Abstract
本文从小型全血样本中的白细胞快速，标准化富集的协议描述。这个过程是基于红细胞的低渗裂解和可以应用到人类的样本以及非人类来源的血液。的约50至100微升小初始样品体积使得这种方法适用于反复采血从小型实验室动物。此外，白细胞富集分钟之内，并与有关化学品和仪器仪表材料低的努力所取得，使得这种方法适用于多个实验室环境。
白细胞的标准化纯化是用高选择性染色法来评价血红素过氧化物酶的卤化过氧化物酶，髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）， 即，次氯酸和次溴酸（次氯酸和次溴酸）的形成相结合。虽然MPO是NEUT强烈表达rophils，在人血液中，以及在单核细胞中最丰富的免疫细胞类型，相关的酶的EPO是专门在嗜酸性粒细胞中表达。这些酶的卤化活性是通过使用几乎HOCl-和次溴酸特异性染料氨基苯基荧光素（APF）和主过氧化物过氧化衬底氢处理。在随后的流式细胞分析所有过氧化物酶阳性细胞（嗜中性粒细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞）的区分和它们的卤化过氧化物酶的活性可以被量化。因为APF染色可以与细胞表面标记物的应用相结合，这个协议可以扩展到专门处理白细胞亚级分。该方法适用于同时检测在人类和啮齿动物白细胞次氯酸和次溴酸的生产。
鉴于这些酶产品在慢性炎症性疾病的广泛和多样讨论免疫的作用，这个协议可能有助于更好地理解免疫白细胞衍生的血红素的过氧化物酶的相关性。
Introduction
多形核白细胞（PMN，也称为粒细胞）和单核细胞代表在血液中1,2-先天免疫系统的重要细胞成分。它们向主防御病原体以及所获取的免疫系统的活化和全身性的炎症反应2-4的启动。然而尤其嗜中性粒细胞，最丰富的类型粒，和单核细胞也显著有助于急性炎性事件5的调节和终止。因此，这些细胞也可能在慢性炎性疾病如类风湿关节炎6,7-重要作用。事实上，哮喘，慢性炎性气道疾病，特点是嗜酸性粒细胞的削弱的细胞凋亡，在血液8的第二大粒型。然而粒细胞凋亡及快速拆卸由巨噬细胞是细胞终止在两个基本步骤炎症9-11。
在已命名的免疫细胞两个密切相关的酶，即髓过氧化物酶（MPO，中性粒细胞和单核细胞）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO，嗜酸性粒细胞）可以发现12,13。这些血红素过氧化物酶古典相关，因为它们两个电子氧化（伪）卤化为相应的低（伪），其为它们的杀菌性能14-16已知亚卤酸体液免疫应答。在生理条件下的MPO主要形式次氯酸（次氯酸）和hypothiocyanite -而后者和次溴酸（次溴酸）由EPO 17-19形成（OSCN）。新的结果表明，这种（伪）卤化酶活性也可能有助于炎性反应的调节和免疫反应20,21的终止。事实上，次氯酸生产由MPO和衍生产品被证明抑制Ť基于细胞的适应性免疫应答22-24。
为了在慢性炎症性疾病，以获得从先天免疫系统更见解白细胞的免疫作用，并确定MPO和EPO的贡献这种生理功能，我们开发迅速丰富从小血样白细胞用于随后特定的方法测定这些细胞中的卤化过氧化物酶活性。为红细胞耗尽我们选择的标准方法，包括用蒸馏水，这导致了快速的白细胞富集在低材料成本的两后续低渗裂解步骤。对于卤化MPO随后的决心和EPO活动HOCl-和次溴酸专用染料荧光氨苯（APF）用于25-27。在对比的非特异性过氧化物酶染色方法28,29中的应用，这种方法使卤化过氧化物酶活性的选择性检测，这往往是在严重INFL障ammation 30,31。
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Protocol
从健康志愿者获得了人类所有的血液样本，并应用白细胞浓缩协议遵循莱比锡大学医学院伦理委员会的指导方针。与大鼠血液实验是由负责当地的伦理委员会（Landesdirektion萨克森，Referat 24），根据动物护理和使用指南德国批准。
1.实验装置
注意：作为用于从血液样品的红细胞的枯竭的低渗裂解过程是时间关键的步骤中，该协议的这部分预先准备所有必要的设备（ 例如，缓冲液）。
- 标号为低渗裂解1个15毫升离心管中，并为每个血液样品随后氨基苯基荧光素（APF）染色1的1.5ml样品管中。
- 如果白细胞富集将在无菌条件下进行，气流下执行此标记框。
