommer i det område af den midterste cerebrale arterie (MCA). I øjeblikket er den eneste Food and Drug Administration (FDA) godkendte lægemiddel til behandling af denne ødelæggende sygdom er vævsplasminogenaktivator (TPA). Imidlertid tPA har en lille terapeutisk vindue til indgivelse (3 - 6 timer), og er kun effektiv i 4% af de patienter, der rent faktisk modtager den. Nuværende forskning fokuserer på forståelse af patofysiologien af slagtilfælde for at finde potentielle terapeutiske mål. Således pålidelige modeller er afgørende, og MCA okklusion (MCAo) model (også kaldet den intraluminale fibres sutur model) anses for at være den mest klinisk relevante kirurgiske model for iskæmisk slagtilfælde, og er temmelig ikke-invasiv og let reproducerbare. Typisk MCAo modellen anvendes med gnavere, især med mus på grundtil alle de genetiske variationer rådighed for denne art. Her beskriver vi (og til stede i videoen) hvordan man med held udføre MCAo model (med reperfusion) i mus til at generere pålidelige og reproducerbare data.
Introduction
Slagtilfælde er den femte førende dødsårsag på verdensplan, med én person dør af sygdommen hvert 4. minut. Over 800.000 amerikanere lider et slagtilfælde hvert år, som ikke alene ødelæggende for patienten, men også for deres familier. Slagtilfælde er den vigtigste årsag til voksen handicap og de årlige udgifter anslås at være i størrelsesordenen milliarder $ 36,5 1 trods meget få behandlingsmuligheder bliver tilgængelige.
Vævsplasminogenaktivator (tPA) er den eneste Food and Drug Administration (FDA) licenseret lægemiddel til iskæmisk slagtilfælde. Det er imidlertid kun effektiv, hvis det gives til patienter inden for 3-6 timer fra indtræden af slagtilfældet, og i disse tilfælde den gavner kun 4% af patienterne 2. Derfor er det bydende nødvendigt, at reproducerbare, klinisk relevante dyremodeller for slagtilfælde anvendes til at hjælpe med udviklingen af potentielle terapeutiske strategier og behandlinger for denne sygdom. Det er vigtigt at bemærke, at in vitro in vivo modeller er afgørende.
Den mest almindelige form for slagtilfælde er iskæmisk oprindelse, der tegner sig for 87% af de samlede slagtilfælde. Andre slagtilfælde er intracerebral blødning (9%) og subarachnoid blødning (4%), og skyldes mest, ved en emboli til arteria cerebri media (MCA). Dette kan tilskrives den fremtrædende kurve ved roden af MCA, som forårsager laminar blodgennemstrømning ind i hjernen til at blive forstyrret. MCA skyldes den interne halspulsåren (ICA) og ruter langs sidelinjen sulcus, hvor det filialer og projekter til basalganglierne og de laterale overflader af frontal, parietal og tindingelapperne, herunder den primære motor og sensoriske cortex. The Circle of Willis er skabt af posteriore cerebrale arterier bliverforbundet til de cerebrale arterier og de posteriore kommunikerer arterier.
Den intraluminale fibres sutur model af MCAo er en af de mest udbredte i slagtilfælde forskning. Der er dog et par forskellige variationer af denne model, og disse er baseret på, hvorvidt microfilament indsættes i den ydre carotidarterie (ECA, betegnet Longa metode) 3, eller om den er indsat i ICA (betegnet Koizumi metode) 4. I Koizumi metode, skal den fælles halspulsåren (CCA) på siden af operationen være permanent bundet, hvis glødetråden er fjernet for at forhindre blødning fra snit i CCA, mens der i Longa metode er Revisionsretten, der skal være permanent bundet 5 . Her Longa metode vil blive anvendt som vi mener, dette er en langt overlegen og en mere klinisk relevant kirurgisk model af iskæmisk slagtilfælde. Endvidere er anvendelsen af en silicium-tipped monofilament, især med Longa metode, frembringer megetreproducerbar MCAo i modsætning til de flammehæmmende stump monofilamenter, som ofte frembringer ufuldstændig okklusion og / eller subarachnoid blødning 6.