- 制备每个样品约12mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，10毫摩尔）。根据是否白细胞应当在无菌条件下进行分离与否，通过使用从一个供应商无菌准备溶液或通过在蒸馏水中溶解的PBS片剂或制备PBS中。检测pH值，如果必要，通过使用少量的0.1M HCl以及NaOH溶液调节pH至7.4。
- 溶解的PBS片剂（参见材料的表）在200ml蒸馏水中，得到充分的一个非无菌缓冲溶液中约16个样本。如果需要的话，灭菌通过无菌过滤该溶液。
- 制备补充有钙约1ml Hanks平衡盐溶液（HBSS）2+每个样品。
- 溶解970毫克在100毫升HBSS盐（最终体积）双蒸水。填充到最终体积前，检查pH值调整到pH为7.4。由于其较低的缓冲能力，每天一个新鲜准备这个缓冲区d通过使用少量的0.1M HCl以及NaOH溶液进行pH调节特别小心。
注：无菌溶液也可以使用，这取决于实验。该溶液可通过无菌过滤进行灭菌。
- 溶解970毫克在100毫升HBSS盐（最终体积）双蒸水。填充到最终体积前，检查pH值调整到pH为7.4。由于其较低的缓冲能力，每天一个新鲜准备这个缓冲区d通过使用少量的0.1M HCl以及NaOH溶液进行pH调节特别小心。
- 除了 两个缓冲器，标签，并准备一管（ 例如50毫升离心管）或烧瓶（ 如250毫升量杯）预先用双蒸水的低渗裂解过程。准备每个样品约10毫升的水。
- 准备与用于APF染色（第3部分），这是在冰上进行碎冰的容器。
- 准备APF的等分提前，使染色过程中使用的工作方案快速制备（步骤3.2），并避免重复冻结和APF溶液中解冻。
注：APF是作为5毫克/毫升（11.81毫摩尔）储备溶液在乙酸甲酯中通常得到的。- 冻结10-100微升的等分试样在0.5ml管中。对于APF染色最后为10μM染料浓度被使用（步骤3.8）。
2.红细胞的低渗裂解
注：一个层流长椅下执行低渗裂解步骤（除了离心步骤），以避免污染。在室温下执行整个程序。作为低渗裂解是时间关键的工艺，调整水（2ml）和PBS（5毫升）加入移液器提前和启动过程之前，打开水和PBS烧瓶中。存储PBS溶液和蒸馏水在室温下在使用前。
- 由各血液试样转移100μl到适当15毫升离心管中。
注：在我们的实验血样通常含有以避免凝结10U / ml的肝素。然而，由于样品材料的不同来源的抗凝血剂的性质和浓度可能不同。其对APF染色影响应该由COMPAR测试ING结果从补充有其它类型或抗凝血剂的浓度的血液样品中获得的结果。 - 加2ml蒸馏水，并使用涡旋混合器设置为中等水平混合样品。孵育样品60秒，然后加入5毫升的PBS每个样品，并使用涡旋混合器混合。
注：最多约5个样本可以并行制备。保持样品顺序相同的添加水和PBS中达到相当的温育时间。 - 由PBS加成（步骤2.2）通过离心，在室温下6分钟，450×g下沉淀在所有样品中剩余的完整细胞等渗条件再生后。
- 通过倾入表垃圾箱中取出上清。颠倒离心管和攻丝开到纸巾中取出尽可能多的液体越好。确保该细胞沉淀是尽可能干燥。
- 像以前一样（步骤2.2）中描述重复低渗裂解过程。
ñOTE：原则上，这低渗裂解过程（步骤2.3-2.5）可以重复一次以上，这取决于混合的白细胞部分的纯度来获得。经过两次裂解步骤中所得到的混合的细胞级分剩余红细胞的份额约为25％。 - 沉淀剩余的完整细胞离心，在室温下6分钟，450×g下。除去上清液（见步骤2.4）。加入500微升HBSS向沉淀并直到获得均匀的溶液轻轻地溶解。每个样品转移到相应标记的1.5ml样品管中。
- 根据实验直接分析获得的样品（ 例如，通过流式细胞仪）25，染色，用荧光标记的抗体（单细胞类型的标识）32，与细胞刺激孵育（细胞活化实验）33或在冰上保存，并使用后来。根据这项研究的目的，立即执行对随后的实验由于粒混合白细胞部分有大约20小时的一个相当短的半衰期。
注意：这也适用于下面描述的过氧化物酶的活性染色。
3.卤化过氧化物活性染色
注：HOCl-和次溴酸生产由血液衍生血红素过氧化物酶MPO和EPO是通过使用APF，这是由称为次卤酸氧化成荧光定量。因此，如果用荧光标记抗体细胞标记与APF染色组合进行，避免用荧光素的发射信号干扰的荧光。
- 在冰上4℃下进行APF染色。