Den intraluminale metode filament kan anvendes som en model af permanent eller forbigående okklusion 4,6. For at udføre den transiente model er filamentet fjernes efter en periode med iskæmi (fx 30 min, 60 min, eller 2 timer), og reperfusion lades ske. Denne model, til en vis grad, simulerer genoprettelse af blodstrømmen efter spontan eller terapeutisk indgreb (f.eks tPA administration) at lysere en tromboembolisk blodprop i mennesker. For permanent model, er den endeløse simpelthen siddende i en periode (fx 24 timer), så ingen reperfusion forekommer. En anden fordel ved den intraluminale filament metoden er, at en kraniotomi ikke behøver at blive udført, så kraniet skal efterlades intakt og undgå eventuelle ændringer i det intrakranielle tryk og temperatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol og eksperimenterne rapporteret i videoen blev godkendt af LSUHSC-S Institutional Animal Care og brug Udvalg og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra NIH.
BEMÆRK: C57BL / 6 mus, der vejede 25 - 29 g blev anvendt i denne undersøgelse. Musene blev holdt på en standard chow pellet diæt med fri adgang til vand, under en 12 timers lys / mørke-cyklus i individuelt ventilerede bure. Proceduren vil blive udført under sterile betingelser under anvendelse af sterile teknikker (f.eks, sterile handsker, sterile instrumenter).
1. Pre-kirurgiske Præparater
- Narkosen med en kombination af ketamin (150 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret intraperitonealt (ip). Overvåg anæstesidybden fods pinch oprindeligt hver 3 - 5 minutter og hver 10 min, når bedøvelsen er opnået. Mens dyret er under anæstesi, administrere en steril okulær salve for at forhindre tørhed. Den indledende dosis af ketamin / xylazin varer normalt abud 30-40 minutter. En ekstra dosis kan administreres, hvis nødvendigt, som er kontrolleret af dyrets reaktion på en fod knivspids.
- Placer mus i rygleje på en temperaturreguleret varmemåtte og opretholde legemstemperatur ved 36,5 ± 0,1 ° C, hvilket er bekræftet ved anvendelse af en rektal sonde.
- Barbering halsen og desinficere huden med 70% ethanol.
2. Okklusion af MCA (figur 1)
- Lav en midterlinjen hals snit ved hjælp af Iris lige saks og trække (ved hjælp retraktorer) det bløde væv at eksponere skibene.
- Skær CCA og Revisionsretten fra omkringliggende væv ved hjælp Dumont pincet uden at beskadige vagus nerve.
- Lav et midlertidigt sutur ved at binde en løs knude omkring CCA hjælp 6-0 silke.
- Lav en permanent sutur rundt Revisionsretten og de mindre fartøjer strækker sig fra det ved tæt ligere skibene (distale til forgreningen af CCA).
- Lav en sutur around ECA proksimalt for CCA forgreningen.
- Placer en mikrokar klip omkring den indvendige carotidarterie (ICA) og pterygopalatinarterien (PPA).
- Lav et lille snit i ECA hjælp mikro dissekere forår saks og indsætte en 180 um silicium-tippet monofilament. Gøre cut så tæt på den permanente sutur som muligt for lettere manipulation af filamentet.
- Spænd midlertidig sutur rundt Revisionsretten med glødetråd indsat og fjern mikrokardannelse klip.
- Skær Revisionsretten mellem den permanente, distale sutur og indgang af glødetråden hjælp mikro dissekere forår saks.
- Guide glødetråden gennem ICA indtil modstand mærkes (ca. 9 -. 10 um ud tvedeling af CCA) i MCA.
BEMÆRK: I tilfælde for meget modstand mærkes mens størstedelen af glødetråden er stadig synlig, kan glødetråd har indtastet PPA. Hvis dette sker, trækkes glødetråd tilbage til forgreningen, forsigtigt push fremad ind i ICA bruger Dumont pincet, og fremføre filament, indtil det kan visualiseres i ICA.
3. Reperfusion
- Efter en 30-min okklusion periode, fjernes glødetråden ved forsigtigt at trække det tilbage ved hjælp Dumont pincet og fastgøre suturen omkring den åbne ende af Revisionsretten.
- Fjern den midlertidige sutur omkring CCA ved omhyggeligt løsne ligatur hjælp Dumont pincet og blodgennemstrømning genoptages gennem CCA.
- Luk indsnittet med en kontinuerlig kirurgisk sutur. Lukning af huden kan udføres ved enten kontinuerlige eller afbrudte suturer. Hud hæfteklammer er også en acceptabel fremgangsmåde.
- Sprøjt mus med 1 ml saltvand subkutant som volumen opfyldning og med de smertestillende carprofen (5 mg / kg, sc) til lindring af smerter og ubehag fra den kirurgiske procedure, Tegn, der indikerer er behov for yderligere smertelindring omfatter hunched tilbage, ungroomed pels, nedsat aktivitet, unormalposeren, og nedsat appetit.
- Observere musene under opvågningen fra bedøvelsen i et opvarmet 30 ° C bur under anvendelse af en varmelampe reguleres med en temperaturregulator og placere Mos chow i en petriskål på gulvet i buret for at tilskynde spise. Musene skal huses én pr bur under reperfusionsperioden.
4. Sham Surgery
- Om mus til den samme procedure uden monofilamentet indsættelse.
5. Postoperative Neurologiske Scores (tabel 1, figur 2)
- Neurologisk evaluere mus efter passende reperfusion periode ved hjælp af en 18-punkts pointsystem vurdere Generelt; Motor; Sensory; Proprioception. En højere neurologisk score svarer til nedsat neurologisk funktion.
BEMÆRK: Mus, der vurderes ikke reagerer og ude af stand til at gå, vil blive aflivet. Andre kriterier for human eutanasi vil omfatte et vægttab på mere end 20%, respiratorisk distress, og infektion omkring det kirurgiske område. En CO 2 kammer vil blive anvendt til eutanasi og den fysiske metode til at bekræfte død vil være cervikal dislokation eller torakotomi.
6. Måling af Brain infarktvolumen (figur 3)
- Narkosen med en kombination af ketamin (150 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret ip Monitor anæstesidybden fods pinch oprindeligt hver 3 - 5 minutter og hver 10 min, når bedøvelsen er opnået.
- Placer mus i rygleje og skære huden fra maven til halsen efterfulgt af peritoneum under anvendelse iris lige saks.
- Løft brystbenet hjælp Dumont pincet og skære ribbenene at eksponere hjertet.
- Åbn venstre og højre side af brystet bruger to par hemostats, udsætter hjertet.
- Sæt en 26 G nål fastgjort til en 5 ml sprøjte ind i venstre hjertekammer og skære højre atrium. Perfundere med stuetemperatur normalt saltvand eller -phosphate saltvand (PBS), indtil væsken bliver klart (normalt 3 - 5 min).
- Fjern kraniet forsigtigt væk fra hjernen ved hjælp iris lige saks og Dumont pincet.
- Skær olfaktoriske pærer og cerebellum under anvendelse af et barberblad, således at hjernen vil passe ind i matrixen. Brug denne matrix til at skære hjernen til selv segmenter. Chill matrixen før brug for at holde vævet cool. Placer hjernen til matricen og sæt den på is.
- Skær hjernen til 2 mm koronale segmenter ved hjælp af to barberblade. Gør det første snit under anvendelse af et barberblad, der begynder 2 mm fra toppen og forlade denne barberbladet på plads. Foretag yderligere 2 mm skåret bag den første. Fjern den første barberblad med vævet vedlagt. Gentag denne proces, indtil alle væv er blevet skåret.
BEMÆRK: Der bør være 4 - 5 segmenter når du er færdig. - Placer segmenterne i 24-brønds plade indeholdende 2% 2,3,5-triphenyltetrazalium chlorid (TTC), som derefter anbringes i en flad vandbadett 37 ° C i 20 min. Placering hvert segment i en individuel brønd hjælper med at holde dem i den rækkefølge, de blev skåret. Sørg for, at TTC løsningen fuldstændig dækker vævet segmenter. Efter 10 min slå alle skiverne over.
- Placer en lille mængde af 10% formalin i brøndene på en ny plade med 24 brønde og overføre segmenterne til denne plade i den rækkefølge, som de blev skåret.
- Scan segmenterne i computeren og analysere infarktstørrelse som en procentdel af hele hjernen skive 6 ved anvendelse ImageJ analysesoftware (NIH 1.57 Billede Software) 6.