- 为了制备有源滤波器的工作溶液解冻染料的适当等分试样（ 例如，10微升，11.81毫摩尔）并用HBSS稀释至恰好为1mM（ 例如，添加108.1微升缓冲到10微升）。
- 对于每个样品（500微升细胞溶解液）准备5μ微升描述APF工作液。因此，使用APF（11.81毫摩尔），这将产生118.1微升APF工作溶液（1毫摩尔），以制备约20个样品中的一个10微升等分试样。由于移液过程中的损失准备比计算值多10％APF工作液。
- 为了检查APF染色的过氧化物酶的特异性，用血红素过氧化物酶抑制剂4-氨基苯甲酸酰肼（4- ABAH）35制备对照样品。
- 由于500μl溶剂稀释75.6毫克4- ABAH制备4- ABAH（151.17克/摩尔）在二甲基亚砜（DMSO）的1M储备溶液。进一步稀释4 ABAH 1/10 HBSS。
- 用于制备H 2 O 2的工作液标签中的两个1.5毫升离心管中分别与“70毫米H 2 O 2”和“7毫米H 2 O 2”。
- 在标有“70毫米H 2 O 2”管，新鲜稀释10微升的使用990微升蒸馏水中，得到约88毫米的浓度的 H 2 O 2的30％储备溶液（8.8毫摩尔）。储存在冰上，4小时内使用。
注：H 2 O 2通常递送作为30％原液由供应商。当储存在4℃下，它是约3年的稳定。在蒸馏水中进行的H 2 O 2稀释液，以避免分解。 的 H 2 O 2稀释液也可在0.1M NaOH溶液中制备。 - 对于确切H的决心2 O 2浓度由该解决方案到900μl，以1.5 ml管蒸馏水标记加入100微升从第一H准备再1至10稀释2 O 2原液（约88毫米） “7毫米H 2 O 2”。
- 通过使用紫外-可见photospectrometer记录在近紫外范围（ 例如，200-300 nm）的光谱，并使用吸光度在240纳米（49; 240 = 34 M -1厘米-1），以确定实际的H 2 O 2浓度在第二H 2 O 2原液34。确保该参考比色杯仅含有蒸馏水。对于测量使用石英比色皿作为在UV范围内的光谱被记录。
- 从该结果，计算两者的 H 2 O 2的储备溶液的确切浓度。通过加入蒸馏水适量调节第一原液的浓度，在“70毫的 H 2 O 2的”样品管恰好70毫米。储存在冰上将得到的工作溶液，并在一小时内使用。
- 在标有“70毫米H 2 O 2”管，新鲜稀释10微升的使用990微升蒸馏水中，得到约88毫米的浓度的 H 2 O 2的30％储备溶液（8.8毫摩尔）。储存在冰上，4小时内使用。
- 加入5微升4- ABAH工作溶液（100毫米）到适当的样品进行1mM的终浓度。在APF加入之前培养箱孵育15分钟将样品在37℃。
- 添加5微升的APF工作溶液（1毫摩尔），以每500微升样品，以获得10微米的最终染料浓度。轻轻混匀样品（ 例如，通过使用介质设置涡旋混合器），在37℃下孵育30分钟。
- 添加5微升的 H 2 O 2的工作溶液（70毫摩尔），以每500微升样品为700微米的最终浓度。轻轻地混合样品，并在37℃孵育他们60分钟。并行执行适当控制措施。
注意：控制测量结果表明，700微米的 H 2 O 2的是没有毒性的细胞。任何显著细胞反应也不进行观察。
注：APF染色也可通过省略加入的 H 2 O 2，这取决于科学问题进行的。在不存在过氧化氢 的仅基底氯化MPO和EPO活性而加入的 H 2 O 2的允许的最大次氯酸和次溴酸所生产的细胞的检测来确定。 ŧ他后者意味着一个显著更高的荧光信号。 - 用于制粒的细胞，离心样品，在室温下400×g下10分钟和。彻底除去上清液而不破坏颗粒并添加250微升HBSS以悬浮细胞。
注：该样品现在已经准备好通过流式细胞仪分析25。 - 存储在黑暗中的样品直至分析，以避免漂白。在480-490 nm激发后检测荧光素的发射约525纳米的37。
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Representative Results
如先前报道上述方法原来是既适用于人类和非人类材料32。此外如图用于与哮喘症状的小鼠将APF染色可检测的全身促炎状态的差异的合适的工具。因此，在我们使用该协议随后的研究中反复雌性黑刺鼠大鼠降植烷诱导关节炎（PIA）评估MPO（和EPO）的卤化活动。白细胞富集和该实验期间进行染色的代表性实例示于图1。在麻醉下从动物的眼球后静脉丛获得与肝素化的约200微升全血。红细胞枯竭和随后的APF染色用100微升样品体积进行。之后将样品通过流式细胞仪分析。