- Outline infarktområdet at generere en måling område. Næste måle hele kontralaterale hemisfære at bestemme området. Opdel infarktareal med arealet af den kontralaterale hemisfære og gange med 100 for at bestemme infarktvolumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus undergik 30-min MCAo-induceret hjerneiskæmi (figur 1) efterfulgt af en periode med reperfusion (24 timer og 1 uge præsenteres her, men længden af reperfusion kan varieres). Dødeligheden under MCAo var minimal (ca. 2%). Indlæg iskæmi, dødeligheden (indenfor de første 24 timer) var omkring 26%.
Laser Doppler flowmetri blev anvendt til at bekræfte blodgennemstrømningen perfusion i MCA område før og efter MCAo / reperfusion. Figur 4 viser klart, at når den midlertidige CCA slips frigives efter 30 minutters iskæmi til fjernelse filament og reperfusion at forekomme, er der en bølge i perfusion, som nåede <100% af baseline perfusion (dvs. før operation) 5 min i reperfusion.
24 timer efter strokedebut (før måling af infarktvolumen) Neurological scores vedrørende generelle, sensoriske, motoriske og proprioceptive underskud blev vurderet (tabel 1). Dette pointsystem er at give objektive ( "ja eller nej") kriterier for vurdering. Figur 2 viser, at score for mus (n = 27) på 24 timer var 12,56 ± 0,7, og forblev høj 1 uge senere (11,50 ± 1,5 ). En højere neurologisk score svarer til nedsat neurologisk funktion.
Infarktvolumener spejlet lignende mønstre til den neurologiske score på 24 timer, dvs. større end sham dyr. 24 timer efter MCAO mus havde store infarktvolumener (figur 3: 15,9 ± 2,6%), der blev øget en uge efter slagtilfælde (28,5 ± 1,9%).
Figur 1: Skematisk viser placeringen af mellem-cerebral arterieokklusion(MCAo) Kirurgi og Large-fartøj vaskulatur af cerebral cirkulation. A. Kirurgisk MCAo opnås via indføring af et filament i den ydre carotidarterie og derefter i den proximale midterste carotidarterie. BG. Steps til induktion MCAo. Anterior kommunikation arterie (ACA); midterste cerebrale arterie (MCA); posterior kommunikation arterie (PcomA); posterior cerebral arterie (PCA); basilar arterie (BA); indre carotidarterie (ICA); ydre carotidarterie (ECA); pterygopalatinarterien (PPA); indre carotidarterie (ICA). (Modificeret med tilladelse fra Smith et al., Henvises # 5.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Den 18-punkts Stroke Score Denne comprehensive slagtilfælde score vurderer funktionelle forbedringer i almindelighed og sensoriske, motoriske og proprioceptive aspekter af muse adfærd efter et slagtilfælde. Data er gennemsnit ± SEM. * P <0,05. n = 3 mus / gruppe. Dataene blev analyseret ved anvendelse af ANOVA plus en Bonferroni post hoc test. (Modificeret med tilladelse fra Smith et al., Henvises # 5.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Infarktvolumener af C57BL / 6-mus 24 timer efter MCAO Mus blev udsat for 30-min MCAo og 24 timer eller 1 wk af reperfusion A) Hjerner blev fjernet, sektioneret og farvet med 2% 2,3,5. triphenyltetrazoliumchlorid (TTC). I levende væv, dehydrogenaser enzymatisk reducere TTC til 1,3,5-triphenylformazaon (TPF), som er en rød farve, men i iskæmisk væv er enzymet ikke funktionel, så vævet forbliver hvid. B) Grafen viser en stigning i infarktvolumen hos mus, der har haft et slagtilfælde. Data er gennemsnit ± SEM. ** P <0,002, **** P <0,0001 versus humbug; n = 4 mus / gruppe. Dataene blev analyseret ved anvendelse af ANOVA plus en Bonferroni post hoc test. Scale bar = 1 cm (modificeret med tilladelse fra Smith et al., Henvises # 5.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Perfusion af MCA territorium Gennem MCAo og reperfusion Mus blev udsat for 30-min MCAo, og <5 min reperfusion. Referencemodeller blev normaliseret til 100%. Som expeCTED, perfusion 5 min i reperfusionsperioden var højere end MCAo, dvs. når ingen perfusion af vævet indtraf. Data er gennemsnit ± SEM. * P <0,05. n = 3 mus / gruppe. Dataene blev analyseret ved anvendelse af ANOVA plus en Bonferroni post hoc test. (Modificeret med tilladelse fra Smith et al., Henvises # 5.) Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Neurologisk Scoring System Et point gives for et ja svar på hver enkelt kontrol.. Marks ud af 18 7,8.
| Prøve | Kort beskrivelse | Hvad betyder det teste for? | Referencer |
| Morris water maze | En vand-labyrint procedure åben mark, hvor gnavere lærer at flygte fra vand på en skjult platform | Rumlig hukommelse, bevægelseskontrol, og kognitiv kortlægning | 19 |
| roterende stav | En vandret roterende stang, hvor gnavere skal gå frem for ikke at falde af | Motorik, balance og gribestyrke | 20 |
| Pol | Gnavere placeret på en stang og observeret for glidende eller falder som de gør deres vej ned i et bur | Bevægelsesforstyrrelser forårsaget af kortikale skader | 21, 22 |
| ganganalyse | Som gnavere krydser en glasplade deres befamle udskrifter indfanges til at undersøge deres bevægelser | Gå mønstre (pote tryk, skridtlængde, bredde og frekvens, tå spredes, gangart vinkel, og krop rotation)og motorisk koordination | 23, 24 |
| Sticky label test | Strimler af tape anvendes på den hårløse del af forpote af gnavere til at registrere tid til at kontakte hver pote, orden af kontakt, da fjernelsen, og rækkefølgen af fjernelse | Forepaw følsomhed og sensomotoriske underskud | 25, 26 |
| Hjørne | Gnavere anbragt mellem to plader, der danner en 30 ° vinkel; når du indtaster dybt ind i hjørnet begge sider af vibrissae stimuleres og gnavere stejler og vender tilbage til ansigt den åbne ende | Neurologiske lidelser og gentagne adfærd (overvågning vender sig i en retning i forhold til den modsatte retning) | 27, 28 |
| Cylinder | Gnavere anbringes i en glascylinder med forlemmet aktivitet, mens opdræt imod af væggen registreres | Lokomotorisk asymmetri og evaluere Poststroke brug lemmer | 28 |
| trappe | Gnavere placeret på en platform i en kasse med en agn dobbelt trappe; gnavere er mad begrænset til fremme bevægelse op ad trappen til at indsamle agn | Nå evner for hver forben uafhængigt kræver sensoriske kapaciteter, fingerfærdighed, og motorisk koordination | 25, 29 |
| Stige | Gnavere gå på tværs af en vandret stige for at nå deres bur; foden glider, mens du går på tværs af stigen registreres | Foot fejl under bevægelse; forben og bagben funktion og koordination | 30 |
Tabel 2: Eksempler på murine adfærdsmæssige forsøg.
| Forslag til GLP er som følger: |
| - Specifikke detaljer af hvilken model af slagtilfælde er blevet valgt (f.eks Longa vs. Koizumi), og stammen, alder, køn, vægt rapporteret tydeligt. |
| - Undersøgelser udført i en dobbelt-blindet mode. |
| - Power analyse rapporteret. |
| - Kriterier for inklusion og eksklusion i undersøgelsen besluttet forud for undersøgelsen, og rapporteres. |
| - Dyr overvåges dagligt (grundlæggende udseende, kropsvægt og adfærd) for tegn på angst, smerte eller sygdom. |
| - Indberetning af dyr er udelukket fra undersøgelsen. |
| - Randomisering af dyr i grupper. |
| - & #160; Indberetning af negative og positive resultater. |
| - Indberetning af længden af kirurgi, bedøvelse, kropstemperatur og blodgasser. |
| - Indberetning af miljøberigelse bruges, hvis nogen. |
Tabel 3: Forslag til god laboratoriepraksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden dens undfangelse 20 år siden, har MCAo model for human slagtilfælde involverer indsættelse af et filament blevet anvendt i et stort antal undersøgelser. Dette skyldes primært det faktum, at det efterligner det, der sker klinisk i den mest almindelige form for slagtilfælde (dvs. iskæmisk slagtilfælde). Striatum er mere følsomme over for iskæmi end hjernebarken, og som sådan, vil længden af iskæmisk tid oversætte til, om både striatum og dorsolaterale cortex vil blive påvirket, eller bare striatum. Både infarkt og reperfusion gange kan varieres i overensstemmelse hermed, og det giver forskeren mulighed for at kunne studere patologiske virkninger forbundet med forbigående iskæmiske attakker (TIA'er) til meget større infarkter.