图1A），红细胞的一个强有力的耗尽从被取得的样品。另外不同的白细胞类型为清晰可见，其被鉴定通过施加荧光标记的细胞表面标记物（未示出）。简要地红细胞（CD235a阳性）/细胞碎片区域仅占事件的22％，而事件的大约48％被鉴定为CD16阳性嗜中性粒细胞。此外，事件的3％分别鉴定为CCR3阳性嗜酸性粒细胞和CD14阳性单核细胞和事件的大约19％，分别占CD5 / CD19阳性B和T淋巴细胞。将APF源性荧光的强度分布（ 图1B）清楚地允许过氧化物酶阴性红细胞和淋巴细胞的鉴别而单核细胞和嗜酸性粒细胞导致适度APF氧化和中性粒细胞中的ch下强烈过氧化物酶阳性OSEN实验条件。这些结果与高丰度的MPO在后者的细胞系相比，在单核细胞20中的酶浓度。的嗜酸性粒细胞的相对较弱的反应可通过以下事实来解释，即没有溴化物的溶液，其可以促使次溴酸的EPO衍生形成。孤立的嗜酸性粒细胞的初步研究出奇的没有表现出外部添加溴对这些细胞的氧化APF有很大的影响。仍然，通过观察嗜酸性粒细胞可通过引入少量的Br说明APF的氧化-通过使用（PBS和HBSS）的缓冲溶液。另外EPO也可能产生少量的次氯酸，至少在酸性条件下（ 例如，在吞噬溶酶体）。
图1： 白细胞富集和APF-派生从雌性黑刺鼠大鼠的眼球后静脉丛获得从大鼠血液显微样品d中的荧光。约200微升全血的量。申请所描述的溶血过程的至100μl血液和随后APF染色混合细胞级分后，通过流式细胞术分析。如由FSC- / SSC-图（A）中的红细胞强烈从样品耗尽和不同的白细胞类型可以很容易地分辨。薏仁衍生荧光强度（B）的分布清楚地表明血红素过氧化物酶阴性细胞（红细胞，淋巴细胞），以及白细胞中度（嗜酸性粒细胞和单核细胞）或强（中性粒细胞）卤化过氧化物酶的活性。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
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Discussion
嗜中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞的过氧化物酶阳性细胞的分离通常只着重于这些细胞，并包括由密度梯度离心38从其它白细胞嗜中性粒细胞的分离。然而，作为嗜中性粒细胞是鼠的血液样本中少得多的丰富39对后者更复杂的方法，必须使用40。而且这两种方法也导致除去从样品中的过氧化物酶阳性单核细胞的和，由于需要更大的血液体积（ 例如，400微升41），并不适用于从小型实验室动物经常血液取样过程中得到的微样品38,40。从腹膜渗出液小鼠嗜中性粒细胞的纯化还需要的动物的牺牲，而且，不产生血液衍生的粒细胞38,40。最近开发的方法来获得从小鼠BL高度纯化粒分数OOD（ 例如 ，抗体的应用）通常是昂贵的，复杂的和耗时的40,42,43，并再次只集中在一个过氧化物酶阳性白细胞类型的纯化。
因此这里提出的方法具有超过施加过氧化物酶阳性白细胞的纯化的其他方法的几个优点。因为它是基于小血样得到的细胞代表在流通的情况。由于所需的协议的小的初始样品量的方法适用于人类和非人类的血液，尽管丰度嗜中性粒细胞的物种特异性差异。事实上，我们甚至可以应用所描述的方法对初始血体积小到50微升（数据未显示）。需要该方法的小血样也使得它适用于从小型实验室动物或特殊医疗应用（ 例如，新生诊断）重复采血。为T他白细胞富集是基于红细胞的耗尽所有过氧化物酶阳性细胞（嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，单核细胞）都包含在得到的混合白细胞部分，并可以通过使用流式细胞术进行单独分析。该方法快速，可靠，具有有关化学品和仪器仪表的要求低，使得该协议适用于多种科学的环境。
嗜中性粒细胞中所描述的方法的过程中很容易地激活的一个关键步骤是使用的缓冲溶液的pH值的精确调整（PBS和HBSS，参见步骤1.2和协议部分1.3）。此外，血细胞用蒸馏水的温育时间应不超过60秒的复原normosmotic条件（见协议部分的步骤2.2之前的（几乎）完全从细胞沉淀（步骤2.4）在加入前除去溶剂水第二低渗裂解是浅黄色的另一个关键步骤尔残基会削弱低渗裂解过程的效率。另一个关键步骤是指H 2 O 2的APF染色过程中的应用。尽管所施加的量不应细胞毒性的，细胞活力应检查。在我们的研究中，我们通常适用于染料5,5'，6,6'-四氯-1,1'，3,3'- tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine碘化物（JC-1）用于检测早期凋亡事件。