Gennem årene ændringer og fejlfinding af glødetråden metode MCAo har vist betydningen af proceduren udføres i sterile forhold for at undgå risikoen for infektion 9. Resultaterne kan varieremellem gnavere, stamme (har anatomiske variationer vist) 10,11, vægt og bedøvelsesmidler brugt, men udviklingen i de resultater, der præsenteres her, er tilbøjelige til at blive afspejlet i andre laboratorier hvor MCAo udføres. Andre kritiske skridt at tage i betragtning, er kropstemperatur, blodtryk og blodgasser. Det er velkendt, at kropstemperaturen påvirker neurologiske skader, med mindre læsioner forbundet med hypotermi 12 og mere alvorlige underskud bliver præsenteret i hypertermi 13. Som sådan bør temperaturen måles og kontrolleres, for eksempel via anvendelse af animalsk temperaturregulatorer med en varmepude, for således at opretholde legemstemperatur ved 36,5 ° C. Volume opfyldning og tilskyndelse til at spise ved at placere blødgøre chow i bunden af buret er også andre faktorer at observere. Blodtryk og blodgasser 6,14 kan både nemt måles og overvåges ved hjælp af let tilgængelige udstyr fra commercial leverandører.
Begrænsninger af MCAo teknik indbefatter korrekt dissekere vagus nerve fra arterierne uden skader og undgå fremføring af filamentet til PPA, hvilket kan påvirke ikke blot evnen til at inducere slagtilfælde effektivt, men også overlevelsesraten af musen. Den vigtigste betydning med hensyn til alternativ in vivo MCAO metoder er overlevelsesraten ved brug af Longa her beskrevne fremgangsmåde. Vi har også fundet, at dette svarer til øgede leukocyt-endotelcelle-interaktioner og øgede infarktvolumener, som gør denne model, når beherskes, et fremragende redskab til at studere potentielle terapeutiske mål for behandlingen af slagtilfælde.
Selvom vi ikke har rapporteret nogen her, kan en række adfærdsmæssige tests også udføres såsom Morris water maze, rotarod, pole test, ganganalyse, klistermærketest, hjørne test, cylinder test, trappetest, og stigen test (se tabel2 for detaljer og referencer). Sham dyr har ingen problemer med at fuldføre disse adfærdsmæssige tests; dog slagtilfælde dyr udføre disse tests langt mindre held. I forlængelse af dette, et område af debatten er, om miljøberigelse påvirker ikke kun reproducerbarhed MCAo modellen, men også om det vil påvirke resultatet af adfærdsmæssige tests 15. Dette er uklart, men det er værd at standardisere dette i laboratoriet, og gennem hele undersøgelsen.
Der er en overflod af forskellige tests til rådighed til måling af udfald af slagtilfælde. Vi har præsenteret ansættelse af laser-doppler for blod flow målinger, en dybtgående 18-punkt neurologisk vurdering score, og også infarktvolumen målinger. Men yderligere indstillinger er også nyttige, såsom billeddannelse. Vi rutinemæssigt ansætte brugen af intravital fluorescensmikroskopi for at studere cellulære interaktioner (karakteristisk for et inflammatorisk respons) 6 i cereBral mikrocirkulationen i realtid, i bedøvede dyr 5,6,16. MCAo og reperfusion frembringer en øget cerebral inflammatorisk respons versus sham dyr 5,6,16. Andre billeddiagnostiske metoder såsom magnetisk resonans 17 og positronemissionstomografi 18 kan også anvendes, da de giver mulighed for longitudinelle studier, der er klinisk relevante.