此外，有一对夫妇在描述简化白细胞富集方法的局限性。而该技术可以从几个物种（人，大鼠和小鼠已试过）施加到血液样品中，红细胞的裂解之后获得的白细胞量取决于其初始丰度在血液中。后者物种39之间肯定而异，也取决于被探测个体的炎症状态。此外，虽然在裂解过程可与最多一个完成百样品中平行中间离心步骤构成限制，因为，根据使用的离心机，最多只有30个样品可以并行处理。此外，虽然APF容易检测次氯酸和次溴酸在SCN存在- ，MPO和EPO的卤化活动也影响到后者的伪卤化物。从而hypothiocyanite（ - OSCN）形成有无法氧化APF。另一个限制来自使用HOCl-的确定和次溴酸生产由MPO和EPO的APF染料的性质。作为染料被氧化成荧光素，染色不能与在同一范围内的发射光谱的荧光抗体相结合。当然将APF衍生荧光和额外的荧光信号的信号之间的任何干扰都被检查和用于在流式细胞仪补偿。
否则，如果卤化过氧化物酶活性的检测不是的范围学习，红细胞耗尽方法的应用之后，可以使用代替APF其它分析方法。如所描述的低渗裂解过程只会导致红细胞的部分耗尽和所有白细胞仍然存在于所得到的混合的细胞级分，只方法，允许应施加的单细胞分析。其中包括细胞（ 例如 ，西图分析）的裂解方法不会产生可靠的结果。小初始样品体积可以是用于这种分析方法的另一个障碍。
关于MPO（和EPO）的活性白细胞调查往往只是一般的氧化剂所生产的细胞得到解决，而不是专门评估血红素过氧化物酶的活性44,45。此外经常没有尝试进行卤化和MPO和EPO 46,47的过氧化物酶活性来区分。方法，具体解决的曲氯化MPO活动antifying次氯酸衍生产品，如chlorotyrosine不检测过氧化和/或代谢产物，因此，往往会导致真正的次氯酸生产48的低估。此外，这种方法以及次氯酸衍生-2- chloroethidium的检测也费时，需要昂贵的分析设备和包括细胞48-50。还有的裂解是有关氯化MPO活性的特异性测定新染料的许多报告在至关重要的细胞44,51,52。然而，到目前为止只APF和其相关的化合物羟基苯荧光素（HPF）是市售的，因此，在研究25,33常规使用。
事实上，通过使用APF，我们可以表明，氯化MPO活性不仅可以通过使用分离的酶53，而且通过将染料到活细胞26,33量化。因此，通过组合从以上述血液微样品快速白细胞富集ÑAPF染色我们开发的协议，这是适合于具体并同时解决所有过氧化物酶阳性白细胞， 即 ，中性粒细胞，单核细胞和嗜酸性粒细胞32 MPO和EPO的卤化活性。此外，该方法不需要细胞溶解，这允许了各种各样的分析方法，包括流式细胞仪和共聚焦荧光显微镜。此外，这种过氧化物酶活性的染色可与细胞表面标记物的应用，其允许白细胞亚级分的具体分析，根据不同的科学工作相结合。然而它已被认为是所施加的荧光标记的抗体不与用于量化HOCl-和次溴酸衍生APF氧化基于荧光素 - 荧光信号干扰。
总之这种方法提供了新的工具来更深入地了解免疫重的卤化过氧化物酶活性的生理作用东升血液衍生的过氧化物酶MPO和EPO，这仍然是不能很好地理解8,20,23。此外，在对类风湿性关节炎的动物研究中，我们可以最近观察到，该协议可以导致MPO来源的次氯酸生产的评价作为在慢性炎性疾病（未发表的数据）一个新的临床标志物。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials/Equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g., 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450 x g |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400 x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
References
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