Histologisk analyse af hjernevæv, bør plasma og serum prøver rutinemæssigt udføres som de tillader yderligere karakterisering af de patofysiologiske reaktioner på slagtilfælde og de mekanismer involveret, men også, og måske endnu vigtigere, de tillader forskerne at studere virkningerne af forbindelser på resultatet af slagtilfælde, hvilket giver vigtige data for potentielle terapeutiske mål for denne invaliderende og ødelæggende sygdom. Endelig mener vi, det er meget tilrådeligt for forskere at overveje ikke kun de mest hensigtsmæssige slagtilfælde model based på kravene til deres undersøgelse, men også, at GLP ( "Good Laboratory praksis"), er obligatorisk. Se tabel 3 for GLP forslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| Ketamine Hydrochloride | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| Xylazine | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| DC temperature control system | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| Mini rectal thermistor probe | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| Heating pad | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| Clippers | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% ethanol | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| Dissecting microscope | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| Iris scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont forceps (45° bent tip) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| Micro vessel clip | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| Micro dissecting spring scissors (straight) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| Retractors (blunt) | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen used 17022-13) | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| Gauze sponges | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 silk braided surgical suture | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% sodium chloride | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament) | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| Carprofen | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp temperature controller | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| Heat lamp | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| Laser doppler probe | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24-well plates | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| Single edge razor blades | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| Mouse brain matrix slicer | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| Water bath | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% formalin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ analysis software | NIH, Bethesda, MD | free download | |
| Retractor | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Marks, M. P., et al. Patients with acute stroke trated with intravenous tPS 3-6 hours after stroke onset: correlations between MR angiography findings and perfusion- and diffusion-weighted imaging in the DEFUSE study. Radiology. 249 (2), 614-623 (2008).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimnetal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. (8), 1-8 (1986).
- Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. E. Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. J Neurosci Meth. 249, 99-105 (2015).
- Gavins, F. N., Dalli, J., Flower, R. J., Granger, D. N., Perretti, M. Activation of the annexin 1 counter-regulatory circuit affords protection in the mouse brain microcirculation. FASEB J. 21 (8), 1751-1758 (2007).
- Chen, J., et al. Atorvastain induction of VEGF and BDNF promotes brain plasticity after stroke in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 281-290 (2005).
- Li, Y., et al. Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (9), 1311-1319 (2000).
- Liesz, A., et al. The spectrum of systemic immune alterations after murine focal ischemia; the immunodepression versus immunomodulation. Stroke. 40 (8), 2849-2858 (2009).
- Beckmann, N. High resolution magnetic resonance angiography non-invasively reveals mouse strain differences in the cerebrovascular anatomy in vivo. Magn Reson Med. 44 (2), 252-258 (2000).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Burk, J., Burggraf, D., Vosko, M., Dichgans, M., Hamann, G. F. Protection of cerebral microvasculature after moderate hypothermia following experimental focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. (1226), 248-255 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthemia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Shin, H. K., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Würbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments? Nat Methods. 6 (4), 257-261 (2009).
- Holloway, P. M., et al. Both MC1 and MC3 receptors provide protection from cerebral ischemia-reperfusion-induced neutrophil recruitment. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, (2015).
- Vandeputte, C., et al. Characterization of the inflammatory response in a photothrombotic stroke model by MRI: implications for stem cell transplantation. Mol Imaging Biol. 13 (4), 663-671 (2010).
- Iwae, Y., et al. Glial cell-mediated deterioration and repair of the nervous system after traumatic brain injury in a rat model as assessed by positron emission tomography. J Neurotrauma. 27 (8), 1463-1475 (2010).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Mouzon, B., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in a mouse model produces learning and memory deficits accompanied by histological changes. J Neurotrauma. 29 (18), 2761-2773 (2012).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human α-synuclein. J Neurosci. 24 (42), 9434-9440 (2004).
- Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 125 (1-2), 109-125 (2001).
- Toon, L., Silva, M., D'Hooge, R., Aerts, J. M., Berckmans, D. Automated gait analysis in the open-field test for laboratory mice. Behav Res Methods. 41 (1), 148-153 (2009).
- Lubjuhn, J., et al. Functional testing in a mouse stroke model induced by occlusion of the distal middle cerebral artery. J Neurosci Methods. 184 (1), 95-103 (2009).
- Bouët, V., Freret, T., Toutain, J., Divoux, D., Boulouard, M., Schumann-Bard, P. Sensorimotor and cognitive deficits after transient middle cerebral artery occlusion in the mouse. Exp Neurol. 203 (2), 555-567 (2007).
- Freret, T., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: usefulness of adhesive removal test. Behav Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature Neurosci. 17, 400-406 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow. 33, 330-338 (2012).
- Wiessner, C., et al. Anti-nogo-a antibody infusion 24 hours after experimental stroke imporved behavioral outcome and corticospinal plasticity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 154-165 (2003).
- Schaar, K. L., Brenneman, M. M., Savitz, S. I. Functional assessments in the rodent stroke model. Exp Transl Stroke Med. 2 (13), (2010).
